超聲波輔助果膠酶法優(yōu)化花牛蘋果幼果多酚的工藝研究

高義霞，呼麗萍

(1.天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅天水 741001；2.甘肅省大櫻桃工程技術(shù)研究中心，甘肅天水 741001)

我國是世界蘋果產(chǎn)業(yè)規(guī)模最大的國家之一，2014年蘋果栽培面積和產(chǎn)量分別達(dá)到226萬hm2和3 800萬t，幼果達(dá)285萬t[1]。其中，甘肅省蘋果栽培面積和年產(chǎn)量分別達(dá)到32萬hm2和320萬t，幼果約24萬t[2]。而幼果中的多酚提取率為成熟果實的10倍，是蘋果多酚豐富的來源，開發(fā)價值很高[3]。研究表明，蘋果多酚的許多生理功能(如抗齲齒[4-5]、抗氧化等)比茶多酚高100倍以上，因此開發(fā)蘋果多酚制品具有廣闊的銷售市場。目前絕大多數(shù)蘋果幼果被廢棄，極少量以沼氣或者飼喂家禽等方式消化，既污染了自然環(huán)境，又造成極大的資源浪費[6]。蘋果多酚提取工藝主要有溶劑萃取法、高壓萃取技術(shù)及二氧化碳超臨界萃取技術(shù)等，這些方法在提取效率、節(jié)能及自動化等方面尚有不足[7]。而超聲輔助提取法具有效率高、能量低以及節(jié)省溶劑等特點，正逐漸成為有效提取多酚等活性物質(zhì)的新興技術(shù)[8]。王賢萍等[9]利用超聲波輔助法提取山西嘎啦蘋果多酚，確定最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時間60 min，pH 3，料液比1∶6，超聲功率80 W，在該條件下含量可達(dá)到1 692.72 mg/kg。李珍等[10]利用超聲波輔助法提取蘋果皮渣多酚，確定最佳提取工藝為提取時間10 min，超聲功率500 W，提取溫度65 ℃，料液比1∶30，在該條件下實際測定的總酚含量可達(dá)到4.53 mg/g。為了充分利用當(dāng)?shù)靥厣贰盎ㄅ！碧O果幼果，筆者采取超聲輔助果膠酶法提取蘋果多酚，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取參數(shù)，確定蘋果多酚最佳工藝條件，以期為花牛蘋果幼果的資源利用及其多酚開發(fā)提供理論依據(jù)，也為蘋果多酚在食品及醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器花牛蘋果幼果，采自甘肅省天水市麥積區(qū)中灘鎮(zhèn)九龍山蘋果基地，時間2016年6月5日，處理前保存于0 ℃冷庫中。福林酚試劑(Folin-Ciocalteu)，上海潤順化工有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%)、阿拉丁試劑、果膠酶，sigma公司；異抗壞血酸，湖南世紀(jì)華星生物工程有限公司；無水乙醇，國產(chǎn)分析純。

KQ-500型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；紫外-可見分光光度計(UV-2450)，日本島津；料理機(JYL-C022)，九陽集團。

1.2 蘋果多酚提取取花牛蘋果幼果，去核除蒂，按10∶1的比例(M/V，g/mL)加入10%異抗壞血酸作為護(hù)色劑，破碎后準(zhǔn)確稱取樣品10.000 g，加入果膠酶酶解[11]，乙醇超聲波提取，提取液抽濾后收集濾液，定容備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和多酚提取率測定多酚提取率測定采用Folin-Ciocalteu法[12-13]。吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液(50 μg/mL)于25 mL容量瓶中，分別添加3.0 mL Folin-Ciocalteu試劑，反應(yīng)5 min后分別加入2.0 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，30 ℃避光水浴30 min，測定OD690。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.179 3X+0.000 3

式中，Y為OD，X為多酚提取率，μg/mL。取1.0 mL同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，計算多酚提取率。

多酚提取率公式為

C=X×V×N/M

式中，C為多酚提取率，μg/g；V為體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗

1.4.1提取時間對多酚提取率的影響。稱取樣品10.0 g 6份，在料液比1∶6、乙醇體積60%、超聲波功率60 W、溫度50 ℃，時間分別為10、20、30、40、50、60 min的條件下提取，計算多酚提取率，平行3次。

1.4.2料液比對多酚提取率的影響。稱取樣品10.0 g 6份，設(shè)定超聲波功率60 W、溫度50 ℃、提取時間50 min、乙醇體積60%，在料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的條件下提取，計算多酚提取率，平行3次。

1.4.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響。稱取樣品10.0 g 6份，設(shè)定超聲波功率60 W、溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶6，分別加入體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%的乙醇提取，計算多酚提取率，平行3次。

1.4.4超聲波功率對多酚提取率的影響。稱取樣品10.0 g 6份，在料液比1∶6、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50 ℃、提取時間50 min，超聲波功率分別20、40、60、80、100 W的條件下提取，計算多酚提取率，平行3次。

1.4.5提取溫度對多酚提取率的影響。稱取打漿后的樣品10.0 g 6份，在料液比1∶6、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、設(shè)定超聲波功率100 W、提取時間50 min，在20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下提取，計算多酚提取率，平行3次。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化蘋果幼果多酚提取工藝根據(jù)單因素試驗結(jié)果進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，條件設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平試驗設(shè)計Table 1 Response surface factor level experiment design

在優(yōu)化試驗中以提取時間(A)、料液比(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、提取溫度(D)為自變量，以花牛蘋果幼果多酚提取率為考察指標(biāo)，共設(shè)計29個試驗點，其中24個分析點，中心試驗重復(fù)5次，用來估計試驗誤差。

1.6 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時間對蘋果多酚提取率的影響由圖1可知，隨著提取時間的延長，蘋果多酚提取率呈先上升后下降趨勢，70 min時提取率最大。原因可能是提取時間過短，多酚未被完全提取，提取時間過長，則導(dǎo)致其他可溶性物質(zhì)被溶出，且多酚易發(fā)生不同程度的分解。

圖1 提取時間對蘋果多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of apple polyphenols

2.2 料液比對蘋果多酚提取率的影響由圖2可知，蘋果多酚提取率隨料液比的增加先升高后下降，當(dāng)料液比為1∶6時提取率達(dá)到最大值，為9.206 mg/g。原因可能是超聲波振動提取時，蘋果超微結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取效率升高[14]。而當(dāng)料液比達(dá)到一定程度后，繼續(xù)提高料液比會使多酚提取率下降，可能原因是料液比較小時，幼果細(xì)胞吸收的超聲波能量較多，細(xì)胞破碎程度較好，多酚更容易被釋放到溶劑中；料液比過大時，超聲波能量的吸收程度較小，細(xì)胞破碎程度減小，多酚物質(zhì)不易被釋放；但是如果料液比過小，溶解多酚的溶劑就會過少，效果亦不佳。

圖2 料液比對蘋果多酚提取率的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on extraction rate of apple polyphenols

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘋果多酚提取率的影響由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，蘋果多酚提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，多酚提取率達(dá)最大值，為9.095 mg/g。原因可能是幼果多酚一部分為醇溶性，另一部分為水溶性，且兩者比例相當(dāng)[15]。當(dāng)提取液濃度過低時，醇溶性多酚未充分釋放，反之，水溶性未充分溶解，只有在醇水比例相當(dāng)時效果最佳。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘋果多酚提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of apple polyphenol

2.4 超聲波功率對蘋果多酚提取率的影響由圖4可知，蘋果多酚提取率隨著超聲波功率的增加而逐漸增大，當(dāng)超聲波功率為100 W時，提取率達(dá)到最大值，為10.625 mg/g。原因可能是功率過小，振動能低，不能充分提取。

圖4 超聲波功率對蘋果多酚提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of apple polyphenols

2.5 提取溫度對蘋果多酚提取率的影響由圖5可知，蘋果多酚提取率隨提取溫度的升高呈先上升后下降趨勢，當(dāng)提取溫度為70 ℃時提取率最大為11.035 mg/g。原因可能是溫度升高，會使物質(zhì)內(nèi)的分子運動加快，多酚類物質(zhì)的擴散與滲透的速度加快，使多酚更易溶出。但是溫度過高時，會破壞多酚的結(jié)構(gòu)，提取率下降，這與文獻(xiàn)報道結(jié)論一致[14，16]。

圖5 提取溫度對蘋果多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of apple polyphenols

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化蘋果多酚的提取工藝

2.6.1回歸模型的建立及統(tǒng)計檢驗。響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項式回歸分析[17]，建立花牛蘋果幼果多酚提取率的模型，得到擬合多元二次響應(yīng)面回歸方程為

Y=11.52+0.14A-0.23B+0.22C+0.44D-0.79AB+0.47AC+0.62AD-0.12BC-0.71BD+0.023CD-2.07A2-0.96B2-2.38C2-1.48D2

對該模型進(jìn)行方差分析可知，回歸模型P<0.01，結(jié)果有顯著差異，說明模型有意義。失擬項P=0.116 6>0.05，表示無顯著性差異，說明模型擬合情況良好。回歸方程的二次項A2、B2、C2、D2的系數(shù)為負(fù)值，則該方程的拋物面開口朝下，具有極大值點，可以進(jìn)行最優(yōu)分析。由表3可知，一次項對蘋果多酚提取率的影響從大到小依次為提取溫度(D)、料液比(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、提取時間(A)，一次項超聲波提取溫度(D)對多酚提取率的影響達(dá)顯著水平，交互項提取時間和提取溫度(AD)、料液比和提取溫度(BD)達(dá)極顯著，提取時間和料液比(AB)、提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)(AC)為顯著水平，二次項影響均為極顯著，其他無顯著。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.6.2超聲波輔助提取蘋果多酚各因素間的交互作用。響應(yīng)面圖是反映響應(yīng)面在整個試驗交互作用下得到的結(jié)果，構(gòu)成三維空間曲面，可以預(yù)測和確定變量的交互作用。分析當(dāng)2個因素不變時，另外2個因素及其交互作用對多酚提取率的影響，各因素交互情況見圖6。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of ANOVA

圖6 兩因素交互作用對蘋果多酚提取率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the influence of the interaction of two factors on the extraction rate of apple polyphenols

由圖6a可知，固定料液比為1∶6，提取溫度為60 ℃，隨著提取時間的延長和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蘋果多酚提取率先增大后減少，且乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘋果多酚提取率的影響大于提取時間。由圖6b可知，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度為60 ℃，隨著提取時間的延長和料液比的增加，蘋果多酚提取率先增加后減少，料液比對蘋果多酚提取率的影響大于提取時間。由圖6c可知，固定料液比為1∶6，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，隨著提取時間的延長和提取溫度的升高，蘋果多酚提取率先增加后減少，提取溫度對蘋果多酚提取率的影響大于提取時間。由圖6d可知，固定提取時間為50 min，提取溫度為60 ℃，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的增大，蘋果多酚提取率先增加后減少，且乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘋果多酚提取率的影響大于料液比。由圖6e可以看出，固定提取時間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，隨著提取溫度的升高和料液比的增大，蘋果多酚提取率先增加后減少，且提取溫度對蘋果多酚提取率的影響大于料液比。由圖6f可知，固定提取時間為50 min，料液比為1∶6，隨著提取溫度的升高和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，蘋果多酚提取率先增加后減少，提取溫度對蘋果多酚提取率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。

該試驗通過研究超聲波功率、提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對蘋果多酚提取率的影響，使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計，優(yōu)化得出超聲波輔助提取花牛蘋果幼果中多酚的最佳工藝為：超聲波功率100 W，提取時間50.65 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70.67%，料液比1∶5.73，提取溫度62.39 ℃，蘋果多酚提取率為11.620 mg/g。但在實際工藝中為了操作方便，將工藝條件設(shè)置為超聲波功率100 W，提取時間51 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，料液比1∶6，提取溫度62 ℃，該條件下重復(fù)5次試驗驗證工藝的穩(wěn)定性，幼果多酚平均提取率為11.586 mg/g，這與理論預(yù)測值(11.620 mg/g)接近。可見，試驗設(shè)計優(yōu)化得到的花牛蘋果幼果多酚提取工藝條件準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論

該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助法提取蘋果多酚的工藝，建立蘋果多酚得率的二次多項數(shù)學(xué)模型。該模型極顯著，擬合情況良好。最佳工藝參數(shù)：超聲波功率100 W，提取時間51 min，提取溫度為62 ℃，料液比1∶6，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，蘋果多酚的提取率為11.586 mg/g。