張小云,劉 本,連建春,姜玉章,唐朝貴,王 霞
(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安一院檢驗(yàn)科,江蘇 淮安 223300)
血流感染(blood stream infection,BSI)是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重感染性疾病,具有起病急、病死率高的特點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-5],早期適當(dāng)?shù)目咕幬镏委熆梢愿纳蒲鞲腥净颊叩念A(yù)后,而每延遲1 h 治療,患者死亡率會(huì)增加9%,而血培養(yǎng)為診斷血流感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”,其血液培養(yǎng)陽(yáng)性的周轉(zhuǎn)時(shí)間(turn-around time,TAT),即抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果是72~96 h。因此,改進(jìn)方法縮短微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間是目前微生物學(xué)檢驗(yàn)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。研究發(fā)現(xiàn)[6],利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)可對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行快速直接鑒定且具有較高的準(zhǔn)確性。歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)已經(jīng)提出了抗微生物快速藥敏試驗(yàn)(rapid drug sensitivity test,RAST),該方法是從陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中取出標(biāo)本直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[7,8]。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS 對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速菌種鑒定,同時(shí)參考EUCAST 中血培養(yǎng)RAST 方法對(duì)腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌的血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行藥敏試驗(yàn),并將結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌鑒定和MIC 藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,為建立血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本快速鑒定及藥敏試驗(yàn)方法提供依據(jù)。
1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安一院檢驗(yàn)科微生物室2021 年8 月-2022 年3 月血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本共133 份(報(bào)警時(shí)間<48 h),將同一人的同一天報(bào)警的重復(fù)標(biāo)本及2 種以上菌混合感染的標(biāo)本剔除。
1.2 儀器試劑 Bactec FX 全自動(dòng)血培養(yǎng)儀和血培養(yǎng)瓶(美國(guó)BD 公司)、真空采血管(浙江龔東醫(yī)療器械有限公司)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀(法國(guó)生物梅里埃有限公司)、瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)、藥敏紙片(賽默飛世爾科技<中國(guó)>有限公司)、細(xì)菌培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技<中國(guó)>有限公司);全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK2 Compact(法國(guó)梅里埃生物有限公司)、離心機(jī)(賽默飛世爾科技<中國(guó)>有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本快速鑒定及藥敏試驗(yàn)①Vitek MS快速鑒定細(xì)菌:血培養(yǎng)瓶陽(yáng)性報(bào)警后,取出血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色,當(dāng)鏡下顯示單一革蘭陰性桿菌時(shí)取1 ml 陽(yáng)性血培養(yǎng)標(biāo)本置于1.5 ml EP管,離心管中加入200 μl 5% SDS 溶液充分混勻,13 000 r/min 離心2 min,棄去上清液,加入1000 μl無(wú)菌蒸餾水,充分混勻管內(nèi)懸液,13 000 r/min 離心2 min,棄去上清液,得到沉淀,取0.5 μl 沉淀點(diǎn)樣至金屬靶板,加1 μl 基質(zhì)液,待靶板干燥后進(jìn)行快速鑒定,質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC8739 與產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048;②陽(yáng)性血培養(yǎng)液RAST 快速藥敏鑒定:以質(zhì)譜快速鑒定結(jié)果為革蘭陰性細(xì)菌的血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本作為RAST 的研究對(duì)象。參考2018 年EUCAST 公布的陽(yáng)性血培養(yǎng)液RAST 方法[9],從血培養(yǎng)瓶中直接吸取100 μl 培養(yǎng)液至直徑90 mm 的M-H 平板上,均勻涂布平板后貼上抗菌藥物紙片。質(zhì)譜快速鑒定為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的藥敏紙片包括慶大霉素(CN,10 μg)、頭孢噻肟(CTX,5 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP,36 μg/6 μg)、頭孢他啶(CAZ,10 μg)、美羅培南(MEN,10 μg)、阿米卡星(AK,30 μg)、環(huán)丙沙星(CIP,5 μg),妥布霉素(TOB,10 μg);銅綠假單胞菌的藥敏紙片包括慶大霉素(CN,10 μg)、亞胺培南(IPM,10 μg)、頭孢噻肟(CTX,5 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP,36 μg/6 μg)、美羅培南(MEN,10 μg)、阿米卡星(AK,30 μg)、環(huán)丙沙星(CIP,5 μg),妥布霉素(TOB,10 μg),35 ℃溫育4、6、8 h 后,分別量取抑菌圈直徑,根據(jù)指南中不同細(xì)菌在不同時(shí)間的快速藥敏折點(diǎn)判讀藥敏結(jié)果,質(zhì)控菌株為大腸埃希ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。
1.3.2 血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本常規(guī)鑒定及藥敏試驗(yàn) 當(dāng)血培養(yǎng)儀提示陽(yáng)性報(bào)警時(shí),取出陽(yáng)性瓶進(jìn)行革蘭染色并轉(zhuǎn)種至相應(yīng)的平板,分離出的單個(gè)菌落采用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。同時(shí)選擇相應(yīng)的藥敏卡通過(guò)VITEK 2 Compact 進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。
1.3.3 藥敏結(jié)果比較 比較RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果的一致性,判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:①結(jié)果符合(categorial agreement,CA):常規(guī)藥敏結(jié)果顯示為敏感(或耐藥),RAST 結(jié)果也為敏感(或耐藥);②錯(cuò)誤(error,Er):包括以下3 種情況:非常重大錯(cuò)誤(very major errors,VME):假敏感,即常規(guī)藥敏結(jié)果判定為耐藥,RAST 結(jié)果為敏感;重大錯(cuò)誤(major errors,ME):假耐藥,即常規(guī)藥敏結(jié)果判定為敏感,RAST 結(jié)果為耐藥;微小錯(cuò)誤(minor errors,mE):常規(guī)藥敏結(jié)果判定為中介,RAST 結(jié)果為敏感或耐藥。無(wú)ATU 結(jié)果的判讀及比較。
2.1 Vitek MS 快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較 共分離出革蘭陰性菌133 株。直接鑒定與培養(yǎng)后菌落Vitek MS 鑒定結(jié)果符合率為91.73%(122/133),其中鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率最高,為100.00%(12/12),陰溝腸桿菌最低,為66.67%(6/9),見(jiàn)表1。
表1 Vitek MS 快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較[n(%)]
2.2 RAST 藥敏結(jié)果判讀 共對(duì)94 株革蘭陰性細(xì)菌RAST 結(jié)果進(jìn)行研究,所有藥物CA 比例在4、6、8 h間呈現(xiàn)逐漸升高現(xiàn)象。在8 h 時(shí)除了TZP 和MEM,其他藥物CA 均高于可接受值(CA>90%);94 例革蘭陰性桿菌中僅有1 例銅綠假單胞菌對(duì)TZP 的藥敏結(jié)果在6、8 h 時(shí)為VME,1 例大腸埃希菌對(duì)TZP、AK 在4、6、8 h 時(shí)為ME,2 例肺炎克雷伯菌的TZP、CAZ 在4、6、8 h 時(shí)為ME,1 例銅綠假單胞菌的TOB 和CN 在6、8 h 時(shí)為mE,見(jiàn)表2~表4。
表2 大腸埃希菌RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果一致性比較[n(%)]
表3 肺炎克雷伯菌RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果一致性比較[n(%)]
表4 銅綠假單胞菌RAST 藥敏結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果一致性比較[n(%)]
血流感染是引起患者死亡的主要因素之一,早期且準(zhǔn)確的病原學(xué)檢測(cè)和藥敏結(jié)果對(duì)患者的診治十分重要。MALDI-TOF-MS 是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型細(xì)菌鑒定技術(shù),可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)菌及真菌菌種鑒定,對(duì)培養(yǎng)后菌落的鑒定技術(shù)在臨床已應(yīng)用成熟。且菌落鑒定技術(shù)成本也遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)生化鑒定,極大縮短了菌株的鑒定時(shí)間[10]。現(xiàn)階段MALDITOF-MS 技術(shù)對(duì)于標(biāo)本的直接鑒定仍然為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的難點(diǎn)之一。采用不同方法處理血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本后質(zhì)譜直接鑒定的研究一直在不斷的改進(jìn)中,不同的前處理方法可直接影響細(xì)菌鑒定效果及結(jié)果的判定[11,12]。本研究中血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警標(biāo)本采用5% SDS(十二烷基硫酸鈉)法處理后進(jìn)行直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,鑒定符合率為91.73%,與王巖等[13]研究報(bào)道的結(jié)果接近,且鑒定結(jié)果報(bào)告在1 h 以內(nèi),可為臨床早期經(jīng)驗(yàn)性用藥及后續(xù)快速藥敏結(jié)果判讀提供快速可靠的病原學(xué)依據(jù)。
陽(yáng)性血培養(yǎng)液快速藥敏試驗(yàn)近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[14]。Sakarikou C 等[15]將陽(yáng)性血培養(yǎng)液預(yù)處理后制備成0.5 麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?,使用全自?dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact 進(jìn)行藥敏試驗(yàn),但此法耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng),獲得最終藥敏結(jié)果需18~24 h。Weme ET[16]利用分子生物學(xué)方法快速檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因,但檢測(cè)成本較高,不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展。Faria-Ramos I 等[17]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)菌的代謝參數(shù)進(jìn)行檢測(cè),可在3 h內(nèi)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性,但此法方法需要特殊儀器,一般實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。2018 年4 月EUCAST 發(fā)布了陽(yáng)性血培養(yǎng)液RAST 及折點(diǎn),該方法是從陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中取出標(biāo)本直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn),操作簡(jiǎn)單、成本低、耗時(shí)短,易于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展,目前革蘭陰性桿菌中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌可進(jìn)行RAST,藥敏結(jié)果最早可在4 h 內(nèi)解讀。
本研究結(jié)果顯示,肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌的RAST 中的所有藥物CA 比例在4、6、8 h 3 個(gè)點(diǎn)呈現(xiàn)逐漸升高現(xiàn)象。在8 h 除了TZP和MEM 兩種藥物,其他藥物CA 比例均高于可接受值(>90%)。94 例革蘭陰性桿菌中僅有1 例銅綠假單胞菌對(duì)TZP 的藥敏結(jié)果在6、8 h 時(shí)判讀為VME,有1 例大腸埃希菌菌對(duì)TZP、AK 在4、6、8 h 時(shí)判讀為ME,1 例肺炎克雷伯菌對(duì)TZP、CAZ 在4、6、8 h時(shí)判讀為ME,1 例銅綠假單胞菌對(duì)TOB 和CN 在6、8 h 時(shí)判讀為mE。不同抗菌藥物在不同時(shí)間點(diǎn)判讀的藥敏CA 比例有所差別。陸燕飛等[18]研究報(bào)道,應(yīng)用RAST 在6 h 判讀腸桿菌目細(xì)菌藥敏結(jié)果時(shí),TZP 和MEM 分別表現(xiàn)出最低和最高的CA(91.10%vs98.90%)。本研究發(fā)現(xiàn),6、8 h 的TZP 藥敏判讀結(jié)果CA 最低,與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。雖然本研究檢測(cè)到相比4 h,6 h 時(shí)大部分藥物的CA 升高,但在6 h時(shí)TZP、MEM 及TOB 的ATU 比例仍然較高,CA<90%,所以建議藥敏結(jié)果報(bào)告必須在8 h 評(píng)估后提交。在本研究中,大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)TZP、銅綠假單胞菌對(duì)MEM 的CA<90%,這兩種抗生素的CA 比例較低,與部分研究結(jié)果相似[19]。Soo YT 等[20]對(duì)148 例陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶RAST 和Vitek-2檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示在8 h 時(shí)無(wú)VME,ME 檢出率在3.3%~18.2%。與其報(bào)道的高M(jìn)E 率相反,在本研究?jī)H4 株菌株出現(xiàn)ME,1 株菌株出現(xiàn)mE。Martins A 等[21]檢測(cè)36 株大腸桿菌和25 株肺炎克雷伯菌4 h 和6 h 對(duì)8 種抗菌藥物的RAST 結(jié)果,發(fā)現(xiàn)CIP 和CTX 的ME 大于3%,在6 h 對(duì)AK和TZP 的mE 各為34.4%和21.6%,該研究建議RAST 可以代替除AK 以外的其他抗生素的傳統(tǒng)藥敏方法。本研究中,在8 h 時(shí)除TZP 和MEM 外,其他CA 均在可接受范圍內(nèi),因此本研究建議對(duì)于革蘭陰性桿菌的RAST 應(yīng)謹(jǐn)慎使用TZP 和MEM 檢測(cè)結(jié)果。這可能與本次選取的菌株數(shù)量不同及本地區(qū)的細(xì)菌耐藥性分布不同所致,后續(xù)需要更多的血培養(yǎng)陽(yáng)性培養(yǎng)液RAST 的數(shù)據(jù)資料來(lái)驗(yàn)證。
本研究不足:本研究中血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶培養(yǎng)液RAST 分析的數(shù)量不多,且未對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的RAST進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步收集更多臨床血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本進(jìn)行RAST 研究來(lái)解決。且RAST 方法本身也存在局限性,該方法不能對(duì)革蘭氏染色后多種細(xì)菌混合感染標(biāo)本及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。在測(cè)量早期時(shí)間點(diǎn)的抑制區(qū)域,特別是4 h,由于在顯影邊緣細(xì)菌生長(zhǎng)容易造成人為檢測(cè)錯(cuò)誤?;赗AST 研究應(yīng)該增加多中心研究,這將有助于獲得更多可靠的結(jié)果。
綜上所述,革蘭陰性桿菌血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本采用5% SDS 沉淀法對(duì)樣本進(jìn)行前處理后采用MALDITOF MS 直接鑒定細(xì)菌準(zhǔn)確性較高。在重癥感染患者,尤其是敗血癥患者早期及時(shí)提供藥敏結(jié)果進(jìn)行治療是非常重要的。許多新的技術(shù)方法旨在實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),但在資源有限的實(shí)驗(yàn)室中不適用。使用RAST 方法是一個(gè)切實(shí)可行的方法,在日常工作流程中可以實(shí)現(xiàn),使血培養(yǎng)陽(yáng)性的TAT 大大減少。根據(jù)RAST 結(jié)果可以指導(dǎo)臨床用藥,及時(shí)升級(jí)或降級(jí)抗生素治療,這將有助改善重癥患者的預(yù)后。然而該方法是勞動(dòng)密集型方法,要求每4、6、8 h 閱讀一次結(jié)果,因此,建議將8 h 作為單一的時(shí)間點(diǎn)閱讀并報(bào)告結(jié)果最為準(zhǔn)確。隨著研究的不斷深入,標(biāo)本前處理方法的不斷完善,MALDI-TOF-MS 細(xì)菌直接鑒定及RAST 的應(yīng)用將會(huì)為臨床重癥感染患者的診治提供更好的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和幫助。