蘆筍莖枯病菌致病機(jī)制的研究進(jìn)展

孫 強(qiáng)，趙 鳳，蘭 波，杜宜新，石妞妞，肖鴻勇，李湘民，陳洪凡，楊迎青*

(1.中華人民共和國黃島海關(guān)，山東青島 266555；2.中倉農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，山東青島 266555；3.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江西南昌 330200；4.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建福州 350012；5.江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江西南昌 330200)

蘆筍(AsparagusofficinalisLinn)又稱石刁柏，屬百合科(Liliaceae)天門冬屬(Asparagus)，是世界十大名菜之一，在國際市場上被稱為“蔬菜之王”。蘆筍由于其營養(yǎng)價值高，并具有潤肺、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑制腫瘤生長等功能，深受人們的喜愛[1- 2]。隨著蘆筍種植面積的逐年擴(kuò)大，病害的發(fā)生也逐年加重，尤其是莖枯病的普遍發(fā)生已嚴(yán)重影響了蘆筍的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。莖枯病的發(fā)生需要濕熱氣候條件，歐美蘆筍主產(chǎn)區(qū)均屬冷涼氣候，因此基本不發(fā)生，而中國、越南、泰國等亞洲國家則嚴(yán)重發(fā)生[4- 5]。長期以來，國內(nèi)外學(xué)者對蘆筍莖枯病進(jìn)行了多方面、多角度的研究，并取得了一些進(jìn)展[6-8]。葉琪明[9]從癥狀、病原菌、發(fā)生規(guī)律、抗性生理和病害防治等5個方面闡述了我國蘆筍莖枯病研究現(xiàn)狀。余智城等[10]就癥狀、病原菌、發(fā)生規(guī)律、抗性生理和病害防治等方面進(jìn)行了綜述。張岳平等[11]綜述了蘆筍重要真菌病害的研究進(jìn)展。鄭金龍等[12]綜述了蘆筍莖枯病及抗病育種的研究進(jìn)展。由于抗病育種進(jìn)展緩慢，近年來，越來越多學(xué)者開始將注意力轉(zhuǎn)移到蘆筍莖枯病菌致病機(jī)制的研究上，并取得了可喜的成果。因此，筆者著重從蘆筍莖枯病發(fā)病規(guī)律、病原菌侵染過程及其致病因子細(xì)胞壁降解酶3個方面綜述蘆筍莖枯病菌致病機(jī)制的最新研究進(jìn)展，旨在為蘆筍莖枯病抗性育種和有效防控提供依據(jù)。

1 蘆筍莖枯病發(fā)病規(guī)律

1.1 田塊條件與發(fā)病的關(guān)系不同土質(zhì)和地勢等田塊條件對蘆筍莖枯病發(fā)病的嚴(yán)重度有重要影響[13]。土質(zhì)黏度大、地勢低洼、排水不良等田塊條件均可導(dǎo)致田間積水，加快病原菌的傳播與擴(kuò)散。同時，田間積水易造成蘆筍長勢差、對病原菌的抵抗力下降，嚴(yán)重時還可造成爛根，加速蘆筍莖枯病的擴(kuò)展和蔓延，導(dǎo)致病情加重。土質(zhì)疏松、地勢較高、排灌條件良好等田塊條件可以有效防止田間積水，降低田間小氣候濕度，不利于病原菌分生孢子的傳播、擴(kuò)散和萌發(fā)，同時還可以促進(jìn)蘆筍的生長發(fā)育，增強(qiáng)對病原菌的抵抗力，降低病株率[14]。

1.2 溫濕度對發(fā)病的影響高溫、多雨的氣候條件易造成田間小氣候濕度過大，有利于蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak分生孢子的傳播、擴(kuò)散和侵染。田間定株系統(tǒng)觀察結(jié)果表明，蘆筍莖枯病的發(fā)生流行與溫濕度密切相關(guān)[15-17]。陳須文等[14]的研究結(jié)果表明，2月下旬至3月上旬，當(dāng)旬平均溫度高于8 ℃、相對濕度在77%以上時，出土的蘆筍母莖開始發(fā)病；當(dāng)旬平均溫度高于17 ℃、相對濕度在85%以上時，病原菌侵染和擴(kuò)散的速度加快；5—6月，當(dāng)旬平均溫度高于24 ℃、相對濕度達(dá)到96%以上時，病原菌侵染和擴(kuò)散的速度進(jìn)一步加快，進(jìn)入發(fā)病高峰期，病株率最高可超過90%，病情指數(shù)最高可超過60(圖1)。因此，應(yīng)在發(fā)病初期和盛期及時噴藥，控制此病擴(kuò)散和蔓延[18]。

1.3 品種與發(fā)病的關(guān)系不同蘆筍品種對莖枯病抗性存在較大差異[19]。TX-4/SD、UC 157、綠塔、16523-B、B4-a/B20-a、B2-a/SD、B3/TX-6等種質(zhì)資源對莖枯病的抗性較好，可用于抗病育種的親本材料，并在栽培中結(jié)合農(nóng)藝性狀選擇應(yīng)用以提高蘆筍對莖枯病的抗性，減少用藥次數(shù)和用藥量以節(jié)約成本和減少農(nóng)藥污染，促進(jìn)蘆筍產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展[20-22]。

圖1 蘆筍莖枯病田間嚴(yán)重發(fā)生Fig.1 Serious occurrence of asparagus stem blight stem blight in field

1.4 不同施肥方式對蘆筍莖枯病的影響蘆筍的長勢、抗病性和產(chǎn)量與不同施肥方式存在顯著相關(guān)性。過多施用氮肥，易造成枝葉過于繁茂，增加田間小氣候濕度，病害發(fā)生加重[14,17]。而施用腐復(fù)混肥，并合理配比氮、磷、鉀(N∶P∶K=1∶0.7∶1.4)，可有效促進(jìn)蘆筍生長，提高蘆筍的抗病性，病害發(fā)生較輕[14]。

2 蘆筍莖枯病菌的侵染過程

2.1 越冬孢子的釋放萌發(fā)蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak主要以分生孢子器在枯死的病殘體上越冬。蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak分生孢子的釋放期為4月26—7月30日，其中4月26—7月9日為釋放盛期。分生孢子在1%鮮蘆筍煎汁培養(yǎng)液中的萌發(fā)率為73.9%～97.2%，而在清水中幾乎不能萌發(fā)。分生孢子的釋放必須要有水露條件，在無水露的條件下則不能釋放[17]。

2.2 初侵染菌源田間沒有清除干凈遺留的越冬病殘體是翌年早春發(fā)病的主要初侵染菌源。試驗調(diào)查結(jié)果證明，田間蘆筍的發(fā)病期與越冬病殘體上分生孢子的釋放期幾乎一致。早春最初發(fā)現(xiàn)的莖枯病病株，多為田間沒有清除干凈遺留的越冬病殘體附近的筍株，大多在病殘體旁邊或者距離越冬病殘體20 cm以內(nèi)，發(fā)病筍株的病斑面與病殘體所在方向一般保持一致，且多在莖稈基部首先發(fā)病。田間沒有清除干凈病殘體的筍蔸往往成為早春莖枯病發(fā)生的發(fā)病中心[17]。

2.3 病害侵染循環(huán)在病殘體上越冬的分生孢子器，翌年春遇雨水或灌溉水釋放分生孢子并侵染蘆筍莖稈基部及葉尖等部位。蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak主要靠風(fēng)雨傳播，因此雨水較多的年份和季節(jié)發(fā)病也較重。病原菌從侵入到分生孢子器成熟釋放新的分生孢子為一個侵染周期，在23～27 ℃時侵染周期為10～12 d，在17～20 ℃時侵染周期為15～20 d。6—10月，蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak分生孢子在田間不斷擴(kuò)散、萌發(fā)、侵染形成新的發(fā)病中心，并持續(xù)不斷釋放分生孢子完成再侵染，導(dǎo)致田間病情逐漸加重[17]。筆者室內(nèi)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak 24 h內(nèi)產(chǎn)生芽管，24～36 h后長出菌絲，菌絲繼續(xù)生長，4 d后侵入寄主組織，8 d后開始形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，12 d后形成分生孢子器，16 d后分生孢子器釋放出分生孢子(α、β型孢子)(圖2);隨著侵染過程的推進(jìn)，其表觀癥狀逐漸明顯，相對發(fā)病面積逐漸增大(圖3)[23]。

2.4 病害消長動態(tài)據(jù)調(diào)查，5月上旬可在田間最早發(fā)現(xiàn)蘆筍莖枯病的發(fā)病株。蘆筍莖枯病在未采筍的幼株田及提前留母莖的成株采筍田發(fā)病較早。適時留母莖的采筍田在留母莖后10 d左右開始發(fā)病。7月下旬至8月上旬為病蘆筍莖枯病的發(fā)展期，田間平均病株率在5%～10%，平均病情指數(shù)在1%～5%。8月中旬后，隨降雨量的逐漸加大和氣溫的迅速升高，進(jìn)入蘆筍莖枯病的發(fā)生高峰期，田間出現(xiàn)大量枯死筍株[14]。

3 蘆筍莖枯病菌細(xì)胞壁降解酶

3.1 細(xì)胞壁降解酶種類根據(jù)作用蘆筍組織的不同，可將蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak降解酶分為角質(zhì)層降解酶(cutinase)和細(xì)胞壁降解酶(celll wall degrading enzymes)等酶類。根據(jù)作用底物的不同，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶又可細(xì)分為纖維素酶(cellulose)、半纖維素酶(hemicellulase)和果膠酶(pectic enzyme)等酶類。根據(jù)作用方式的不同，可將蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶分為裂解酶和水解酶等酶類[24-25]。常見的蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶主要有以下7種：多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(polymethylgalacturonase，PMG)、濾紙酶(filter paper enzyme，F(xiàn)PA)、果膠甲基酯酶(pectin methylesterase，PE)、果膠甲基反式消除酶(pectin methyltrans-eliminase，PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(polymethylgalacturonase trans-eliminas，PGTE)[23-24]。其中，多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、濾紙酶(FPA)和果膠甲基酯酶(PE)等細(xì)胞壁降解酶屬于水解酶，而果膠甲基反式消除酶(PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)等細(xì)胞壁降解酶屬于裂解酶[25-27]。

圖2 蘆筍莖枯病菌侵染過程[23]Fig.2 Infection process of asparagus stem blight fungus[23]

圖3 蘆筍莖枯病菌侵染過程中的癥狀和病情[23]Fig.3 Symptom and disease severity of asparagus stem blight fungus in the infection process[23]

3.2 細(xì)胞壁降解酶的提取及純化

3.2.1離體培養(yǎng)液中細(xì)胞壁降解酶的提取。蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶的離體培養(yǎng)一般是在改良的Marcus培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)6～8 d后進(jìn)行提取和純化[23-24]。主要方法為：① 將蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉培養(yǎng)基(PDA)平板上培養(yǎng)5～8 d。② 用5或7 mm打孔器在平板菌落邊緣打孔，挑取5～8塊菌絲塊置于裝有50～100 mL改良Marcus培養(yǎng)液的250 mL量程的三角瓶中，靜置培養(yǎng)6～8 d。③ 首先用3層紗布過濾以除去菌絲塊和菌絲等雜質(zhì)，然后再經(jīng)過雙層濾紙抽濾以繼續(xù)除去雜質(zhì)。④ 4 ℃、11 000～13 000 r/min下離心10～20 min，留上清(粗酶液)。⑤ 在粗酶液中加60%飽和度的(NH4)2SO4，4 ℃下靜置24～48 h，然后4 ℃、11 000～13 000 r/min下離心10～20 min，棄上清液。⑥ 用適量50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液溶解沉淀，在HAc-NaAc緩沖液中透析24～48 h，期間換2～4次50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，得到的酶液于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹23-24]。

3.2.2組織內(nèi)細(xì)胞壁降解酶的提取。從人工接種發(fā)病的蘆筍莖稈切取具有典型癥狀的病組織。每克鮮組織中加入5 mL 0.25 mol/L NaCl提取液(用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制，pH 8.0)，加5～8粒石英砂或不銹鋼研磨珠，在冰浴中研磨。首先用3層紗布過濾以去除組織、石英砂或不銹鋼研磨珠等雜質(zhì)，然后再經(jīng)過雙層濾紙抽濾繼續(xù)去除雜質(zhì)；在4 ℃、12 000 r/min下離心10～20 min，取上清液，即為粗酶液，粗酶液中加60%飽和度的(NH4)2SO4，4 ℃下靜置24～48 h，然后4 ℃、11 000～13 000 r/min下離心10～20 min，棄上清液。用適量50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液溶解沉淀，在HAc-NaAc緩沖液中透析24～48 h，期間換2～4次50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，得到的酶液于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹25,28-29]。

3.3 蘆筍莖枯病菌細(xì)胞壁降解酶活性

3.3.1幾種主要細(xì)胞壁降解酶活性的測定。分別繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線、D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得相應(yīng)一次回歸方程。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計算細(xì)胞壁降解酶濃度，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計算β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和濾紙酶(FPA)等酶類的活性，D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計算多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)等酶類活性。用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak待測酶液的OD540值，用OD540值大小反應(yīng)酶反應(yīng)所釋放的還原糖量，OD540值代入一次回歸方程，分別計算多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和濾紙酶(FPA)等酶類的活性[30]；利用NaOH滴定法測定膠甲基酯酶(PE)等酶類的活性，根據(jù)酶作用后所釋放的羧基數(shù)量來確定酶活性[31]；測定果膠甲基反式消除酶(PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)等酶類的OD232值，并據(jù)此計算其活性[25,28]。

3.3.2蘆筍莖枯病菌細(xì)胞壁降解酶活性研究進(jìn)展。蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶中以多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)3種酶的活性較高，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)等酶類屬于果膠酶，β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)等酶類屬于纖維素酶[23,27]。筆者利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定了7種蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak常見細(xì)胞壁降解酶的活性，明確了不同底物對3種主要酶的誘導(dǎo)效果，從溫度、時間和pH 3個方面對蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak幾種主要細(xì)胞壁降解酶的活性測定條件進(jìn)行了優(yōu)化。7種蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶中，以多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性較高，其次是果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)，其他4種酶的活性較低。在3種蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak主要細(xì)胞壁降解酶中，β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)以1%CMC作為底物進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶量較多，多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)則以1%果膠作為底物進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶量較多。在50 ℃下測定β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)活性的效果較好，在50～60 ℃下測定多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的效果較好，在60 ℃測定果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)酶活性的效果較好；反應(yīng)50 min后測定β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)酶活性的效果較好，反應(yīng)60 min后測定多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)2種細(xì)胞壁降解酶活性的效果較好；pH 4.0下測定β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的效果較好，pH 8.0下測定果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)的效果較好[23-24]。

3.4 細(xì)胞壁降解酶生理學(xué)研究蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶對蘆筍組織具有重要的損傷作用[23]。筆者從滲透性還原單糖量釋放和相對電導(dǎo)率增大量等方面，測定了蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶對蘆筍組織的浸解作用。蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶浸解蘆筍組織28 h后，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶能夠顯著提高滲透性還原單糖的量。隨著蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶濃度的增大，釋放的滲透性還原單糖的量逐漸增大。說明隨著蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶濃度的增大，其造成的蘆筍組織損傷嚴(yán)重程度逐漸增加。通過相對電導(dǎo)率的測定，明確了蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶對蘆筍組織細(xì)胞膜的損傷作用。隨著蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶濃度的增大，測得的相對電導(dǎo)率逐漸增大。說明蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶濃度越大，其對蘆筍組織細(xì)胞膜造成的損傷程度越大[23]。

4 展望

近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)識到研究植物病原真菌致病機(jī)制的重要性，并著手從發(fā)病規(guī)律、侵染過程和致病因子等方面進(jìn)行了較為深入的探討。蘆筍莖枯病是一種區(qū)域性分布的毀滅性病害，俗稱“蘆筍癌癥”。其發(fā)病規(guī)律、侵染方式及過程目前已經(jīng)明確。細(xì)胞壁降解酶作為蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak的一個重要致病因子，其對蘆筍組織具有重要損傷作用，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究和探討。目前關(guān)于蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細(xì)胞壁降解酶的研究多圍繞酶活性、細(xì)胞器損傷等方面展開，在細(xì)胞壁降解酶的分離、相關(guān)酶成分等電點(diǎn)測定、疏水性等各種蛋白學(xué)方面的研究較少。此外，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak主要細(xì)胞壁降解酶調(diào)控基因的研究鮮見報道，有待進(jìn)一步的深入研究。總之，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak致病機(jī)理的闡明，對于蘆筍莖枯病抗性育種及有針對性進(jìn)行防治具有重要的理論和實(shí)踐意義，也充分展現(xiàn)了其廣闊的應(yīng)用前景。