甘露聚糖酶在發(fā)酵棕櫚粕中的應(yīng)用及仿生消化研究

徐智鵬， 周 迪， 陳敬幫，胡駿鵬， 張 彥， 戴晉軍*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.湖北省酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443003）

棕櫚粕是棕櫚仁壓榨后除去棕仁油的剩余物，近年來由于常規(guī)飼料原料的短缺及價(jià)格的上漲，棕櫚粕逐漸被引入我國(guó)進(jìn)行應(yīng)用（彭運(yùn)智等，2018）。棕櫚粕質(zhì)感細(xì)膩，略有巧克力氣味和酒味，因品種來源、脫殼程度、收獲期和加工工藝的不同，品質(zhì)有所差別，一般無黃曲霉素污染，粗蛋白質(zhì)15%、粗脂肪6%、粗纖維18%、水分12%、無氮浸出物50%，富含亞油酸、維生素B、維生素E以及微量元素磷、錳和鐵等（趙大鵬，2011；程時(shí)軍等，2010），適口性好，具有較高的飼用價(jià)值。棕櫚粕營(yíng)養(yǎng)豐富，且價(jià)格較便宜，但因棕櫚粕中不溶性甘露聚糖和粗纖維含量高、砂質(zhì)外觀和大量多糖結(jié)構(gòu)等使動(dòng)物對(duì)其消化利用率低（李德鵬等，2022；李袁飛等，2013）。

目前，消化利用棕櫚粕的甘露聚糖為提升棕櫚粕消化率的一種常規(guī)手段（丁曉敏，2022；樊云雪，2022；者園園，2022）。本文研究在固態(tài)發(fā)酵條件下不同甘露聚糖酶制劑對(duì)棕櫚粕中甘露聚糖作用效果的影響，探索甘露聚糖酶在發(fā)酵棕櫚粕的作用效果。同時(shí)對(duì)棕櫚粕在鴨和反芻的體外仿生消化率進(jìn)行評(píng)估，研究其對(duì)發(fā)酵棕櫚粕產(chǎn)品消化率提升方面的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 棕櫚粕原料購置于市場(chǎng)；酸性甘露聚糖酶3種，中性甘露聚糖酶3種，其他甘露聚糖酶4種等均采購于市場(chǎng)酶制劑公司，酶活單位為5萬U/g，發(fā)酵菌劑主要由酵母菌、芽孢桿菌及乳酸菌組成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)共分為四個(gè)階段，第一階段采用單因素對(duì)比研究12種甘露聚糖酶在固態(tài)發(fā)酵條件下對(duì)棕櫚粕的作用效果，篩選優(yōu)勢(shì)酶制劑。第二階段對(duì)不同酶制劑添加量作用效果進(jìn)行研究，確定最優(yōu)酶制劑添加比例。第三階段對(duì)甘露聚糖酶與微生物菌劑在固態(tài)發(fā)酵條件下共同作用對(duì)棕櫚粕的作用效果進(jìn)行研究。第四階段為不同領(lǐng)域仿生消化系統(tǒng)評(píng)估，在單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)中評(píng)估發(fā)酵棕櫚粕的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)消化利用率，研究甘露聚糖酶對(duì)發(fā)酵棕櫚粕的消化率影響。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘露聚糖酶對(duì)棕櫚粕固態(tài)發(fā)酵的影響研究以棕櫚粕為單一原料，以12種甘露聚糖酶為單一變量。發(fā)酵量為500 g干重的棕櫚粕，料水比1:0.5，酶制劑添加量為2‰，混合結(jié)束后將飼料轉(zhuǎn)入帶呼吸扣的發(fā)酵袋中發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度37℃，樣品經(jīng)烘干粉碎后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 甘露聚糖酶的添加量對(duì)棕櫚粕固態(tài)發(fā)酵的影響研究 以棕櫚粕為單一原料，以篩選出甘露聚糖酶的添加量為單一變量，添加量分別為2‰、4‰、6‰、8‰、10‰。發(fā)酵量為500 g干重的棕櫚粕，料水比1:0.5，混合結(jié)束后將飼料轉(zhuǎn)入帶呼吸扣的發(fā)酵袋中發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度37℃，樣品經(jīng)烘干粉碎后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 甘露聚糖酶在發(fā)酵棕櫚粕中的作用效果以棕櫚粕為單一原料，酶和菌劑添加量為變量。發(fā)酵量為500 g干重的棕櫚粕，料水比1:0.5，篩選出最佳酶制劑添加量，發(fā)酵菌劑按照使用推薦添加量為2‰，混合結(jié)束后將飼料轉(zhuǎn)入帶呼吸扣的發(fā)酵袋中發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度37℃，樣品經(jīng)烘干粉碎后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 發(fā)酵棕櫚粕在禽領(lǐng)域仿生消化評(píng)估 禽領(lǐng)域體外仿生消化評(píng)估試驗(yàn)裝置采用“單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)SDSIII”中的鴨臥式仿生模塊模擬消化試驗(yàn)（徐藹宣等，2022）。精確稱取棕櫚粕樣品（1±0.05）g，在42℃和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)中，樣品在單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)中完成模擬成年北京鴨的體內(nèi)消化過程，分別通過胃模擬消化和小腸模擬消化對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行酶解和洗滌，水解產(chǎn)物通過截留分子質(zhì)量為14000道爾頓的透析袋分離后，將袋內(nèi)物質(zhì)干燥，按照GB/T6435測(cè)定水分方法測(cè)定其干物質(zhì)，采用杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。通過差量法計(jì)算其干物質(zhì)消化率和蛋白質(zhì)消化率。

1.3.5 發(fā)酵棕櫚粕在反芻領(lǐng)域仿生消化評(píng)估 晨飼前，利用瘤胃液采集器采集10只日齡、體重相近的健康湖羊瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾后，等體積混勻，與緩沖液（pH=6.85）按1：2的比例配制成人工瘤胃培養(yǎng)液。體外發(fā)酵裝置采用“AGRS-Ⅲ型微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動(dòng)記錄裝置與軟件系統(tǒng)”（蔡大亮等，2022）。稱取600 mg發(fā)酵底物和相應(yīng)棕櫚粕置于140 mL厭氧發(fā)酵瓶中，各發(fā)酵瓶加入75 mL人工瘤胃培養(yǎng)液。 向發(fā)酵瓶通入二氧化碳3～5 s以排除空氣，立即蓋上幾丁質(zhì)膠塞，并旋緊亨氏旋蓋。將發(fā)酵瓶逐一與產(chǎn)氣裝置的相應(yīng)氣路通道連接，置于39℃條件下連續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖酶對(duì)棕櫚粕固態(tài)發(fā)酵的影響結(jié)果由圖1可知，在酶制劑添加量2‰的條件下，8#酶制劑可獲得的還原糖含量最高，與不添加酶制劑的棕櫚粕對(duì)照13#相比由1.9%提升到6.46%，含量增加240%。同時(shí)，還原糖占甘露聚糖的比例由4%提升到14%。確定8#酶制劑為后期棕櫚粕固態(tài)發(fā)酵用酶制劑。

圖1 不同甘露聚糖酶制劑處理棕櫚粕甘露聚糖和還原糖的含量

2.2 甘露聚糖酶的添加量對(duì)棕櫚粕固態(tài)發(fā)酵的影響結(jié)果 由圖2可知，在酶制劑添加量8‰時(shí)，8#酶制劑獲得了最高的還原糖，與不添加酶制劑的棕櫚粕對(duì)照相比由2.1%提升到9.9%，含量增加371%。同時(shí)，還原糖占甘露聚糖的比例由4%提升到21%。確定8‰為后期棕櫚粕固態(tài)發(fā)酵用酶制劑的添加量。

圖2 棕櫚粕中添加不同濃度甘露聚糖酶處理的還原糖含量

2.3 甘露聚糖酶在發(fā)酵棕櫚粕中的作用效果

2.3.1 不同組別發(fā)酵棕櫚粕初始與結(jié)束pH變化由表1發(fā)酵pH結(jié)果可知，在酶制劑添加量8‰，發(fā)酵菌劑添加2‰時(shí)可以獲得最低的pH，其中單獨(dú)添加酶制劑組的pH變化與對(duì)照組相比幾乎無差異。

表1 不同組別棕櫚粕發(fā)酵pH變化

2.3.2 不同組別發(fā)酵棕櫚粕的理化指標(biāo) 由表2結(jié)果可知，在酶制劑添加量8‰，發(fā)酵菌劑添加量2‰時(shí)可以獲得最高的粗蛋白質(zhì)，達(dá)到17.90%，產(chǎn)生的乳酸含量達(dá)到3.23%，酸溶蛋白占比達(dá)到23.25%，相比對(duì)照組有了明顯的提升。

表2 不同組別棕櫚粕發(fā)酵理化指標(biāo)變化%

2.4 發(fā)酵棕櫚粕在禽領(lǐng)域仿生消化評(píng)估 由表3可知，通過酶制劑與發(fā)酵菌劑共同作用，可以使發(fā)酵棕櫚粕的干物質(zhì)消化率從13.51%提升至25.48%。

表3 不同組別發(fā)酵棕櫚粕鴨干物質(zhì)消化率

2.5 發(fā)酵棕櫚粕在反芻領(lǐng)域仿生消化評(píng)估

2.5.1 棕櫚粕不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)氣量 由圖3可知，發(fā)酵后的棕櫚粕產(chǎn)氣總量由20%左右提升至70%左右，發(fā)酵后棕櫚粕在產(chǎn)氣總量上表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

圖3 棕櫚粕/發(fā)酵棕櫚粕體外不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)氣量

2.5.2 發(fā)酵棕櫚粕反芻消化率指標(biāo) 在奶牛仿生消化系統(tǒng)評(píng)估中測(cè)得相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)如表4所示，可以發(fā)現(xiàn)棕櫚粕與發(fā)酵棕櫚粕相比，干物質(zhì)消化率（DDM）由35.46%提升至75.75%，pH至由6.77下降至6.53，菌體蛋白（MCP）由11.26 mg/100 mL提升至17.91 mg/100 mL，氨態(tài)氮（NH3-N）由21.82 mg/100 mL提升至23.14 mg/100 mL，發(fā)酵后的棕櫚粕在反芻動(dòng)物消化率相關(guān)指標(biāo)與棕櫚粕相比均表現(xiàn)出顯著性差異。

表4 發(fā)酵棕櫚粕反芻消化率指標(biāo)

2.5.3 發(fā)酵棕櫚粕反芻揮發(fā)性脂肪酸指標(biāo) 在奶牛仿生消化系統(tǒng)評(píng)估中測(cè)得揮發(fā)性脂肪酸相關(guān)數(shù)據(jù)如表5所示，可以發(fā)現(xiàn)棕櫚粕與發(fā)酵棕櫚粕相比，揮發(fā)性脂肪酸總量由81.71 mmol/L提升至135.71 mmol/L，其中乙酸總量由48.90 mmol/L提升至91.09 mmol/L，丙酸總量由21.64 mmol/L提升至32.04 mmol/L，丁酸總量基本無明顯差異，除丁酸總量外其他均表現(xiàn)出現(xiàn)顯著性差異。

表5 發(fā)酵棕櫚粕反芻揮發(fā)性脂肪酸指標(biāo)mmol/L

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在料水比1：0.5，添加8‰酸性甘露聚糖酶，2‰發(fā)酵菌劑混合均勻后在37℃下，厭氧發(fā)酵72 h后，獲得的發(fā)酵棕櫚粕在氣味和指標(biāo)上較棕櫚粕均有明顯提升，同時(shí)在單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物仿生消化評(píng)估上均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。通過研究，確定了甘露聚糖酶在發(fā)酵棕櫚粕中的作用，也初步確定了棕櫚粕經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理后較棕櫚粕在產(chǎn)品品質(zhì)及消化率等方面的明顯提升及改善，后期還需要對(duì)該發(fā)酵棕櫚粕產(chǎn)品進(jìn)行動(dòng)物驗(yàn)證試驗(yàn)，確定發(fā)酵棕櫚粕在動(dòng)物應(yīng)用中的效果。