雞馬立克氏病防控技術研究進展

蘇 帥

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

馬立克氏?。∕arek′s disease, MD）是由雞的馬立克氏病病毒（Marek′s disease virus，MDV）引起的雞的一種腫瘤性疾病，以淋巴細胞增生和腫瘤的形成為主要特征，以外周神經(jīng)、生殖腺、臟器、免疫器官中單核細胞浸潤以及由于外周神經(jīng)腫瘤細胞的集聚而引起的半癱瘓或完全癱瘓為典型特征[1]。匈牙利著名的獸醫(yī)病理學家馬立克（Joseph Marek）在1907年首先報道了該病，英國科學家Biggs在1961年倡導開始使用馬立克氏病這一名稱。

上世紀 20~30年代，隨著商品雞的死亡數(shù)目的明顯增加，人們開始逐步關注MD。1967年，Churchill等首次報道從接種病雞細胞的培養(yǎng)物中分離到了皰疹病毒。1970年，Calnek等發(fā)現(xiàn)MDV可以以一種具有感染性的游離細胞形式從羽毛囊排出，由于 MDV在雞舍環(huán)境中能夠相對穩(wěn)定存在，易感雞呼吸系統(tǒng)接觸到空氣中帶有病毒的灰塵或羽屑，都可以引起MD的自然傳播。

直到上世紀 80年代，對 MD腫瘤細胞的 T細胞特性，腫瘤誘導的成淋巴細胞樣細胞系的建立，疾病的溶細胞期和免疫抑制期的確定等研究取得了重大的科研成果。HVT與CVI988/Rispens等疫苗株的分離鑒定以及廣泛使用，更使得 MD成為第一個可以用疫苗免疫的腫瘤性疾病[2]。隨著 MDV不斷的遺傳變異，毒力不斷的增強，越來越多的疫苗也隨之被研制應用。疫苗免疫與病毒變異相互博弈，為了保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，國內(nèi)外專家學者一直聚焦MD的研究，尤其國內(nèi)專家學者在 MD的流行變異、致病性以及免疫防控取得顯著的研究進展。

1 我國雞群MDV的流行和變異現(xiàn)狀

禽病學專家將 MDV分為弱毒、強毒、超強毒和特超強毒 4種不同毒力的致病毒株，其引起家禽的腫瘤率以及死亡率逐漸增強，其中超強毒和特超強毒在沒有免疫的雞群能夠導致 3月內(nèi)全部死亡。雖然一些規(guī)?；B(yǎng)雞場的發(fā)病率稍低，但很多小型養(yǎng)雞場的發(fā)病雞群死亡率高達 20 %~ 30 %，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。最新國內(nèi)的報道已經(jīng)證實了在我國吉林、河南、廣西雞群出現(xiàn)特超強毒，尤其今年上半年，蛋雞疾病的診斷已經(jīng)顯示我國南方地區(qū)發(fā)生了一定程度的MD流行，經(jīng)過分子生物學技術和基因組學鑒定，證實是 MD超強毒[3-4]。鑒于 MD較強的空氣傳播，其在國內(nèi)的流行應該引起養(yǎng)殖業(yè)的重視。因此，我國雞群包括部分種雞群已經(jīng)呈現(xiàn)毒力增強型 MDV的流行，盡管絕大部分病毒分離株是 MDV超強毒，但是通過主要致病基因序列（meq、pp38基因）分析證實 MDV特超強毒已經(jīng)在國內(nèi)雞群出現(xiàn)。然而，對于國內(nèi) MDV特超強毒的毒力判定依然有必要進行系統(tǒng)的動物試驗比較，尤其需要關注的是 MDV參考毒株的選擇以及評價試驗環(huán)境的影響。

2 養(yǎng)禽業(yè)對于有效防控MD的迫切需求

雖然隨著疫苗的免疫，MDV的毒力呈現(xiàn)不斷增強的趨勢，但是毫無疑問疫苗免疫仍然是防治MD的最有效途徑。因此，自從MDV被分離鑒定以來，相關的疫苗也由 HVT，SB1，逐漸發(fā)展成了 CVI988/Rispens。然而，CVI988/Rispens對于特超強毒甚至超強毒是不能夠提供良好的免疫保護的，因此，研制免疫效果優(yōu)于 CVI988/Rispens的疫苗是國內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)防控 MD的迫切需求。

3 MD疫苗的應用現(xiàn)狀與研制方向

由于 MDV毒力增強導致的嚴重損失，國外在上世紀 80年代開始使用 CVI988/Rispens，這也導致國外雞群在上世紀就出現(xiàn)了 MDV特超強毒，而國內(nèi)引入CVI988/Rispens疫苗稍晚。當前臨床養(yǎng)殖主要是使用CVI988/Rispens疫苗免疫，但是由于疫苗種毒的來源以及傳代次數(shù)均有不同，臨床免疫效果也參差不齊。國內(nèi)研制的一株MDV弱毒疫苗 CVTR株已經(jīng)獲得新獸藥注冊證書，具有和CVI988/Rispens相當?shù)拿庖咝Ч?，也即將在臨床使用。世界范圍內(nèi)對于MD防控的嚴峻形勢，促使專家學者研制 MD新型疫苗。MD一直使用的是活疫苗，雖然禽病學家研制過基因工程亞單位疫苗，但是免疫效果均不理想。因此，自 HVT以來，MD均是使用的活疫苗，HVT疫苗發(fā)明人美國Witter院士通過大量的研究證實了CVI988/Rispens對于特超強毒沒有理想的免疫保護，更為重要的是利用細胞傳代致弱毒力研制 MD疫苗的傳統(tǒng)方法篩選的 10余株疫苗候選株均沒有 CVI988/Rispens的免疫效果好，因此，得出了一個重要結論，利用細胞傳代致弱毒力研制MD活疫苗的方法已經(jīng)到達MDV生物學極限，也宣告了這種傳統(tǒng)方法研制更好疫苗的希望比較迷茫[5]。利用基因工程技術研制 MD基因缺失疫苗提供了新的思路，研制的基因缺失疫苗具有良好的生物安全性和免疫效果。我國利用國內(nèi)分離株率先成功研制了 SC9-1活疫苗，其利用細菌人工染色體技術以及同源重組技術缺失掉MDV的致病基因-meq，通過多次大規(guī)模臨床試驗以及不同品系雞的評價，證實具有比 CVI988/Rispens更好的免疫效果，2019年獲得新獸藥證書，目前已經(jīng)在臨床應用[6-7]。

國內(nèi)研制的基因缺失疫苗逐步取代 CVI988/Rispens疫苗是 MD疫苗使用的發(fā)展趨勢。疫苗的使用在追求免疫效果的同時也越來越關注生物安全、重視疫苗免疫對于疾病的凈化。

4 兼具生物安全與免疫保護優(yōu)勢的新型MD疫苗

利用感染性克隆技術研制MD基因缺失疫苗具有缺失基因精準、疫苗毒株穩(wěn)定且更利用研制載體疫苗等顯著優(yōu)勢，但是基因組保留有氯霉素抗性基因，制約了MD基因缺失疫苗的出口。筆者利用細胞內(nèi)自然重組技術結合電轉化細菌內(nèi)純化篩選的基因工程技術，敲除掉MD雙基因缺失疫苗候選株中的氯霉素抗性基因，研制的MD基因缺失疫苗MDLV21株沒有抗性基因，而且其基因組具有能夠在細菌內(nèi)穩(wěn)定復制的優(yōu)勢，保證了原始種毒的免疫原性，為載體疫苗的研制提供便利條件，相關研究已經(jīng)授權國家發(fā)明專利[8]。MDLV21株活疫苗對于海蘭褐蛋雞的生長性能沒有任何影響。通過嚴格生物安全保障措施的動物試驗證實，MDLV21株活疫苗能夠對人工接種MDV超強毒的蛋雞提供完全的免疫保護，而且體重沒有降低；而人工接種 MDV超強毒的蛋雞100%發(fā)病，剖檢死亡雞可以看到明顯的腎臟、肝臟等器官腫瘤。MDLV21株活疫苗相比 CVI988/Rispens對于 MDV超強毒的免疫保護指數(shù)提高15 % 以上，免疫雞疫苗毒向外排毒的能力下降80 %，并且顯著抑制 MDV超強毒在免疫雞體內(nèi)的復制，有極大提高了疫苗的生物安全性。

HVT重組載體疫苗對于雞群傳染性法氏囊病具有理想的免疫保護效果，目前在臨床已經(jīng)較為廣泛的應用，但是其對于 MDV的免疫保護效果欠佳。國內(nèi)外還沒有有效的 I型 MDV重組載體疫苗，MDLV21株活疫苗為重組載體疫苗的研制奠定了基礎，憑借成熟的基因編輯技術大大提高了疫苗研制的成功幾率，對于雞群多種病毒病的綜合免疫防控具有重要意義。

5 MD防控的發(fā)展趨勢

疫苗接種雖然可以防止腫瘤形成和死亡發(fā)生，但并不能阻止病毒的感染復制和流行傳播，因此不但不能消滅此病，還會伴隨著 MD疫苗的使用導致MDV毒力不斷增強，甚至呈現(xiàn)每20年MDV毒力增強一個級別的現(xiàn)象[9]。然而，這種規(guī)律受限于疫苗以及檢測技術的發(fā)展。包括CVI988/Rispens在內(nèi)的各種MD疫苗其自身能在雞體內(nèi)大量復制且向外排毒，并且不能夠有效的阻止野毒的增殖，因此，形成疫苗毒與野毒大量共存的現(xiàn)象，同時由于檢測技術的限制并不能準確鑒定野毒的感染，增加免疫壓力促使病毒變異的幾率。因此，長久的MD防控措施是理想的疫苗結合精準的檢測方法，以MD的凈化為最終目標。MDV基因缺失疫苗具有理想的免疫效力，其基因缺失位點同時提供了明確的與野毒鑒別區(qū)分的靶點。其中熒光定量PCR是最具應用價值的鑒別診斷方法，不但能夠有效區(qū)分疫苗毒與野毒，而且通過對疫苗毒與野毒的精確定量，明確雞群的免疫狀態(tài)以及野毒感染的發(fā)病進程，對于有效阻止 MDV野毒的擴散以及保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要的應用價值。

MD是雞群流行的“老病”，但是新的變異毒株不斷出現(xiàn)，世界范圍內(nèi)蛋雞以及部分肉雞均需1日齡免疫 MD疫苗，隨著我國肉雞規(guī)?；B(yǎng)殖的快速發(fā)展，肉雞免疫MD疫苗也逐漸普遍。因此，MD疫苗具有廣闊的市場前景同時也面臨嚴峻挑戰(zhàn)。筆者基于我國雞MD研究現(xiàn)狀以及研究團隊最新的研究成果，對國內(nèi)外 MD的防控進行了總結，為生物制品行業(yè)提供一株具有良好效果的MD疫苗，為面對今后更強毒力的MDV提供了可行的防控思路。