真姬菇次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分研究

肖 咪，羅 蓉，薛宏坤，唐勁天，柳 鑫，蘇彥奇，蔡 旭*

(1.華中科技大學(xué)協(xié)和江北醫(yī)院/武漢市蔡甸區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430065；2.清華大學(xué)工程物理系教育部粒子與輻射成像重點實驗室，北京 100084；3.武漢市第四醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430034)

藥食兩用真菌含有豐富的氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)等成分，享有“維生素A寶庫”“菜中之王”“素食之冠”等美譽，營養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價值顯著[1-2]。作為寶貴的中藥資源，藥食兩用真菌多具有滋補功效，如云芝、茯苓、冬蟲夏草、猴頭菌等[3-5]。藥食兩用真菌是天然藥物的重要來源之一，從中開發(fā)了截短側(cè)耳素、茯苓多糖、安卓奎諾爾等相關(guān)的醫(yī)藥產(chǎn)品，用于抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫等[6-8]。

真姬菇[Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow]屬于離褶傘科玉蕈屬真菌，又名斑玉蕈、蟹味菇等，作為營養(yǎng)又低脂的美食，有“香在松口蘑，味在玉蕈”之稱[9-10]。真姬菇具有良好的抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的作用，但對其次生代謝產(chǎn)物的研究較少[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，真姬菇乙酸乙酯部位提取物表現(xiàn)出良好的抗氧活性，IC50為144.3 μg/mL，并分離鑒定了10個苯甲醛類衍生物[1]。為進(jìn)一步挖掘真姬菇代謝產(chǎn)物的多樣性，以真姬菇發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物為對象，對真姬菇次生代謝產(chǎn)物開展化學(xué)成分研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料Bruker Avance Ⅲ 400M核磁共振波譜儀(德國布魯克公司，400 MHz)；Agilent LC-Q-TOF-MS 6520液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司)；SHP-500型智能生化培養(yǎng)箱(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、氘代氯仿、氘代二甲基亞砜(上海希格瑪高技術(shù)有限公司)；柱層析硅膠、薄層硅膠、GF254薄層硅膠板(青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司)；RP-C18反相硅膠、Sephadex LH-20(德國Merck KGaA)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，均為分析純，北京市通廣精細(xì)化工公司；蒸餾水實驗室自制。

真姬菇菌種[Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow]購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號CICC50078，保藏于清華大學(xué)醫(yī)學(xué)物理與工程研究所。

1.2 試驗方法馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、15瓶大米培養(yǎng)基(大米80 g、水120 mL)經(jīng)高壓滅菌后，冷卻備用。將菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，復(fù)蘇后，取部分菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)7 d(溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min)，獲得種子培養(yǎng)液。取適量種子培養(yǎng)液接種至大米培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)架上，室溫培養(yǎng)21 d。取乙酸乙酯對15瓶發(fā)酵物進(jìn)行萃取(200 mL × 3次)，合并濾液，濃縮，得乙酸乙酯粗提物14.6 g。將乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解，加入20.0 g硅膠拌樣，晾干。含有樣品的硅膠粉末經(jīng)RP-C18色譜柱層析，依次用0～100%甲醇梯度洗脫，收集餾分，合并濃縮，得餾分Fr.A ～ Fr.E。

Fr.D(2.8 g)經(jīng)硅膠柱(200～300目)層析，依次用石油醚-乙酸乙酯(6∶1～1∶2)梯度洗脫，依據(jù)薄層硅膠板檢測結(jié)果，合并流分，得到Fr.D1～D5餾分。Fr.D4餾分經(jīng)硅膠柱(薄層硅膠)層析，依次用二氯甲烷-甲醇(60∶1～10∶1)梯度洗脫，依據(jù)薄層硅膠板分析結(jié)果，合并濃縮，得Fr.D41～Fr.D45餾分。Fr.D42～D44分別經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，等度洗脫，得化合物1(2.6 mg)、化合物2(5.1 mg)、化合物3(6.9 mg)、化合物4(3.8 mg)、化合物5(4.4 mg)。Fr.D3餾分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠色譜柱層析后，再經(jīng)硅膠柱(薄層硅膠)層析，依次用二氯甲烷-甲醇(50∶1～10∶1)梯度洗脫，得化合物6(1.4 mg)、化合物7(1.4 mg)、化合物8(3.3 mg)。Fr.D2經(jīng)硅膠柱(薄層硅膠)層析，依次用石油醚-乙酸乙酯(5∶1～2∶1)梯度洗脫，合并濃縮，得Fr.D21～Fr.D26餾分；各餾分再經(jīng)RP-C18色譜柱層析，依次用50%～100%甲醇梯度洗脫，依次得化合物9(6.7 mg)、化合物14(12.1 mg)、化合物10(8.7 mg)、化合物11(2.2 mg)、化合物12(1.8 mg)、化合物13(11.5 mg)。

2 結(jié)果與分析

該研究從真姬菇大米發(fā)酵物的乙酸乙酯提取物中分離鑒定了14個化合物，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示?；衔?～14均為首次從玉蕈屬真菌次生代謝產(chǎn)物中分離得到。

圖1 化合物1～14的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-14

化合物1：黃色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z286.243 8[M]+，分子式為C15H11O6。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.24(2H，OH-1，8)，11.17(1H，s，OH-3)，7.73(1H，d，J=1.6 Hz，H-2)，7.29(1H，d，J=1.6 Hz，H-4)，6.64(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，7.29(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，4.80(2H，s，CH2OH-5)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：166.5(C-1)，108.3(C-2)，161.9(C-3)，109.2(C-4)，133.3(C-4a)，121.2(C-5)，153.2(C-6)，117.5(C-7)，164.9(C-8)，109.5(C-8a)，189.9(C-9)，114.5(C-9a)，181.8(C-10)，135.5(C-10a)，62.4(-CH2OH-5)?；衔?鑒定為羥基大黃素[13]。

化合物2：黃色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z241.211 3[M+H]+，分子式為C14H8O4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.01(2H，s，OH-1，8)，7.39(2H，dd，J=8.2，1.5 Hz，H-2，7)，7.82(2H，m，H-3，6)，7.94(2H，m，H-4，5)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.4(C-1，8)，124.7(C-2，7)，137.5(C-3，6)，119.4(C-4，5)，133.5(C-4a，10a)，115.9(C-8a，9a)，193.2(C-9)，181.1(C-10)?；衔?鑒定為1，8-二羥基蒽醌[14]。

化合物3：黃色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z270.240 9[M]+，分子式為C14H8O4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.13(2H，s，OH-1，8)，11.43(1H，s，OH-3)，6.55(1H，d，J=2.4 Hz，H-2)，7.06(1H，d，J=2.4 Hz，H-4)，7.52(1H，d，J=1.5 Hz，H-5)，7.10(1H，d，J=1.5 Hz，H-7)，2.39(3H，s，CH3-6)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.9(C-1)，108.3(C-2)，164.8(C-3)，109.1(C-4)，135.4(C-4a)，124.5(C-5)，148.6(C-6)，120.8(C-7)，161.8(C-8)，109.3(C-8a)，190.0(C-9)，113.6(C-9a)，181.6(C-10)，133.1(C-10a)，21.9(-CH3-6)?；衔?鑒定為大黃素[15]。

化合物4：黃色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z284.273 3[M]+，分子式為C16H12O5。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.10(1H，s，OH-1)，12.05(1H，s，OH-8)，7.11(1H，s，H-2)，7.68(1H，d，J=2.4 Hz，H-4)，7.50(1H，s，H-5)，6.89(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，3.67(3H，s，-OCH3-3)，2.28(3H，s，6-CH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：165.3(C-1)，106.6(C-2)，166.6(C-3)，108.2(C-4)，134.4(C-4a)，113.8(C-5)，148.5(C-6)，121.0(C-7)，162.4(C-8)，111.5(C-8a)，190.7(C-9)，110.3(C-9a)，181.5(C-10)，133.4(C-10a)，55.9(-OCH3-3)，21.5(CH3-6)?；衔?鑒定為大黃素甲醚[15]。

化合物5：黃色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z238.241 7[M]+，分子式為C15H10O3。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.36(1H，s，OH-1)，7.61(1H，d，J=7.4 Hz，H-3)，7.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-4，7)，8.21(1H，s，H-5)，7.90(1H，d，J=7.4 Hz，H-6)，8.30(1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，2.48(3H，s，2-CH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：162.7(C-1)，124.1(C-2)，134.4(C-3)，120.8(C-4)，135.4(C-4a)，127.3(C-5)，148.6(C-6)，134.1(C-7)，126.7(C-8)，130.9(C-8a)，188.0(C-9)，132.8(C-9a)，182.7(C-10)，113.2(C-10a)，22.2(CH3-2)?；衔?鑒定為1-羥基-2-甲基蒽醌[16]。

化合物6：白色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z167.151 0[M]+，分子式為C8H12O4。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.38(1H，d，J=1.5 Hz，H-3)，8.05(1H，d，J=1.5 Hz，H-5)，6.39(1H，s，H-6)，3.73(3H，s，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：114.6(C-1)，156.8(C-2)，97.1(C-3)，167.9(C-4)，101.8(C-5)，132.6(C-6)，169.7(C-7)，61.2(C-8)?；衔?鑒定為2，4-二羥基苯甲酸甲酯[17]。

化合物7：白色粉末，HR-EI-MS譜中顯示m/z151.142 4[M]+，分子式為C8H8O3。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.77(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.82(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，3.84(3H，s，OCH3-4)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：124.3(C-1)，133.4(C-2，6)，117.1(C-3，5)，161.4(C-4)，169.5(C-7)，51.8(C-8)?；衔?鑒定為4-羥基苯甲酸甲酯[17]。

化合物8：白色針晶，HR-ESI-MS 譜中顯示m/z467.741 3[M + Na]+，分子式為C30H52O2。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.20(1H，dd，J=13.1，4.8 Hz，H-1a)，0.81(1H，dd，J=13.1，4.8 Hz，H-1b)，4.2(1H，m，H-2)，2.03(1H，m，H-16)，1.78(2H，m，H-20)，2.36(1H，m，H-21)，0.91(3H，s，H-23)，0.89(3H，s，H-24)，0.91(3H，s，H-25)，0.95(6H，s，H-26，27)，0.87(3H，s，H-28)，1.40(3H，s，H-29)，1.36(3H，s，H-30)；13C-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：50.3(C-1)，63.7(C-2)，51.9(C-3)，34.7(C-4)，55.5(C-5)，18.3(C-6)，33.8(C-7)，41.4(C-8)，50.1(C-9)，38.9(C-10)，21.6(C-11)，24.7(C-12)，49.8(C-13)，41.9(C-14)，34.4(C-15)，22.1(C-16)，54.3(C-17)，44.1(C-18)，41.8(C-19)，26.7(C-20)，51.3(C-21)，72.2(C-22)，33.5(C-23)，22.5(C-24)，16.2(C-25)，16.9(C-26)，17.0(C-27)，16.7(C-28)，31.2(C-29)，29.5(C-30)。化合物8鑒定為(2ALPHA)-A′-新伽馬蠟烷-2，22-二醇[18]。

化合物9：白色針晶，HR-ESI-MS 譜中顯示m/z438.312 5[M + Na]+，分子式為C29H50O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.53(1H，m，H-3)，5.14(1H，m，H-6)，0.70(3H，s，H-18)，1.17(3H，s，H-19)，1.02(3H，s，H-21)，0.81(6H，m，H-26，27)，0.93(3H，dd，J=6.0，3.5 Hz，H-29)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.2(C-1)，31.6(C-2)，71.7(C-3)，45.8(C-4)，140.7(C-5)，121.6(C-6)，31.9(C-7，8)，50.1(C-9)，36.1(C-10)，21.2(C-11)，39.9(C-12)，42.2(C-13)，56.7(C-14)，26.0(C-15)，29.1(C-16)，56.0(C-17)，11.8(C-18)，19.8(C-19)，38.9(C-20)，19.4(C-21)，36.5(C-22)，24.3(C-23)，49.7(C-24)，29.0(C-25)，19.9(C-26，27)，23.0(C-28)，12.4(C-29)。化合物9鑒定為β-谷甾醇[19]。

化合物10：白色針晶，HR-ESI-MS 譜中顯示m/z436.692 7[M + Na]+，分子式為C29H48O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.49(1H，m，H-3)，5.18(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.22(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，0.66(3H，s，H-18)，1.01(3H，s，H-19)，0.98(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，5.19(1H，dd，J=15.3，8.1 Hz，H-22)，5.10(1H，dd，J=15.3，8.1 Hz，H-23)，0.79(6H，m，H-26，27)，0.88(3H，s，H-29)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：36.8(C-1)，30.2(C-2)，70.6(C-3)，40.7(C-4)，139.6(C-5)，120.9(C-6)，30.8(C-7)，30.6(C-8)，49.2(C-9)，35.3(C-10)，20.5(C-11)，39.9(C-12)，41.7(C-13)，54.8(C-14)，23.8(C-15)，27.7(C-16)，56.3(C-17)，13.0(C-18)，18.3(C-19)，39.5(C-20)，21.0(C-21)，136.4(C-22)，127.4(C-23)，50.9(C-24)，30.1(C-25)，19.8(C-26，27)，24.7(C-28)，12.0(C-29)?；衔?0鑒定為豆甾醇[19]。

化合物11：白色粉末，HR-ESI-MS譜中顯示m/z415.633 4[M + Na]+，分子式為C28H40O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.76(1H，s，H-4)，6.63(1H，d，J=9.5 Hz，H-6)，6.05(1H，d，J=9.5 Hz，H-7)，1.02(3H，s，3)，0.98(3H，s，H-19)，1.08(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，5.25(2H，m，H-22，23)，0.86(6H，t，J=6.8 Hz，H-26，27)，0.95(3H，d，H-28)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：35.5(C-1)，36.3(C-2)，199.6(C-3)，122.9(C-4)，124.4(C-5)，124.4(C-6)，135.0(C-7)，164.4(C-8)，44.3(C-9)，36.7(C-10)，20.2(C-11)，36.0(C-12)，44.1(C-13)，156.1(C-14)，25.3(C-15)，27.7(C-16)，55.6(C-17)，16.7(C-18)，19.6(C-19)，39.3(C-20)，20.0(C-21)，134.0(C-22)，132.5(C-23)，42.8(C-24)，33.0(C-25)，19.4(C-26)，19.6(C-27)，18.9(C-28)?；衔?1鑒定為麥角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮[20]。

化合物12：白色粉末，HR-ESI-MS 譜中顯示m/z419.633 4[M + Na]+，分子式為C28H40O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.62(1H，d，J=15.4，4.6 Hz，H-3)，5.21(1H，m，H-7)，0.56(3H，s，H-18)，0.82(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=12.8 Hz，H-26)，0.88(3H，d，J=12.8 Hz，H-27)，0.98(3H，d，J=6.3 Hz，H-28)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.0(C-1)，41.2(C-2)，198.0(C-3)，42.1(C-4)，37.7(C-5)，29.4(C-6)，117.4(C-7)，139.4(C-8)，49.3(C-9)，34.1(C-10)，21.3(C-11)，39.3(C-12)，43.4(C-13)，55.2(C-14)，22.8(C-15)，27.9(C-16)，56.0(C-17)，11.8(C-18)，13.0(C-19)，39.1(C-20)，21.5(C-21)，134.6(C-22)，131.0(C-23)，42.8(C-24)，33.8(C-25)，20.0(C-26)，20.8(C-27)，16.9(C-28)?；衔?2鑒定為麥角甾-7，22-二烯-3-酮[20]。

化合物13：白色粉末，HR-ESI-MS譜中顯示m/z284.741 5[M]+，分子式為C18H36O2。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.37(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.66(2H，m，J=7.4 Hz，H-3)，0.98(3H，td，J=7.2，3.4 Hz，H-18)，1.38[28H，m，-(CH2)14-]；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.9(C-1)，34.4(C-2)，32.7(C-3)，30.2～30.5(C-4～15)，25.2(C-6)，23.4(C-17)，14.9(C-18)?；衔?3鑒定為硬脂酸[21]。

化合物14：白色粉末，HR-ESI-MS譜中顯示m/z282.453 6[M]+，分子式為C18H34O2。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.50(2H，t，J=6.7 Hz，H-2)，1.75(2H，m，J=6.7 Hz，H-3)，1.38[20H，m，H-4～7，H-12～17]，2.08(4H，m，H-8，11)，5.41(2H，m，H-9，10)，0.95(3H，td，J=7.4，3.7 Hz，H-18)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：180.2(C-1)，35.1(C-2)，25.3(C-3)，30.1～30.5(C-4～7，C-12～17)，27.6(C-8，11)，130.4(C-9)，131.1(C-10)，32.3(C-16)，23.1(C-17)，14.7(C-18)?；衔?4鑒定為油酸[21]。

3 結(jié)論與討論

該研究從真姬菇大米發(fā)酵的乙酸乙酯提取物中分離鑒定出14個化合物，主要為蒽醌類和甾醇類化合物，分別鑒定為羥基大黃素(1)、1，8-二羥基蒽醌(2)、大黃素(3)、大黃素甲醚(4)、1-羥基-2-甲基蒽醌(5)、2，4-二羥基苯甲酸甲酯(6)、4-羥基苯甲酸甲酯(7)、(2ALPHA)-A′-新伽馬蠟烷-2，22-二醇(8)、β-谷甾醇(9)、豆甾醇(10)、麥角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮(11)、麥角甾-7，22-二烯-3-酮(12)、硬脂酸(13)、油酸(14)。羥基大黃素、大黃素等作為虎杖、何首烏、決明子中藥重要的活性成分，具有良好的抑菌作用。真姬菇代謝產(chǎn)生大量蒽醌類化合物，表明真姬菇受大環(huán)境刺激，可通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)以抑制其他雜菌生長[22-23]。該研究首次從真姬菇次生代謝產(chǎn)物中分離得到蒽醌類和甾醇類化合物，豐富了玉蕈屬真菌次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分及其種類，為其深入研究和開發(fā)利用提供了理論與物質(zhì)的基礎(chǔ)。