迷宮栓孔菌子實(shí)體提取物的抗氧化活性研究

晏飛利，劉 丹，陳艾萌，呂向陽(yáng)，馬 林

(1.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川內(nèi)江641009；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621000)

研究表明，人體的衰老及諸多慢性疾病的發(fā)生均與體內(nèi)自由基水平的失衡有關(guān)[1-2]，而通過(guò)攝入外源性抗氧化劑以提高自身抗氧化能力無(wú)疑是有效預(yù)防措施之一。鑒于人工合成抗氧化劑，如2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、丁基羥基茴香醚等存在潛在毒性，天然抗氧化劑的尋找和開(kāi)發(fā)已成為科研工作者關(guān)注的熱門(mén)研究領(lǐng)域之一[3]。高等真菌種類多樣，資源豐富，具有食用、藥用、保健等價(jià)值[2，4]，許多學(xué)者已發(fā)現(xiàn)多種高等真菌提取物具有良好的抗氧化性能，如桑黃、樺褐孔菌、繡球菌等的提取物[5-7]。

迷宮栓孔菌[Trametesgibbosa(Pers.) Fr.]，隸屬多孔菌科(Polyporaceae)栓孔菌屬(Trametes)[8]，又稱褶孔栓菌、偏腫栓菌。迷宮栓孔菌能分解植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，是重要的白腐真菌[9-10]，同時(shí)也是一類具有藥用保健價(jià)值的高等真菌，含有多糖、萜類、醇類和酚類等活性成分[11-13]。研究表明，迷宮栓孔菌子實(shí)體多糖具有血管保護(hù)和抗炎功效[14]，內(nèi)生木酶菌株具有抑菌作用[15]。張峰等[12]對(duì)分離的迷宮栓孔菌菌絲體的最適培養(yǎng)條件和子實(shí)體馴化栽培進(jìn)行了研究，并測(cè)定栽培子實(shí)體的多糖抗氧化活性，表明提取的粗多糖對(duì)超氧陰離子和羥基自由基具有良好的清除效果；Johnsy等[16]研究發(fā)現(xiàn)迷宮栓孔菌甲醇提取物和水提取物具有一定的抗氧化和抗菌功效。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)對(duì)迷宮栓孔菌抗氧化活性的研究多集中于其多糖組分，對(duì)多酚的研究較少，對(duì)其不同溶劑提取物的抗氧化活性、抗氧化活性成分及其相關(guān)性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究對(duì)迷宮栓孔菌子實(shí)體用水和60%乙醇進(jìn)行提取，測(cè)定提取物的多酚和多糖含量，分析提取物的抗氧化活性大小，同時(shí)進(jìn)行抗氧化活性與多酚及多糖含量的相關(guān)性分析，為迷宮栓孔菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1研究對(duì)象。迷宮栓孔菌子實(shí)體，采自四川省綿陽(yáng)市三臺(tái)縣，經(jīng)西南科技大學(xué)賀新生教授鑒定為迷宮栓孔菌[Trametesgibbosa(Pers.) Fr.]，在恒溫鼓風(fēng)干燥箱60 ℃干燥，粉碎，過(guò)40目篩備用

1.1.2主要試劑。DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，日本東京化成株式會(huì)社，純度>97%；福林酚試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮、乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、維生素C、葡萄糖、硫酸和沒(méi)食子酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器。RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JP-010T型超聲儀，上海科導(dǎo)超聲儀公司；UV752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝。稱取粉碎后的迷宮栓孔菌子實(shí)體細(xì)粉，按照料液比1∶20加入水或60%乙醇，50 ℃溫度下超聲(功率150 W)提取3次，每次45 min，趁熱抽濾，合并3次濾液并于55 ℃下減壓濃縮得褐色浸膏，置于50 ℃烘箱中干燥24 h[17]，精密稱重浸膏重量，按公式(1)計(jì)算提取物得率。

(1)

式中，M1表示提取物質(zhì)量(g)，M2表示干原料質(zhì)量(g)。

1.2.2多酚含量測(cè)定。采用福林酚法測(cè)定提取物的多酚含量[18]。以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制1 mg/mL的母液，分別移取母液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管，補(bǔ)足蒸餾水至1 mL，再加入1 mL稀釋1倍的福林酚試劑，振蕩 3 min，隨后加入1 mL 20%的Na2CO3溶液，充分混勻，30 ℃避光水浴30 min；以1 mL蒸餾水代替樣品反應(yīng)液調(diào)零，在725 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。2種提取物樣品亦取1 mL(1 mg/mL)代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液按同樣方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次。以計(jì)算得到的沒(méi)食子酸當(dāng)量(mg/g)表示多酚含量。

1.2.3多糖含量測(cè)定。蒽酮-硫酸法測(cè)定提取物中的多糖含量[6]。以無(wú)水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在試管中加入1 mL葡萄糖溶液，再加入5 mL濃度為1 mg/mL的蒽酮-硫酸試劑，沸水浴15 min，冷卻后放置10 min；以1 mL蒸餾水代替樣品反應(yīng)液調(diào)零，620 nm處測(cè)定吸光度。提取物樣品取1 mL(1 mg/mL)按同樣方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次。以計(jì)算得到的葡萄糖當(dāng)量(mg/g)表示多糖含量。

1.2.4DPPH自由基清除活性測(cè)定。采用文獻(xiàn)[19]的方法測(cè)定迷宮栓孔菌提取物對(duì)DPPH自由基的清除效果。用無(wú)水乙醇將DPPH配制成0.2 mmol/L的溶液備用。在3 mL濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液中分別加入水提取物溶液、60%乙醇提取物溶液或維生素C溶液1 mL，混勻后28 ℃水浴30 min，立即在517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A1)；取1 mL蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)得空白吸光度(A0)；以3 mL蒸餾水代替DPPH溶液，測(cè)得試劑吸光度(A2)。按公式(2)計(jì)算清除率。

(2)

1.2.5鐵離子還原能力測(cè)定。鐵離子還原能力測(cè)定參照Malakottabary等[13]的方法并略作修改。在試管中加入1 mL不同濃度(0.5～2.5 mg/mL)的提取物樣品溶液、1 mL 濃度為0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴30 min；冷卻后加入1 mL 10%的三氯乙酸、0.2 mL現(xiàn)配的0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，靜置10 min；以蒸餾水調(diào)零，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以維生素C作為對(duì)照品，以吸光度表示鐵離子還原能力強(qiáng)弱，吸光度越大，鐵離子還原能力越強(qiáng)。

1.2.6超氧陰離子自由基清除活性測(cè)定。參照盧航等[20]的方法檢測(cè)迷宮栓孔菌提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性。在試管中加入5 mL濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，25 ℃水浴20 min；加入1 mL不同濃度(1～5 mg/mL)的樣品溶液和0.5 mL濃度為3 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻，25 ℃水浴5 min；最后加入1 mL濃度為5 mol/L HCl終止反應(yīng)，并搖勻，反應(yīng)3 min；以蒸餾水調(diào)零，在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度(A1)。以1 mL蒸餾水代替樣液測(cè)得空白吸光度(A0)。以0.5 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測(cè)得樣品本底吸光度(A2)。以維生素C作為對(duì)照品，按公式(3)計(jì)算清除率。

(3)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析該研究的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用Graphpad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間方差分析，P<0.05認(rèn)為具有顯著差異。以2種提取物各濃度下抗氧化指標(biāo)平均值與抗氧化物質(zhì)含量平均值為分析對(duì)象，采用SPSS 17.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程經(jīng)分析(圖1)，沒(méi)食子酸在0～0.05 mg/mL線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=21.057x+0.018 9(R2=0.997 0)；葡萄糖在0～0.10 mg/mL線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=6.251 4x+0.007(R2=0.998 5)。

圖1 沒(méi)食子酸(a)和葡萄糖(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid(a) and glucose(b)

2.2 不同溶劑的提取物得率及多酚和多糖含量不同提取溶劑具有不同的提取效果，提取成分也有所差異。水和60%乙醇提取的迷宮栓孔菌子實(shí)體得率及其多酚和多糖含量如表1所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，水提取物得率高達(dá)10.60%，明顯高于60%乙醇提取物得率；水提取物多酚含量為(46.44±0.46) mg/g，明顯高于60%乙醇提取物的多酚含量；60%乙醇提取物的多糖含量為(185.83±12.45)mg/g，明顯高于水提取物的多糖含量。

2.3 對(duì)DPPH自由基的清除能力從圖2可以看出，在0.5～2.5 mg/mL，迷宮栓孔菌水提取物對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出良好的清除能力，與維生素C在0.02～0.10 mg/mL的清除效果接近，迷宮栓孔菌水提取物濃度在2.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)(94.58±1.51)%；60%乙醇提取物的清除能力顯著低于水提取物(P<0.05)，在2.5 mg/mL時(shí)清除率為(51.51±2.63)%，相當(dāng)于0.04 mg/mL維生素C的清除能力。

表1 提取物的得率、多酚和多糖含量Table 1 Yield of extracts，polyphenol and polysaccharide contents

注：*P<0.05。圖2 維生素C(a)和迷宮栓孔菌提取物(b)對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of DPPH radical by VC(a) and T.gibbosa extracts(b)

2.4 對(duì)鐵離子的還原能力抗氧化劑的鐵離子還原能力與其抗氧化活性呈正相關(guān)，對(duì)鐵離子還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性則越強(qiáng)[17]。測(cè)定結(jié)果表明(圖3)，迷宮栓孔菌水提取物具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力，隨濃度的增加，還原能力增強(qiáng)較明顯，在0.5～2.5 mg/mL的還原能力與維生素C在0.02～0.10 mg/mL的還原能力相當(dāng)；60%乙醇提取物還原能力相對(duì)于水提取物較弱，2.5 mg/mL 60%乙醇提取物的還原能力僅相當(dāng)于0.02～0.04 mg/mL維生素C的還原能力。

注：*P<0.05。圖3 維生素C(a)和迷宮栓孔菌提取物(b)的鐵離子還原能力Fig.3 The reducing power of iron ion by VC(a) and T.gibbosa extracts(b)

2.5 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力從圖4可以看出，維生素C在0.02～0.04 mg/mL對(duì)超氧陰離子自由基的清除率較低，0.06 mg/mL及以上清除效果明顯增強(qiáng)，0.10 mg/mL時(shí)清除率達(dá)97.1%。在1～5 mg/mL，60%乙醇提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果隨濃度的增加不明顯，水提取物則相對(duì)更明顯，低濃度時(shí)60%乙醇提取物的清除率高于水提取物，而在高濃度時(shí)則水提取物的清除率更高。在樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，水提取物清除率為35.25%±3.29%，相當(dāng)于維生素C在0.04～0.06 mg/mL的清除效果，60%乙醇提取物的清除率為23.69%±4.46%。總體上，迷宮栓孔菌提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相較于對(duì)DPPH自由基的清除能力和對(duì)鐵離子的還原能力較弱。

2.6 提取物多酚和多糖含量與抗氧化活性的關(guān)系Pearson相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，迷宮栓孔菌水提取物和60%乙醇提取物的多酚和多糖含量與其DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力和超氧陰離子自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，這與目前報(bào)道的高等真菌的多糖、多酚物質(zhì)是主要的抗氧化活性物質(zhì)結(jié)果相符[4，6]。

圖4 維生素C(a)和迷宮栓孔菌提取物(b)對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of superoxide anion radical by VC(a) and T.gibbosa extracts(b)

表2 多酚和多糖含量與抗氧化活性的相關(guān)關(guān)系Table 2 The correlation of antioxidant activity with content of polyphenol and polysaccharide

3 討論與結(jié)論

該研究表明，迷宮栓孔菌子實(shí)體水提取物和60%乙醇提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但在不同的抗氧化指標(biāo)及強(qiáng)度上表現(xiàn)有所差異。2種提取物的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力較好，超氧陰離子自由基清除能力次之。水提取物的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力顯著高于60%乙醇提取物。水提取物的多酚含量較高，60%乙醇提取物的多糖含量較高。相關(guān)性分析顯示，2種提取物的3項(xiàng)抗氧化指標(biāo)與其多酚和多糖含量均呈極顯著正相關(guān)。

綜合分析可知，水提取物的抗氧化能力強(qiáng)于60%乙醇提取物，相應(yīng)地，水提取物具有更高的多酚含量，這與薄荷、翠云草和藍(lán)莓葉等提取物的抗氧化活性研究中相似，水提取物中的多酚含量更高，從而具有更好的抗氧化能力[17，21-22]。表明酚類物質(zhì)是迷宮栓孔菌子實(shí)體的主要抗氧化活性物質(zhì)，多糖次之，這在桑黃的抗氧化活性研究中亦有報(bào)道[23]。

一般來(lái)說(shuō)，多糖類物質(zhì)由于其分子中含有大量的極性基團(tuán)，對(duì)水分子具有較強(qiáng)的親合力，但隨著其分子量的增大，其疏水性也隨之增大，因此分子量大、分支程度高的多糖在水中溶解度低[24]。迷宮栓孔菌子實(shí)體中的多糖可能多為分子量大、分支程度高的多糖，因此水提取物中多糖含量相較于60%乙醇提取物的更低。

由于抗氧化系統(tǒng)、機(jī)制、抗氧化劑及自由基的多樣性，同一抗氧化劑用不同的方法檢測(cè)結(jié)果可能不同[4，16]，這可能也是水提取物和60%乙醇提取物具有良好的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力，但對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用較弱的原因。

迷宮栓孔菌2種提取物的抗氧化活性與多酚和多糖的含量均有顯著的相關(guān)性，這與張峰等[12，25]的報(bào)道一致，說(shuō)明多酚和多糖均為迷宮栓孔菌重要的抗氧化物質(zhì)。水提取物的多酚較多，60%乙醇提取物的多糖成分較多，后續(xù)可通過(guò)調(diào)整水和乙醇比例有針對(duì)性地提取不同抗氧化組分。

該研究在張峰等[12]和Johnsy等[16]的基礎(chǔ)上進(jìn)一步豐富了迷宮栓孔菌的抗氧化活性研究，有利于迷宮栓孔菌的開(kāi)發(fā)利用，但迷宮栓孔不同提取物的組分差異、體內(nèi)抗氧化活性和藥理活性研究還有待加強(qiáng)。