基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃連溫膽湯治療失眠的作用機(jī)制

劉 蘭，張遠(yuǎn)哲，陳 銘

（1.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

黃連溫膽湯出自清代陸廷珍《六因條辨》卷上，源于宋代陳言的《三因極一病癥方論》中溫膽湯去大棗加黃連而成，主治“傷暑汗出，身不大熱，煩閉欲嘔，舌黃膩。”黃連溫膽湯由8 味藥物組成，分別為黃連、竹茹、枳實(shí)、半夏、陳皮、茯苓、甘草及生姜，具有疏理氣機(jī)、通利三焦、清熱化濕等功效[1]，臨床常用于失眠、高血壓、糖尿病、胃炎等疾病的治療[2-4]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)黃連溫膽湯治療失眠的核心靶點(diǎn)和主要化合物進(jìn)行分析，以期對(duì)黃連溫膽湯治療失眠的可能機(jī)制做出預(yù)測(cè)，為后續(xù)臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃連溫膽湯的中藥化學(xué)成分信息收集 綜合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）和中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集“黃連、竹茹、枳實(shí)、半夏、陳皮、茯苓、甘草、生姜”8 味中藥的化合物成分。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類(lèi)藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 進(jìn)行閾值篩選，得到相關(guān)中藥有效成分信息。

1.2 黃連溫膽湯中藥靶點(diǎn)的獲取 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取對(duì)應(yīng)靶標(biāo)蛋白名稱。登錄UNIPROT 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定生物物種為“HUMAN”，數(shù)據(jù)類(lèi)型為“REVIEWED”，獲取所有基因名稱及UNIPROTKB。

1.3 疾病靶點(diǎn)的獲取 分別在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)以“insomnia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取失眠相關(guān)基因。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選 將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homo sapiens（人類(lèi)）”，分析蛋白互作關(guān)系，并將結(jié)果以tsv 格式導(dǎo)出。將導(dǎo)出結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.2軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用“Network Analyzer”工具，篩選Degree 值、中心性（closeness centrality）、介數(shù)（betweenness centrality）、特征向量（eigenvector centrality）、局部平均聯(lián)通（LAC）分別大于各自中位數(shù)的靶點(diǎn)，從而獲得關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 黃連溫膽湯主要活性成分的篩選 通過(guò)TCMSP、TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，而后匹配疾病基因后去重，共篩選到黃連溫膽湯活性成分：黃連11 個(gè)、茯苓4 個(gè)、半夏10 個(gè)、枳實(shí)19 個(gè)、甘草85個(gè)、生姜3 個(gè)、陳皮5 個(gè)，竹茹0 個(gè)。通過(guò)CytoNCA軟件對(duì)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到有效成分的Degree 值，篩選出Degree 值大于中位值前8 位的有效成分，列出其對(duì)應(yīng)的藥物、主要相關(guān)的藥物ID 與成分信息，見(jiàn)表1。

表1 黃連溫膽湯的主要活性成分表

2.2 黃連溫膽湯與失眠共有靶點(diǎn)的韋恩圖及主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到疾病相關(guān)靶點(diǎn)2587 個(gè)，TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到26 個(gè)，兩數(shù)據(jù)庫(kù)去重后得到疾病靶點(diǎn)共2595 個(gè)。通過(guò)檢索得到黃連溫膽湯主要成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)252 個(gè)，疾病靶點(diǎn)2595 個(gè)，共有靶點(diǎn)117 個(gè)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 疾病與藥物交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 中藥-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 對(duì)117 個(gè)交集基因根據(jù)Degree 值、BC、CC、EC、LAC 篩選得到4 個(gè)核心靶點(diǎn)：IL6、IL1B、TNF、AKT1，見(jiàn)圖3。4 個(gè)核心靶點(diǎn)主要存在于黃連、枳實(shí)、甘草3 味中藥中，主要對(duì)應(yīng)成分有quercetin、luteolin、kaempferol 等，見(jiàn)表2。

表2 黃連溫膽湯治療失眠的核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)藥物、成分表

圖3 黃連溫膽湯治療失眠的靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 黃連溫膽湯治療失眠的靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)圖（續(xù)）

3 討論

失眠（insomnia）是一種常見(jiàn)的臨床疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病最常見(jiàn)的睡眠障礙之一，其特點(diǎn)是難以啟動(dòng)或保持睡眠，并伴有清醒時(shí)的煩躁或疲勞等癥狀[5，6]。中醫(yī)辨證論治失眠的方劑眾多且療效俱佳，不良反應(yīng)輕，如歸脾湯、酸棗仁湯、黃連溫膽湯等?，F(xiàn)代藥理研究表明[7-9]，黃連溫膽湯具有降脂、降糖、抗炎等作用，廣泛用于心血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等疾病的治療。

本研究分析后得到黃連溫膽湯治療失眠的4 個(gè)核心蛋白，分別為IL6、IL1B、TNF、AKT1。IL6 是一種多功能細(xì)胞因子，具有明確的促炎癥和抗炎特性，有研究表明[10，11]，睡眠障礙患者夜間血清IL6 濃度明顯增加。IL1B 為一類(lèi)強(qiáng)力促炎細(xì)胞因子，在機(jī)體主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，研究顯示[12]，IL1B 水平下降與失眠認(rèn)知行為治療后睡眠質(zhì)量的改善有關(guān)。TNF 是哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介導(dǎo)劑和調(diào)節(jié)劑，在白天過(guò)度嗜睡的相關(guān)疾病中，促炎細(xì)胞因子IL6 或TNF會(huì)升高[13，14]，這說(shuō)明失眠的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)，慢性失眠癥患者的炎癥介質(zhì)血清水平顯著升高。AKT1是AKT 激酶的3 種激酶之一，目前暫未查閱到相關(guān)研究直接證實(shí)AKT1 可影響睡眠，但有相關(guān)報(bào)道黃花菜可通過(guò)影響果蠅的mRNA 表達(dá)來(lái)改善睡眠，其核心靶點(diǎn)為AKT1、Cat 和Sod[15]。結(jié)合黃連溫膽湯的藥物組成，4 個(gè)核心基因皆存在于中藥黃連與甘草中，黃連的主要成分小檗堿有明顯的抗炎作用，且小檗堿的抗炎作用可能與抑制IL6 和TNF 等炎癥因子的活性有關(guān)[16]；而甘草中的類(lèi)黃酮化合物也可以發(fā)揮抗菌、抗炎的作用[17]。由上可知，失眠的發(fā)生與治療與炎癥水平密切相關(guān)，臨床可通過(guò)抑制失眠患者的炎癥介質(zhì)血清水平從而改善失眠癥狀，減輕不良反應(yīng)[18，19]。黃連溫膽湯中主要化合物成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚，皆屬于類(lèi)黃酮化合物，能與血清素系統(tǒng)相互作用，作為鎮(zhèn)定劑使用和治療失眠[20]。在黃花菜通過(guò)影響果蠅的mRNA 表達(dá)來(lái)改善睡眠的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素、山奈酚和咖啡酸是黃花菜改善睡眠的主要活性成分[15]。其中，槲皮素為藥物黃連的核心成分，具有催眠活性，可通過(guò)血清素能系統(tǒng)增強(qiáng)戊巴比妥的催眠作用[21]。而木犀草素具有神經(jīng)保護(hù)作用，能降低戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠小鼠的睡眠潛伏期，增加睡眠時(shí)間，減少喚醒時(shí)間。

綜上所述，失眠與促炎因子的升高有關(guān)，而黃連溫膽湯治療失眠的可能機(jī)制為抑制失眠患者的炎癥介質(zhì)血清水平。此外，黃連溫膽湯的三大關(guān)鍵成分皆屬于類(lèi)黃酮化合物，具有催眠活性，可誘導(dǎo)睡眠。盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為挖掘中醫(yī)藥的內(nèi)涵，發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)，推動(dòng)中藥新藥研發(fā)提供有力手段，但由于中藥藥效學(xué)方面研究不足、數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源單一、數(shù)據(jù)庫(kù)更新緩慢、已知疾病種類(lèi)及靶點(diǎn)有限等問(wèn)題，其結(jié)果仍需進(jìn)一步的藥理學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。