牙本質(zhì)基質(zhì)顆粒大小及脫礦條件對其性能的影響

陳華宇 許海辰 張 宇

(齊魯醫(yī)藥學(xué)院，淄博 255000）

牙列缺損和牙列缺失是我國老年人主要口腔問題之一[1]，種植修復(fù)是目前最理想的修復(fù)方式，為滿足種植術(shù)對牙槽骨骨量的要求，可在拔牙位點(diǎn)植入骨替代材料以恢復(fù)牙槽嵴高度。天然牙經(jīng)去除牙釉質(zhì)及軟組織，對剩余牙本質(zhì)進(jìn)行脫礦處理，消除部分礦物成分以及免疫原性物質(zhì)，磨碎后得到脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料，是一種同時(shí)具備骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、骨生成能力的材料，大量實(shí)驗(yàn)研究表明其具有良好的成骨性能[2]，但對于其制備過程中不同脫礦方法和脫礦程度及顆粒大小對其性能影響的相關(guān)研究尚少。家兔與人的牙成分具有相似性[3]，由于兔牙易于獲取，故本實(shí)驗(yàn)采用兔牙代替人牙進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)探究，為牙本質(zhì)基質(zhì)材料后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 主要器材和材料

常規(guī)手術(shù)器械（手術(shù)刀、艾麗絲鉗、拔牙鉗等）；OCA 25 靜態(tài)接觸角測量儀（德國奧德利諾公司）；掃描電鏡（日立SU8020）；傅里葉變換紅外光譜儀（島津IRTracer-100）；ELS5000 電子能譜儀（美國LK）；研磨器（安薩ALA）；生理鹽水；HCL溶液；蒸餾水；新西蘭家兔。

1.2 脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料制備

將經(jīng)過預(yù)處理（去除表面軟組織，拔除牙髓，以口腔科高速手機(jī)磨除牙釉質(zhì)）的新西蘭家兔上頜門牙30 顆隨機(jī)分為A/B 兩組，每組15 顆；A組恒溫20 ℃環(huán)境下置于盛有100 ml HCL 溶液（濃度1 mol/L）的廣口瓶中脫礦45 min，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后置于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干24 h，用骨粉研磨器粉碎牙齒，選擇不同孔徑分樣篩反復(fù)篩樣4-5 次，制得3 種不同粒徑（400 μm 以下、400-800 μm、800-1200 μm） 的DDM 顆粒。B 組平均分成3 份，恒溫20℃環(huán)境下分別置于盛有100 mL 不同濃度（1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L）HCL 溶液的廣口瓶中脫礦45 min，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后置于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干24 h，骨粉研磨器粉碎牙齒，選擇粒徑400 μm 分樣篩反復(fù)篩樣4-5 次，制得粒徑400 μm 以下的自體牙本質(zhì)顆粒。

1.3 DDM 顆粒表面掃描電鏡觀察

將A 組3 種不同粒徑的DDM 顆粒分別進(jìn)行超聲清洗；使用2%戊二醛固定；50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水(無水乙醇脫水兩次)，每次10 min;臨界點(diǎn)干燥；噴金；掃描電鏡（SEM）進(jìn)行微觀形貌觀察，分析比較其差異。

1.4 DDM 顆粒靜態(tài)接觸角檢測

分別將2 μL 去離子水滴在A 組3 種不同粒徑的DDM 顆粒表面，等待3 s 至液滴穩(wěn)定后進(jìn)行靜態(tài)接觸角檢測（測試環(huán)境：溫度24.8℃；濕度68%），比較其親水性差異。

1.5 DDM 顆粒衰減全反射紅外光譜檢測

將B 組采用3 種不同濃度HCL 溶液脫礦制得的DDM 顆粒分別置于紅外光譜儀上，以4cm-1分辨率進(jìn)行衰減全反射紅外光譜檢測，掃描波長399-4000 cm-1，采樣32 次，采用OMNIC 7 軟件去除水譜，矯正基線，分析其成分差異。

1.6 DDM 顆粒鈣元素測定

對B 組采用3 種不同濃度HCL 溶液脫礦制得的DDM 顆粒分別用電子能譜儀進(jìn)行鈣元素分布（wt%）測定，為保證實(shí)驗(yàn)一致性，取每組樣本顆粒橫斷面邊緣點(diǎn)進(jìn)行測試，每組重復(fù)3 次，取其平均值，觀察各組鈣含量變化情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察結(jié)果

SEM 觀察A 組3 種不同粒徑牙本質(zhì)顆粒，隨機(jī)掃描結(jié)果顯示：粒徑400 μm 以下的DDM 顆粒呈破碎片狀，牙本質(zhì)小管暴露充分，間隙較多且形態(tài)不規(guī)則（圖1A）；粒徑400-800 μm 的DDM顆粒斷面粗糙，可見牙本質(zhì)小管，間隙較少，顆粒形態(tài)較為規(guī)整（圖1B）；粒徑800-1200 μm 的DDM 顆粒表面光滑連續(xù)，僅有少量破碎間隙存在于顆粒表面（圖1C）。

圖1 掃描電鏡結(jié)果（×1000）

2.2 靜態(tài)接觸角檢測結(jié)果

對A 組3 種不同粒徑的DDM 顆粒進(jìn)行靜態(tài)接觸角檢測以評價(jià)其親水性，結(jié)果顯示粒徑400 μm 以下、400-800 μm、800-1200 μm 的DDM顆粒靜態(tài)接觸角分別為6.0°（圖2A）、67.0°（圖2B）和96.7°（圖2C），提示DDM 顆粒的親水性隨粒徑減小而增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)果提示：粒徑400 μm 以下的DDM 顆粒植入患者創(chuàng)口后有利于血液的鋪展?jié)櫇?，為血液機(jī)化成骨提供前期保障。

圖2 靜態(tài)接觸角檢測結(jié)果

2.3 衰減全反射紅外光譜檢測結(jié)果

采用不同濃度HCL 脫礦制得的B 組3 種DDM顆粒的紅外光譜圖顯示：所有DDM 顆粒均存在（1020±20） cm-1及566 cm-1兩個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，分別為P-o 伸縮振動峰及P-o 變形振動峰，表明樣品含有大量PO42-陰離子基團(tuán)，與羥基磷灰石的紅外光譜相符，其吸收度隨脫礦所采用的HCL 濃度增加而呈現(xiàn)梯度式下降（P＜0.05），表明隨著HCL濃度增加，DDM 顆粒中羥基磷灰石的含量降低。此外，3 種DDM 顆粒在3300cm-1附近均出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)烈而寬泛的吸收峰，對應(yīng)膠原中的＞NH 和-OH，可見其吸收度差異不大（P＞0.05），提示在一定范圍內(nèi)采用不同濃度HCL 脫礦對DDM 顆粒中膠原的含量影響較?。▓D3）。

圖3 不同濃度的HCL 脫礦制得的DDM 顆粒其紅外光譜圖檢測結(jié)果

2.4 電子能譜儀測定鈣元素分布結(jié)果

對B 組的3 種牙本質(zhì)顆粒分別進(jìn)行鈣元素質(zhì)量分布（wt%）測定，結(jié)果顯示：在一定范圍內(nèi)隨著脫礦程度增加，樣品鈣含量呈現(xiàn)梯度式降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 B 組DDM 顆粒鈣元素分布測定（wt%）

3 討論

造成中老年人牙列缺損和牙列缺失的原因眾多，牙齒缺失后破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、咀嚼物理刺激的缺失、血液供應(yīng)的減少乃至中斷等因素造成了牙槽骨的吸收[4]，骨量不足對種植修復(fù)造成了相當(dāng)程度的困難。臨床上可通過植入牙本質(zhì)基質(zhì)骨替代材料以達(dá)到種植術(shù)區(qū)骨增量的目的，牙本質(zhì)基質(zhì)各組分決定了其同時(shí)具備骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨生成能力。其中，羥基磷灰石具有與人骨相似的鈣磷比以及天然孔隙結(jié)構(gòu)，能將游離的磷酸鹽與鈣附著于骨[5]，此外，羥基磷灰石能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，具備良好的骨誘導(dǎo)活性[6]。Ⅰ型膠原能夠?yàn)樾鹿巧膳c細(xì)胞附著提供載體，可與羥基磷灰石晶體一同構(gòu)成支架，以促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移。除此之外，牙本質(zhì)中還含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、表皮生長因子（EGF）以及胰島素生長因子（IGF）[2]。為提升牙本質(zhì)基質(zhì)材料的成骨性能，通常會對其進(jìn)行煅燒、冷凍、煮沸、脫礦和化學(xué)處理等[7]。目前關(guān)于脫礦牙本質(zhì)顆粒材料的相關(guān)研究眾多，但其材料制備方法并不統(tǒng)一，關(guān)于脫礦處理程度以及顆粒粒徑對脫礦牙本質(zhì)顆粒性能的影響并無定論，國內(nèi)外相關(guān)研究尚少，鑒于此，設(shè)計(jì)了本次研究。

SEM 觀察不同粒徑DDM 顆粒的表面結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：粒徑400 μm 以下的DDM 顆粒呈破碎片狀，其牙本質(zhì)小管在本實(shí)驗(yàn)制備的3 種不同粒徑顆粒中暴露最充分，間隙較多且形態(tài)不規(guī)則，此種結(jié)構(gòu)可提供更多的蛋白質(zhì)釋放通道，利于牙本質(zhì)中所含有的誘導(dǎo)成骨活性成分釋放[8]。此外，粒徑越小的牙本質(zhì)顆粒其空隙率越大，具備更大的比表面積，利于肉芽組織的長入完成機(jī)化過程，加速單骨的形成，也利于牙本質(zhì)顆粒在植入位點(diǎn)降解及新骨的長入，具備更好的骨傳導(dǎo)性能[9]。良好的親水性使得體液在植入材料表面擴(kuò)散，促進(jìn)其周圍細(xì)胞內(nèi)環(huán)境形成，更利于成骨細(xì)胞黏附以及增殖分化，對于牙本質(zhì)顆粒的生物相容性至關(guān)重要[10]。本研究通過測量不同粒徑脫礦牙本質(zhì)顆粒的靜態(tài)接觸角以評價(jià)其親水性差異，結(jié)果顯示：牙本質(zhì)顆粒隨粒徑減小，親水性逐漸增強(qiáng)，在粒徑400 μm 以下的牙本質(zhì)顆粒中靜態(tài)液滴幾乎完全鋪展開，其靜態(tài)接觸角＜6°，展現(xiàn)出優(yōu)異的親水性。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在一定范圍內(nèi)粒徑越小的DDM 顆粒或許具備更優(yōu)的成骨性能和生物相容性。

現(xiàn)有研究顯示，羥基磷灰石晶體會阻礙牙本質(zhì)材料中生長因子的釋放，導(dǎo)致其骨誘導(dǎo)性能降低或延遲表達(dá)，脫礦處理可去除部分羥基磷灰石晶體并加大牙本質(zhì)小管的管徑，利于生長因子釋放，提升成骨性能，并消除免疫原性[11-12]。過度脫礦導(dǎo)致羥基磷灰石晶體過少也會導(dǎo)致材料的機(jī)械性能下降，不利于持續(xù)穩(wěn)定的成骨[13-14]。因此在對牙本質(zhì)進(jìn)行脫礦處理時(shí)，為達(dá)到材料的最佳成骨性能，脫礦程度的控制顯得尤為重要。衰減全反射紅外光譜檢測3 種不同脫礦程度的牙本質(zhì)基質(zhì)材料，結(jié)果顯示其特征峰與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石特征峰以及膠原特征峰基本相符，表明其主要成分為羥基磷灰石以及膠原。在一定范圍內(nèi)隨著脫礦程度的增加，羥基磷灰石的特征峰吸收度越來越低，而膠原的特征吸收峰變化較小，表明在一定范圍內(nèi)隨著脫礦程度的增加，脫礦牙本質(zhì)顆粒內(nèi)羥基磷灰石的含量越來越低，而膠原成分所受影響較小。鈣元素測定實(shí)驗(yàn)也同樣支持這一結(jié)果。

脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料成骨性能的影響因素是多方面的，脫礦處理利于生長因子釋放的同時(shí)也會破壞骨誘導(dǎo)活性成分，兩者存在此消彼長的矛盾，對于何種脫礦程度能更利于生長因子釋放的同時(shí)盡可能少的影響其骨誘導(dǎo)活性，尚無定論。此外，本研究僅限于對脫礦自體牙本質(zhì)顆粒性能的實(shí)驗(yàn)室檢測，其生物體內(nèi)的成骨性能以及遠(yuǎn)期效果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：粒徑較小的DDM 材料牙本質(zhì)小管暴露更充分，且具有更優(yōu)的親水性，脫礦程度的增加會降低DDM 材料中無機(jī)物的含量，但對膠原含量影響較小。