環(huán)境DNA技術(shù)在長(zhǎng)江口魚類多樣性分析中的應(yīng)用

王汝賢 楊 剛 耿 智 趙 峰 馮雪松 張 濤

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長(zhǎng)江口漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站, 上海 200090; 2. 上海海洋大學(xué), 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 3. 上海市崇明東灘自然保護(hù)區(qū)管理事務(wù)中心, 上海 202150)

群落屬性(如物種組成和豐富度、相對(duì)豐度、功能指標(biāo))的準(zhǔn)確評(píng)估是基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)研究和環(huán)境監(jiān)測(cè)的基本要求, 準(zhǔn)確掌握水生生物的結(jié)構(gòu)功能信息及其時(shí)空分布動(dòng)態(tài)是在典型水域(湖泊、河口和海洋等)開展生物多樣性保護(hù)的重要前提和基礎(chǔ)[1]。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵類群之一, 同時(shí)也是長(zhǎng)期影響和評(píng)估棲息地條件的良好指標(biāo), 因?yàn)樗鼈兊膲勖鄬?duì)較長(zhǎng)且具有流動(dòng)性, 對(duì)人類的干擾很敏感[2]。掌握魚類群落結(jié)構(gòu)多樣性及分布特征不僅可以對(duì)其進(jìn)行有效的保護(hù)進(jìn)而促進(jìn)水生生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)利用, 還能為評(píng)價(jià)環(huán)境污染、水上工業(yè)開發(fā)和漁業(yè)捕撈等人為干擾因素對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成的影響提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)[3]。

長(zhǎng)江口是我國(guó)魚類生物多樣性最豐富、漁產(chǎn)潛力最高的河口, 是海洋生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來源地, 許多魚類在此進(jìn)行覓食、繁衍和棲息[4]。近年來, 由于長(zhǎng)期的過度捕撈、污染排放及大規(guī)模的海洋開發(fā)活動(dòng), 對(duì)長(zhǎng)江口敏感的生態(tài)系統(tǒng)造成持續(xù)壓力, 導(dǎo)致長(zhǎng)江口水域的生態(tài)環(huán)境不斷惡化, 漁業(yè)資源呈現(xiàn)衰退趨勢(shì), 特有的珍稀水生生物瀕臨滅絕[5]。為了保護(hù)長(zhǎng)江漁業(yè)資源, 2020年1月1日起長(zhǎng)江流域332個(gè)水生生物保護(hù)區(qū)全面禁止生產(chǎn)性捕撈, 禁捕工作的開展使得獲取漁業(yè)資源數(shù)據(jù)愈發(fā)困難。同時(shí), 生物多樣性調(diào)查是一項(xiàng)繁重的長(zhǎng)期任務(wù), 其每年都存在一定的變化, 以往的傳統(tǒng)調(diào)查數(shù)據(jù)已無法滿足當(dāng)前的研究[6]。因此, 我們迫切需要一種通用的方法, 它能夠在空間和時(shí)間上對(duì)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。

環(huán)境DNA(eDNA)指生物體遺留在周圍環(huán)境中的遺傳物質(zhì), 可以是多種來源的線粒體或核DNA,包括脫落的腸道和皮膚細(xì)胞、尿液、黏液、卵子或精子等, 它允許我們?cè)诓恢苯佑^察或捕獲整個(gè)生物體的情況下檢測(cè)物種的存在或最近的存在[7]。eDNA技術(shù)最近被認(rèn)為是一種非常有效的、非破壞性的方法, 常用于監(jiān)測(cè)水生生態(tài)系統(tǒng)中物種和群落的時(shí)空分布[8]。各種技術(shù)如常規(guī)PCR(PCR)、定量PCR(qPCR)和數(shù)字液滴PCR(ddPCR)等方法均已被用于檢測(cè)河流、湖泊、水庫和海洋中的環(huán)境DNA[9—11]。eDNA技術(shù)的發(fā)展將促進(jìn)更低成本、非侵入性的魚類監(jiān)測(cè)[12]。與之相比傳統(tǒng)的魚類監(jiān)測(cè)方法(電捕魚、刺網(wǎng)和聲學(xué)調(diào)查等)可能存在形態(tài)識(shí)別、檢測(cè)概率低等問題使得無法充分準(zhǔn)確地提供理想信息[13]。

目前, eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口魚類多樣性調(diào)查中已有初步應(yīng)用。Zhang等[14]2018年首次在長(zhǎng)江口及其鄰近水域利用環(huán)境DNA技術(shù)進(jìn)行漁業(yè)科學(xué)研究的嘗試, 在春、夏和秋3個(gè)季節(jié)分別鑒定出18、12和33種魚類, 得出魚類群落結(jié)構(gòu)在不同季節(jié)存在顯著差異。Jia等[15]在2019年同樣利用eDNA技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江口魚類資源進(jìn)行了季節(jié)變化分析, 其在春、夏、秋和冬4個(gè)季節(jié)分別鑒定出20、16、5和45種魚類, 四季魚類種類組成差異較大。然而, 這兩項(xiàng)研究均只采用了單一的eDNA技術(shù)進(jìn)行調(diào)查, 為了更加準(zhǔn)確地探討eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口水域的應(yīng)用前景, 本研究將eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)底拖網(wǎng)調(diào)查方法結(jié)合, 通過對(duì)兩種調(diào)查方法結(jié)果的比較, 以期對(duì)eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口水域的適用情況做出的準(zhǔn)確的評(píng)價(jià), 為進(jìn)一步完善長(zhǎng)江口水域生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能信息及為該水域的生態(tài)修復(fù)工作提供有效幫助。

1 材料與方法

1.1 環(huán)境樣品采集

本實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)江口及其鄰近海域設(shè)置采樣站點(diǎn)(圖 1), 于2021年5月22—27日進(jìn)行水樣采集, 在水樣采集的同時(shí)進(jìn)行底拖網(wǎng)調(diào)查。調(diào)查網(wǎng)具為單船底拖網(wǎng), 網(wǎng)口周長(zhǎng)50 m, 最小網(wǎng)目尺寸30 mm, 船速3 kn, 拖網(wǎng)時(shí)長(zhǎng)1h。eDNA樣品采集時(shí), 每個(gè)站點(diǎn)使用1000 mL的采樣瓶重復(fù)采集3瓶表層水樣品。采用0.45 μm的混合纖維素濾膜現(xiàn)場(chǎng)對(duì)水樣進(jìn)行真空抽濾, 在12h內(nèi)完成抽濾, 最大程度降低水樣中環(huán)境DNA的降解。若水樣較為渾濁時(shí), 可進(jìn)行二次過濾來提高eDNA富集程度, 先采用1 μm孔徑的濾膜進(jìn)行初次過濾, 然后再用0.45 μm孔徑的濾膜再過濾一次[16]。在每份樣品過濾后, 將濾膜保存在2.0 mL的無菌離心管中, 置于-20℃冰箱冷凍保存, 每次抽濾前需對(duì)濾膜接觸面沖洗, 避免不同站點(diǎn)間eDNA的交叉污染。若現(xiàn)場(chǎng)抽濾水樣可能對(duì)樣品造成污染, 可向水樣中加入醋酸鈉來緩解DNA降解, 盡快將水樣帶回實(shí)驗(yàn)室抽濾。濾膜經(jīng)干冰凍存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后, 采用DNeasy Blood & Tissue Kit劑盒(Qiagen, 69506)并參照說明書對(duì)濾膜上的DNA進(jìn)行提取。為防止空氣中外源DNA對(duì)樣品造成污染, 所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。所得總DNA經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并采用紫外分光光度計(jì)定量,最后將提取的DNA樣品置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 長(zhǎng)江口水域采樣站Fig. 1 Water sampling station in Yangtze River Estuary

1.2 目的基因擴(kuò)增與高通量測(cè)序

采用魚類通用引物MiFish-U-F: 5′-GTCGGTA AAACTCGTGCCAGC-3′和 MiFish-U-R: 5′-CATA GTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3′[17]對(duì)環(huán)境DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 該引物擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?2S rDNA,擴(kuò)增后的DNA序列長(zhǎng)度約為163—185 bp。PCR擴(kuò)增總體系為25 μL, 其中包括: DNA模板10 ng、正反引物(5 μmol/L)各0.5 μL、2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)、5×緩沖液4 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性10min, 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 最后72℃延伸10min, 反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30。擴(kuò)增完成后, 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收樣品, 然后在Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)(Illumina,美國(guó))上進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將PCR擴(kuò)增后并經(jīng)高通量測(cè)序的序列采用DADA2方法進(jìn)行初步處理, 包括: 去除引物、質(zhì)量過濾、拼接和去除嵌合體等, 剩余序列經(jīng)QIIME2軟件按照≥97%進(jìn)行聚類, 聚類結(jié)果稱為操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)。采用Brocc注釋算法[18]對(duì)獲得的OTUs序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋, 注釋結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)手動(dòng)去除非魚類信息,篩選出比對(duì)至魚類且identity值≥97%,E-value≤10-5的OTU, 將鑒定結(jié)果為同一物種的OTU進(jìn)行合并, 無法比對(duì)至種的OTU則向上一級(jí)如屬、科進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì), 并得到相應(yīng)的OTU豐度表。再運(yùn)用QIIME2軟件對(duì)去除singleton后的特征表進(jìn)行統(tǒng)計(jì),實(shí)現(xiàn)各樣本在門、綱、目、科、屬、種六個(gè)分類水平上的組成分布的可視化, 展示不同分類單元的序列豐度及種類數(shù)。本研究還通過QIIME2軟件對(duì)樣本序列量進(jìn)行分析, 計(jì)算相關(guān)的Alpha多樣性指數(shù), 如Chao1指數(shù)、Observed_species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等, 以此綜合評(píng)價(jià)各站點(diǎn)間魚類豐富度及多樣性。

2 結(jié)果

2.1 物種組成

18站點(diǎn)環(huán)境樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后共獲得7117247條原始序列, 經(jīng)去噪、拼接和去除嵌合體后剩余6501632條高質(zhì)量序列, 按照97%相似性聚類后得到1599個(gè)代表性O(shè)TU序列。經(jīng)MitoFish、NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)和注釋, 共在18個(gè)站點(diǎn)54個(gè)水樣中鑒定出55種魚類, 手動(dòng)篩選并刪除非長(zhǎng)江口魚類后, 剩余45種長(zhǎng)江口魚類, 隸屬于10目21科41屬[4]。在目級(jí)水平比較中, 鱸形目(Perciformes)種類最多,總計(jì)17種, 約占檢測(cè)魚類總數(shù)的37.8%; 其次是鯉形目(Cypriniformes)12種, 約占26.7%; 而仙女魚目(Aulopiformes)、燈籠魚目(Myctophiformes)、鲉形目(Scorpaeniformes)和巨口魚目(Stomiiformes)檢測(cè)到的種類最少, 各種均僅有1種(表 1)。

表1 基于eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口18站點(diǎn)檢測(cè)到的魚類物種表Tab. 1 List of fish species detected at 18stations in the Yangtze Estuary based on eDNA Technology

基于各采樣點(diǎn)eDNA擴(kuò)增后的序列豐度, 圖 2展示了豐度前10位的優(yōu)勢(shì)魚類物種, 分別為中國(guó)花鱸(Lateolabrax maculatus)、刀鱭(Coilia nasus)、鳳鱭(Coilia mystus)、蒙古鲌(Chanodichthys mongolicus)、日本鳀(Engraulis japonicus)、小黃魚(Larimichthys polyactis)、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)、青魚(Mylopharyngodon piceus)、尖頭鱥(Phoxinus oxycephalus)和睛尾蝌蚪蝦虎魚(Lophiogobius ocellicauda)。其中, 中國(guó)花鱸(L. mactus)、刀鱭(C. nasus)和鳳鱭(C. mystus)在所有站點(diǎn)中均檢測(cè)到。

圖2 各站點(diǎn)優(yōu)勢(shì)魚類物種組成Fig. 2 Composition of dominant fish species at each site

2.2 魚類物種多樣性分析

生態(tài)學(xué)家通常使用Alpha多樣性指數(shù)來表征物種在生境內(nèi)的多樣性, 以Chao1[19]和Observed_species指數(shù)表征組間豐富度, 以Shannon[20]和Simpson[21]指數(shù)表征組間多樣性。本研究通過分析上述指數(shù),綜合評(píng)價(jià)各采樣點(diǎn)間魚類豐富度及多樣性關(guān)系。表 2反映魚類群落多樣性的Alpha多樣性指數(shù)。其中, Chao1指數(shù)的平均值為119.69(變幅為84.00—192.43), Observed_species指數(shù)的平均值為90.28(變幅為57.50—137.9), 兩個(gè)指數(shù)分布趨勢(shì)基本一致; Simpson指數(shù)平均值為0.7369(變幅為0.4580—0.8725), Shannon指數(shù)平均值為2.98(變幅為 1.79—3.71), 兩者分布趨勢(shì)也基本對(duì)應(yīng), 但不同采樣點(diǎn)間仍有一定差異。

表2 長(zhǎng)江口水域魚類物種相對(duì)豐度的Alpha多樣性指數(shù)Tab. 2 Alpha diversity index of fish species relative abundance in the Yangtze River Estuary

使用R軟件將Chao1指數(shù)與Observed_species指數(shù)分別繪制成差異檢驗(yàn)箱線圖(圖 3), 其P值分別為0.099和0.105, 均大于0.05, 表明各站點(diǎn)間魚類豐富度之間無顯著性差異; 將Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)分別繪制成差異檢驗(yàn)箱線圖(圖 4), 其P值分別為0.01和0.028, 均小于0.05, 表明各站點(diǎn)間魚類多樣性之間存在顯著性差異。

圖4 18站點(diǎn)間魚類多樣性Fig. 4 18 inter site fish diversity

利用R軟件繪制前20種魚類豐度的物種組成熱圖(圖 5), 不同站點(diǎn)間魚類物種組成存在差異。從樣本聚類上看, 地理上S3和S4站點(diǎn)最先聚在一起,兩個(gè)采樣點(diǎn)分別位于崇明島南北側(cè), 均位于長(zhǎng)江口內(nèi)側(cè), 生境條件較為相似; 而與S3和S4物種組成差異最大的為站點(diǎn)S15, 兩者地理差異較遠(yuǎn), 生境差異較大。從物種聚類上看, 棘頭梅童魚(Collichthys lucidus)和大黃魚(Larimichthys crocea)最先聚在一起,除在S15有較高的相對(duì)豐度, 在其余站點(diǎn)的相對(duì)豐度均較低。此外, 刀鱭(C. nasus)和鳳鱭(C. mystus)聚類程度較高, 并且其相對(duì)豐度和分布頻率最高。

圖5 長(zhǎng)江口水域?qū)偎紧~類組成熱圖Fig. 5 Heat map of fish composition in the Yangtze River Estuary

2.3 環(huán)境DNA技術(shù)與底拖網(wǎng)法比較

本次底拖網(wǎng)調(diào)查共捕獲33種魚類, 隸屬于11目16科29屬, 其中以鱸形目(Perciformes)數(shù)量最多, 共計(jì)11種, 約占檢測(cè)數(shù)量的33%; 其次是鯉形目(Cypriniformes), 共計(jì)5種, 約占檢測(cè)數(shù)量的15%, 底拖網(wǎng)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)目與eDNA檢測(cè)結(jié)果相同。環(huán)境DNA方法與底拖網(wǎng)方法共獲得13目26科54屬60種魚類,在eDNA檢測(cè)結(jié)果中的燈籠魚目(Myctophiformes)和巨口魚目(Stomiiformes)兩個(gè)目的魚類在拖網(wǎng)中未能檢測(cè)到; 底拖網(wǎng)檢測(cè)中的鮭形目(Salmoniformes)、胡瓜魚目(Osmeriformes)和鲀形目(Tetraodontiformes)的各種魚類在eDNA中均未檢測(cè)到(表 3)。

表3 基于eDNA技術(shù)與底拖網(wǎng)法的魚類物種數(shù)比較表Tab. 3 Comparison of fish species based on eDNA technology and bottom trawl method

eDNA和底拖網(wǎng)法共檢測(cè)到60種魚類, 其中有18種魚類是在兩種方法中均檢測(cè)到的,占魚類總數(shù)的30%, 剩余魚類分別占總數(shù)的45%和25%(圖 6)。兩種方法均檢測(cè)到的魚類分別為長(zhǎng)吻(Leiocassis longirostris)、刀鱭(C.nasus)、鳳鱭(C.mystus)、銀鯧(Pampus argenteus)、似鳊(Pseudobrama simoni)、窄體舌鰨(Cynoglossus gracilis)、焦氏舌鰨(Cynoglossus joyneri)、髭縞蝦虎魚(Tridentiger barbatus)、孔蝦虎魚(Trypauchen vagina)、小眼綠鰭魚(Chelidonichthys spinosus)、龍頭魚(Harpadon nehereus)、小黃魚(L.polyactis)、翹嘴鲌(Culter alburnus)、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)、黃鯽(Setipinna taty)、棘頭梅童魚(C.lucidus)、日本帶魚(Trichiurus japonicus)和海鰻(Muraenesox cinereus)?？梢奺DNA技術(shù)在檢測(cè)魚類數(shù)量上優(yōu)于底拖網(wǎng)法。

圖6 eDNA技術(shù)與底拖網(wǎng)法獲得魚類總數(shù)比較Fig. 6 Comparison of total fish number obtained by eDNA technology and bottom trawl method

兩種方法進(jìn)行α多樣性比較時(shí), 底拖網(wǎng)18個(gè)站點(diǎn)的平均Simpson指數(shù)為0.51, 而eDNA技術(shù)測(cè)定的平均Simpson指數(shù)為0.74, eDNA技術(shù)的Simpson指數(shù)顯著大于底拖網(wǎng)方法(P＜0.001); 底拖網(wǎng)8個(gè)站點(diǎn)的平均Shannon指數(shù)為1.44, eDNA 技術(shù)的平均Shannon指數(shù)為2.98, eDNA技術(shù)的Shannon指數(shù)顯著大于底拖網(wǎng)方法(P＜0.01; 圖 7)。兩種指數(shù)均表示eDNA技術(shù)所檢測(cè)的長(zhǎng)江河口魚類群落α多樣性顯著大于底拖網(wǎng)方法。

圖7 基于Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)的長(zhǎng)江口魚類α多樣性Fig. 7 Fish in the Yangtze Estuary based on Simpson index and Shannon index α Diversity

3 討論

3.1 基于環(huán)境DNA的長(zhǎng)江口魚類物種組成

長(zhǎng)江口作為我國(guó)最大的河口[22], 近年來由于多種人為因素, 使得其漁業(yè)資源銳減, 自2020年1月1日起長(zhǎng)江流域332個(gè)水生生物保護(hù)區(qū)全面禁止生產(chǎn)性捕撈, 同時(shí)對(duì)部分特定物種進(jìn)行增殖放流來恢復(fù)其野外種群數(shù)量[23]。通過傳統(tǒng)資源調(diào)查方法難以準(zhǔn)確評(píng)估長(zhǎng)江口漁業(yè)資源恢復(fù)情況, 因此本研究采用環(huán)境DNA技術(shù)來分析長(zhǎng)江口魚類組成及多樣性。通過對(duì)長(zhǎng)江口18站點(diǎn)水樣環(huán)境DNA的提取、擴(kuò)增和高通量測(cè)序, 共檢測(cè)出55種魚類, 其中包括45種長(zhǎng)江口魚類, 以及10種非長(zhǎng)江口魚類, 非長(zhǎng)江口魚類分別為點(diǎn)籃子魚(Siganus guttatus)、名古屋吻蝦虎魚(Rhinogobius nagoyae)、斯丹氏鱥(Phoxinus steindachneri)、短體副鰍(Homatula potanini)、腹翼鯖(Gasterochisma melampus)、刀鲬(Platycephalus cultellatus)、多鱗白甲魚(Onychostoma macro-lepis)、尼氏裸燈魚(Gymnoscopelus nicholsi)、革首南極魚(Notothenia coriiceps)和裘氏鱷頭冰魚(Champsocephalus gunnari)。檢測(cè)出非長(zhǎng)江口魚類可能有三種原因: (1)因?yàn)樵诂F(xiàn)場(chǎng)過濾水樣, 船艙空氣中懸浮顆粒含有上述魚類DNA污染了濾膜; (2)部分采樣地點(diǎn)靠近航道附近, 過往船只排出的水體中也可能含有上述魚類DNA; (3)長(zhǎng)江口是西太平洋沿岸最大的候鳥驛站, 鳥類遷徙時(shí)排出的糞便中也可能含有上述魚類DNA。

eDNA技術(shù)檢測(cè)到的45種長(zhǎng)江口魚類隸屬于10目21科41屬, 在所有檢測(cè)到的魚類物種中, 中國(guó)花鱸(L. mactus)、刀鱭(C. nasus)和鳳鱭(C. mystus)的相對(duì)序列豐度最高, 其次是長(zhǎng)吻(L.longirostris)和蒙古鲌(C.mongolicus)等。所得序列中還檢測(cè)出部分長(zhǎng)江口水域相對(duì)豐度較少的魚類物種, 包括中國(guó)(Sillago sinica)和細(xì)條銀口天竺鯛(Jaydia lineata)等。此外本次調(diào)查中eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口部分站點(diǎn)檢測(cè)到了尖頭鱥(P. oxycephalus)的存在, 尖頭鱥是山區(qū)溪流型魚類, 在江蘇、浙江、太湖等部分水域有所分布[24], 目前未在長(zhǎng)江口水域發(fā)現(xiàn)其存在, 但含有其DNA的水體可能隨長(zhǎng)江流至河口, 因?yàn)閑DNA可以在水體中維持幾天到幾周的時(shí)間, 但在許多情況下維持時(shí)間未超過一個(gè)月[25], 在長(zhǎng)江口近岸水域可能檢測(cè)到其存在。其次也可能因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)采用的是魚類通用引物, 在對(duì)鱥屬魚類準(zhǔn)確性檢測(cè)上存在一定的誤差。

3.2 基于環(huán)境DNA的長(zhǎng)江口魚類多樣性分析

表2列舉了反映魚類群落豐富度及多樣性的Alpha指數(shù)。其中, Chao1和Observed_species指數(shù)用于表示魚類豐富度。本研究中Chao1指數(shù)為84.00—192.43, Observed_species指數(shù)為57.50—137.9, 兩個(gè)指數(shù)分布趨勢(shì)基本一致。其中S9站點(diǎn)兩者指數(shù)值均最高, 表明該站點(diǎn)魚類群落豐富度最高, S1站點(diǎn)兩者指數(shù)值最低, 表明該站點(diǎn)魚類群落豐富度最低。這可能與兩者的地理位置相關(guān), S9站點(diǎn)位于崇明島與橫沙島之間, 處在長(zhǎng)江口外側(cè), 受漲落潮影響, 不同的生境的魚類在這里覓食, 而S1站點(diǎn)位于長(zhǎng)江口最內(nèi)側(cè), 即使?jié)q潮魚類涌入口內(nèi), 也只有極少的魚進(jìn)入最內(nèi)側(cè), 致使該點(diǎn)魚類豐富度最低。但是, 高通量測(cè)序無法直觀反映環(huán)境中的具體生物量,僅通過擴(kuò)增序列的相對(duì)數(shù)量來展示樣品間豐度是否存在差異。目前, 已有相關(guān)研究采用熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對(duì)水環(huán)境中物種的生物量進(jìn)行估算。例如Takahara等[26]率先利用eDNA技術(shù)進(jìn)行物種生物量評(píng)估, 以鯉為檢測(cè)目標(biāo), 成功得出eDNA濃度與鯉生物量之間呈正相關(guān), 可以將eDNA 技術(shù)用于野外條件下生物量估算。Evans等[27]測(cè)定了野外9種生物(包括 8種淡水魚類和1種兩棲動(dòng)物)的6個(gè)線粒體基因片段序列, 發(fā)現(xiàn)序列拷貝數(shù)與上述生物的豐度存在正相關(guān)關(guān)系。但是, 采用eDNA技術(shù)進(jìn)行生物量評(píng)估仍具有一定的挑戰(zhàn)性, 影響eDNA 釋放和降解的因素有很多(溫度、光照和抑制劑等), 并且這些因素造成eDNA降解的速率各不相同, 需要進(jìn)一步探究這些因素間的相關(guān)性, 從而使生物量評(píng)估結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

Alpha多樣性指數(shù)中的Shannon和Simpson指數(shù)均能顯示魚類多樣性水平, 本研究中的Simpson指數(shù)為0.4580—0.8725, Shannon指數(shù)為1.79—3.71, 兩者分布趨勢(shì)也基本相同。采用R軟件對(duì)所有站點(diǎn)魚類多樣性進(jìn)行分析, 結(jié)果表明18站點(diǎn)間魚類多樣性之間存在顯著差異。此外本次調(diào)查結(jié)果Shannon和Simpson指數(shù)與Chao1和Observed_species指數(shù)均未出現(xiàn)極值,表明本次實(shí)驗(yàn)采樣步驟及環(huán)境DNA提取方法較為可靠, 未對(duì)環(huán)境DNA樣品造成較大影響。單次采樣結(jié)果可能無法準(zhǔn)確描述長(zhǎng)江口魚類多樣性, Zhang等[14]及Jia等[15]在2018年與2019利用eDNA技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江口魚類資源進(jìn)行季節(jié)變化分析時(shí), 發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)間的魚類多樣性均存在顯著性差異。本研究后續(xù)將繼續(xù)在不同季節(jié)進(jìn)行采樣, 分析長(zhǎng)江口魚類多樣性的季節(jié)性變化, 綜合評(píng)價(jià)長(zhǎng)江口的魚類多樣性。

3.3 基于兩種不同采樣方法的結(jié)果分析

有研究表明, 在水生生態(tài)系統(tǒng)中, eDNA技術(shù)檢測(cè)到的物種數(shù)量等于或大于傳統(tǒng)方法檢測(cè)到的物種數(shù)量[28,29]。本研究采用eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口18站點(diǎn)中檢測(cè)到10目21科41屬45種魚類, 底拖網(wǎng)法共鑒定出11目16科29屬33種。兩種方法總共鑒定出60種長(zhǎng)江口魚類, 均以鱸形目(Perciformes)最多, 其次是鯉形目(Cypriniformes), 其中有18種魚類是在環(huán)境DNA與底拖網(wǎng)中都檢測(cè)到的, 占魚類總數(shù)的30%, 環(huán)境DNA技術(shù)與底拖網(wǎng)法中剩余魚類分別占總數(shù)的45%和25%。底拖網(wǎng)中有15種魚類在環(huán)境DNA中未鑒定出的, 這可能與使用的引物有關(guān), Mi-Fish引物設(shè)計(jì)的原始實(shí)驗(yàn)協(xié)議是使用來自日本沖繩縣水族館四個(gè)水族箱的海水樣本, 其對(duì)海洋魚類的分類具有顯著效果。雖然Zhang等[14]、Zou等[30]和Ahn等[31]將eDNA技術(shù)用于河口生態(tài)均取得了一定的效果, 但長(zhǎng)江口水域還棲息著中華鱘(Acipenser sinensis)、淞江鱸(Trachidermis fasciatus)和胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus) 等諸多珍稀瀕危物種, 在此次調(diào)查中均未檢測(cè)出。因?yàn)樵跀?shù)據(jù)分析時(shí)為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性, 在三個(gè)平行樣本中只有當(dāng)一個(gè)物種至少在兩個(gè)樣本的PCR中擴(kuò)增并檢測(cè)出來才被確定存在, 僅存在一個(gè)PCR重復(fù)的物種則被剔除[32],所以eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口珍稀瀕危物種的檢測(cè)方面有待考究。后續(xù)將采用MiFish引物對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增來驗(yàn)證其在長(zhǎng)江口水域魚類序列擴(kuò)增的通用性。此外在密切相關(guān)的同源物種之間缺乏Mi-Fish序列(MiFish引物干擾的高變區(qū))的變異, 這不可避免地會(huì)導(dǎo)致對(duì)物種豐富度的檢測(cè)的降低[33]。同時(shí), Miya等[17]指出, 在eDNA技術(shù)可能成為魚類生物多樣性研究的主流技術(shù)之前, 其中一個(gè)必須要解決的問題是參考序列數(shù)據(jù)庫的完整性和準(zhǔn)確性, 全球水生環(huán)境中已知的魚類有32000多種, 存在巨大的差異性, 目前數(shù)據(jù)庫的完整性和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意[34]。目前, 長(zhǎng)江口魚類序列比對(duì)需在MitoFish、NCBI等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行, 其對(duì)長(zhǎng)江口部分特有物種鑒定可能存在差異, 建立長(zhǎng)江口魚類鑒定數(shù)據(jù)庫也是目前亟需完成的任務(wù), 使得在長(zhǎng)江口魚類鑒定時(shí)有據(jù)可依。雖然本研究的eDNA結(jié)果并不能包含所有底拖網(wǎng)法鑒定出的魚類, 但不可否認(rèn)eDNA技術(shù)是檢測(cè)沿海水域魚類系統(tǒng)的有力工具。

4 總結(jié)

eDNA技術(shù)在監(jiān)測(cè)魚類生物多樣性方面簡(jiǎn)便快捷, 相比于傳統(tǒng)資源調(diào)查方法的耗時(shí)費(fèi)力, eDNA技術(shù)在魚類生物多樣性監(jiān)測(cè)及保護(hù)中有巨大應(yīng)用潛力。本研究利用eDNA技術(shù)和底拖網(wǎng)法對(duì)長(zhǎng)江口魚類多樣性進(jìn)行了調(diào)查, 兩種方法在所有采樣點(diǎn)共檢測(cè)到60種魚類, 其中eDNA技術(shù)檢測(cè)到45種, 底拖網(wǎng)法檢測(cè)到33種, 與底拖網(wǎng)法相比, eDNA技術(shù)可以檢測(cè)到更多的魚類。盡管環(huán)境DNA技術(shù)無法完全替代傳統(tǒng)的魚類調(diào)查方法, 但可以作為傳統(tǒng)調(diào)查方法的一種助力, 采用環(huán)境DNA技術(shù)可減少傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)對(duì)長(zhǎng)江口生態(tài)系統(tǒng)的干擾, 縮短調(diào)查周期, 將兩者結(jié)合觀察又可快速準(zhǔn)確地反映長(zhǎng)江口魚類多樣性及其空間分布。這些研究結(jié)果拓展了外界對(duì)長(zhǎng)江口水域生物多樣性的認(rèn)識(shí), 為長(zhǎng)江口魚類多樣性的管理和保護(hù)提供了新的重要數(shù)據(jù)。此外, eDNA技術(shù)在長(zhǎng)江口魚類組成的季節(jié)性變化監(jiān)測(cè)中具有很大的潛力, 繼續(xù)開展調(diào)查有利于該地區(qū)的海洋資源保護(hù)、漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展、水產(chǎn)品加工和社會(huì)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定等。盡管eDNA技術(shù)存在一定的局限性, 特別是在定量方面, 但將eDNA技術(shù)應(yīng)用于海岸帶魚類群落的多樣性評(píng)估及季節(jié)性變化研究可能是海洋生物多樣性長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的重要途徑。