基于SPME結合GC-MS法測定霉變煙葉中揮發(fā)性成分的研究

莫 崢，楊麗莉，周 鵬，黃綱臨，徐 勇，王勇軍，周 萍，李 萌

(紅云紅河煙草(集團)有限責任公司，云南昆明 650231)

煙葉在儲存過程中受微生物、溫度和濕度等影響極易發(fā)生霉變。煙葉霉變使其色澤變暗，香氣遺失，吃味變差，刺激性增大，使用價值降低甚至喪失，給煙草加工企業(yè)造成經濟損失[1]，早期煙葉霉變的快速識別已成為煙草行業(yè)亟待解決的關鍵問題。目前霉變煙葉的研究多集中于煙葉霉變原因探索和預防措施開發(fā)，如改變環(huán)境溫濕度，使霉菌不宜生長等[2-3]，以及研究煙葉霉變微生物[4-6]。但由于煙葉儲存堆碼的原因，即使控制倉儲環(huán)境的溫濕度，小部分煙葉仍會霉變。煙葉霉變過程中使其揮發(fā)性代謝產物(MVOCs)發(fā)生變化，因此可通過監(jiān)測煙葉霉變的揮發(fā)性代謝產物來判斷煙葉霉變情況。研究顯示，采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜(HS-SPME-GC-MS)方法檢測揮發(fā)性代謝產物是一種較為理想的技術[7]。此技術在預測煙葉霉變報道甚少[8]，但在其他行業(yè)已有應用報道。在玉米霉變研究中采用揮發(fā)性成分作為霉變標記物已有報道[4，9]。在谷物霉變研究中已有報道，谷物在儲藏過程中醇類[10]、酯類[11]、酮類[12]、醛類[13-14]、脂肪酸[11]等物質的變化可能導致谷物發(fā)生霉變或劣變，對谷物品質產生嚴重影響。因此，測定煙葉霉變前后揮發(fā)性成分測定和篩查具有重要意義，可實現(xiàn)煙葉早期霉變的篩查，對煙葉霉變的提前預測和實時監(jiān)控提供一種技術措施。該研究采用SPME結合GC-MS技術測定煙葉霉變特征標記物，建立煙葉霉變揮發(fā)性成分的測定方法，以期為霉變煙葉的識別及有效預防提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試材由云南中煙煙葉倉儲庫中隨機抽取4份煙葉(包括2份K326和2份紅花大金元煙葉，即K326 1#、K326 2#、紅大1#、紅大2#)，將各煙葉平均分為2份，其中一份用于后續(xù)模擬霉病試驗，一份自然醇化，共計8份。

1.2 儀器與試劑7890B-5975B氣相-質譜聯(lián)用儀，美國安捷倫(Agilent)科技有限公司；HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫(Agilent)科技有限公司；AB-204電子分析天平，美國梅特勒(Mettler)公司；固相微萃取手柄，美國Supelco公司；75 μm Carboxen-PDMS固相萃取頭(黑頭)、85 μm PDMS/DVB固相萃取頭(白頭)、100 μm PDMS固相萃取頭(紅頭)、7 μm PDMS固相萃取頭(綠頭)、65 μm PDMS/DVB固相萃取頭(藍頭)、30 μm PDMS/DVB固相萃取頭(黃頭)，美國Supelco公司；22 mL頂空瓶，美國安捷倫(Agilent)科技有限公司；LIDA加熱攪拌臺，廣東科力達儀器有限公司；LHS恒溫恒濕箱，上海一恒科技有限公司；萘，99%，美國百靈威科技有限公司；乙醇，色譜純，美國迪馬公司。萘內標溶液：取0.100 g萘用乙醇自主配制成濃度為100 μg/mL的內標溶液。

1.3 GC-MS條件

1.3.1氣相色譜條件。進樣口溫度280 ℃，載氣為He，流速為1 mL/min；升溫程序：初始溫度50 ℃(保持2 min)，以5 ℃/min升溫至140 ℃(保持1 min)，再以10 ℃/min升溫至280 ℃(保持1 min)。

1.3.2質譜條件。離子源為EI源，電子能量為70 eV，質量掃描范圍為35～350 amu。

1.4 數(shù)據檢索采集的質譜數(shù)據經NIST標準譜庫進行檢索并鑒定，采取峰面積歸一化法計算各物質的相對含量。

1.5 煙葉樣品制備模擬煙葉自然霉變，將倉儲煙葉放在恒溫恒濕箱中，在適宜溫濕度條件下(溫度為28 ℃、相對濕度為60%)進行霉變試驗，放置21 d后，得到霉變煙葉。將對應的正常煙葉與霉變煙葉分別置入旋風磨中，粉碎過40目篩，備用。

1.6 試驗方法選取紅花大金元同一份正常煙葉為對象；每次稱取0.5 g煙葉粉末樣品置于22 mL頂空瓶中，同時在頂空瓶中加入10 μL濃度為100 μg/mL的萘作為內標，及時封蓋后將頂空瓶放置于加熱攪拌臺。將萃取頭插入GC進樣口于300 ℃老化1 h，直至無雜峰出現(xiàn)，并對條件進行優(yōu)化：①對萃取頭種類(黑頭75 μm Carboxen-PDMS、黃頭30 μm PDMS/DVB、白頭85 μm PDMS/DVB、綠頭7 μm PDMS)的優(yōu)化；②對萃取溫度(50、60、70、80、90 ℃)的優(yōu)化；③對萃取時間(30、40、50、60 min)的優(yōu)化；④對解吸附時間(1、2、3、4 min)的優(yōu)化。將萃取的揮發(fā)性成分在GC進樣口進行解吸附后，成分進入氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，在“1.3”條件下分離與鑒定，以出峰數(shù)目和峰面積總量作為試驗條件優(yōu)化依據。采用NIST標準譜庫進行檢索，以萘內標作為參考，對揮發(fā)性化合物進行相對定量，正常煙葉與霉變煙葉總離子流圖見圖1所示。

根據優(yōu)化條件，對不同品種(包括紅大和K326)正常煙葉和霉變煙葉中揮發(fā)性成分種類進行測定，并采用Excel和SIMCA P+14.0軟件對揮發(fā)性成分類型及標志性成分進行統(tǒng)計和篩選。

圖1 正常煙葉(a)和霉變煙葉(b)總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of normal tobacco(a)and mouldy tobacco(b)

2 結果與分析

2.1 萃取頭的選取通過考察同一樣品不同極性涂層的萃取頭(黑頭、白頭、綠頭和黃頭)對煙葉揮發(fā)性成分的萃取效率的影響，結果顯示，黑頭(固定相為75 μm Carboxen-PDMS 涂層)萃取出的化合物最多，為58個，其他極性固定相涂層萃取頭的化合物檢出數(shù)分別為白頭35個、綠頭13個和黃頭23個，因為黑色萃取頭的出峰數(shù)目較多，最后選擇黑頭(固定相為75 μm Carboxen-PDMS 涂層)作為檢測霉菌代謝揮發(fā)性物質的萃取頭。

2.2 萃取溫度對萃取效果的影響在萃取溫度為50、60、70、80和90 ℃下進行測定，以“2.1”優(yōu)化出的黑體為萃取頭，揮發(fā)性成分的出峰數(shù)目分別為55、76、88、108和106個，各成分的峰面積歸一化百分含量總量分別為70.55%、72.05%、73.33%、76.95%和77.05%，80 ℃條件下測得的化合物最多，總峰面積歸一百分化含量與90 ℃檢出的化合物相應的峰面積歸一化百分含量相差不大，最終選擇檢出峰最多的80 ℃作為萃取溫度條件。

2.3 萃取時間對萃取效果的影響根據“2.1”和“2.2”優(yōu)化的條件，進一步考察不同萃取時間(30、40、50和60 min)對萃取效果的影響。結果表明，不同萃取時間下，出峰化合物數(shù)目分別為108、120、122和118個，峰面積歸一化百分含量分別為83.18%、80.33%、82.67%和80.59%，50 min時出峰數(shù)目最多，總峰面積歸一化百分含量比30 min的略低，綜合考慮后選擇50 min作為萃取時間。

2.4 解吸附時間對解析效果的影響根據“2.1”“2.2”和“2.3”優(yōu)化條件，分別在解吸附時間為1、2、3和4 min的條件下進行測定。結果表明，不同解吸附時間下，揮發(fā)性成分的出峰數(shù)目分別為95、98、96和92個，說明解吸附時間對測定影響不大，綜合考慮后選擇2 min作為解吸附時間。

2.5 方法重現(xiàn)性在22 mL頂空瓶中加入相同量的萘內標溶液，采用HS-SPME-GC-MS平行測定6次，6次測定的相對標準偏差(RSD)小于20%，說明所建立的測定方法的精密度滿足霉變煙葉中揮發(fā)性成分的測定。

2.6 正常煙葉與霉變煙葉樣品檢測根據“2.1～2.5”優(yōu)化結果，通過對不同品種正常和霉變煙葉中揮發(fā)性成分進行測定，對揮發(fā)性成分種類進行綜合統(tǒng)計，結果見圖2；并對正常和霉變煙葉中差異標志物進行對應分析，篩選出霉變煙葉的標志成分，結果如表1所示。

由圖2可知，正常煙葉和霉變煙葉所檢測出的揮發(fā)性成分中檢測出的種類均超過95種，其中酮類和醛類均較多，分別為22、18種和20、16種。

由表1可知，對正常煙葉和霉變煙葉揮發(fā)性成分的含量進行對比分析，篩選出8種揮發(fā)性成分，分別為5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1，2-二甲氧基-苯、2，4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸，這些揮發(fā)性成分在正常煙葉和霉變煙葉中差異較大。

圖2 正常煙葉與霉變煙葉揮發(fā)性成分種類占比統(tǒng)計Fig.2 Statistics of the percentage of the types of volatile components in normal and mouldy tobacco leaves

表1 相對定量檢測結果對比Table 1 Comparison of relative quantitative test results 單位：μg/g

圖3 正常煙葉和霉變煙葉8種揮發(fā)性成分主成分得分Fig.3 Main component scores of 8 volatile components in normal and mouldy tobacco leaves

進一步將所篩選的揮發(fā)性成分進行主成分和聚類分析，對8種標志物篩選的合理性進行分析，結果如圖3～4所示。由圖3可知，8種揮發(fā)性成分可將正常煙葉和霉變煙葉有效識別，前2個主成分累計貢獻率為89.1%。

圖4 正常煙葉和霉變煙葉8種揮發(fā)性成分的聚類圖Fig.4 Cluster diagram of 8 volatile components in normal and mouldy tobacco leaves

在閾值為10時，所篩選的8種揮發(fā)性成分可將不同品種(包括紅大和K326)的正常煙葉和霉變煙葉進行有效聚類。結果表明所篩選的8種揮發(fā)性成分可作為霉變煙葉和正常煙葉的識別依據，為后續(xù)早期霉變煙葉的數(shù)據化識別提供基礎依據。

3 結論

該研究建立基于SPME結合GC-MS法測定霉變煙葉中揮發(fā)性成分的方法，對影響SPME萃取效率的因素(萃取頭種類、萃取溫度、萃取時間和解吸附時間)進行了優(yōu)化，得到了較優(yōu)的萃取條件：采用固定相為75 μm Carboxen-PDMS 涂層的黑頭萃取頭，在80 ℃下萃取樣品50 min，萃取頭在氣相色譜進樣口解吸附2 min的條件下進行測定。對方法的重現(xiàn)性進行考察，6次測定結果的RSD值小于20%，說明所建立方法具有較好的重現(xiàn)性。

基于以上方法步驟，對正常煙葉和霉變煙葉的揮發(fā)性化合物進行測定，發(fā)現(xiàn)有8個化合物存在明顯的特征，分別為5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1，2-二甲氧基-苯、2，4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸。通過監(jiān)測這些化合物含量的變化可以用于識別煙葉霉變程度，該研究為判定煙葉霉變程度及煙葉霉變預防提供了技術支撐，可降低煙葉霉變帶來的經濟損失，同時為霉變煙葉的快速識別提供基礎依據。