miR-200c 對顱咽管瘤侵襲性的影響及作用機(jī)制

張道寶，徐建國

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610000；2.樂山市人民醫(yī)院腦血管病科，四川 樂山 614000）

顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，任何年齡均可發(fā)病，但其常見的發(fā)病年齡呈雙峰分布，主要有6～14 歲和50～70 歲2個(gè)高發(fā)年齡段，同時(shí)顱咽管瘤是兒童最常見的鞍區(qū)占位性病變。該病可分為2 種亞型，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma，ACP）和鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤（papillary craniopharyngioma，PCP）。顱咽管瘤雖為良性腫瘤，但有著與惡性腫瘤相似的臨床特征。術(shù)后易復(fù)發(fā)是顱咽管瘤，特別是造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的一個(gè)重要特點(diǎn)。microRNAs（miRNAs）是一類廣泛存在于動植物等真核生物中的非編碼RNA。microRNAs 的長度一般為21～23 個(gè)核苷酸，因不含有開放式閱讀框架，不能翻譯成蛋白質(zhì)進(jìn)行基因表達(dá)。他們通過堿基對互補(bǔ)的方式與靶基因結(jié)合，可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。miRNA-200 家族在許多腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)起到了重要作用。據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，在卵巢癌、乳腺癌、腦膜瘤等多種腫瘤中，miRNA-200家族的表達(dá)明顯低于其在正常組織中的表達(dá)。在一些腫瘤中，miRNA-200 家族的下調(diào)還預(yù)示患者的總體生存率降低及對化療反應(yīng)不敏感[1]。2010 年四川大學(xué)華西醫(yī)院徐建國等[2]利用原代培養(yǎng)建立了能穩(wěn)定傳代的顱咽管瘤細(xì)胞系，為開展顱咽管瘤的基礎(chǔ)研究提供了新的方法。本研究擬初步探討miRNA-200家族在顱咽管瘤中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 原代細(xì)胞培養(yǎng)所需標(biāo)本來自2017 年6 月-2018 年12 月在四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的無菌新鮮顱咽管瘤組織各5 例。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 SYBR Green PCR 試劑盒（Ther mo，F(xiàn)-415XL），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，#K1622），β -actin（abcam，ab8226），E -cadherin（abcam，ab1416），β-catenin（abcam，ab32572），HRP 標(biāo)記山羊抗兔（武漢三鷹，SA00001-2），HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠（武漢三鷹，SA00001-1），Transwell（BD Biosciences，353097），SYBR Green PCR 試劑盒（Thermo，F(xiàn)-415XL），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，#K1622）。

1.3 方法 PCP 組為正常培養(yǎng)的鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞。ACP 組為正常培養(yǎng)的造釉細(xì)胞型顱咽管瘤原代細(xì)胞。

1.3.1 Q-PCR 檢測原代細(xì)胞的miRNA-200 家族各亞型表達(dá) 先行miRNA 的引物設(shè)計(jì)，再行RNA 提取，在細(xì)胞中加入0.25%胰蛋白酶1 ml 收集沉淀。分別加入相應(yīng)量的Trizol 裂解液在沉淀細(xì)胞中裂解細(xì)胞，向離心管中加入預(yù)冷的氯仿（200 μl 氯仿/1 ml Trizol），離心機(jī)離心（4 ℃，12000 g）15 min；用20 μl DEPC 處理水溶解RNA，放在-20 ℃冰箱中保存待用。按照試劑盒操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA、PCR 擴(kuò)增。

1.3.2 Transwell 檢測原代細(xì)胞的侵襲能力 先用0.25%胰酶消化收集，用離心機(jī)離心，PBS 液潤洗；用無血清的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；預(yù)先將800 μl 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基（含雙抗）加入24 孔板中，將其放入Transwell 小室，等Matrigel 干成膠狀后，依次接入200 μl 各組細(xì)胞懸液在Transwell 上室。對于上室一側(cè)未遷移的細(xì)胞，用干凈的棉球?qū)⑵洳粮蓛?，然后用濃度?0%的甲醇溶液固定細(xì)胞30 min。小心切下膜，在膜上滴一滴5%結(jié)晶紫染液，室溫中放置20 min，PBS 清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 免疫熒光及WB 檢測原代細(xì)胞中β-catenin 和E-cadherin 的表達(dá) 第1 天：固定爬片15 min（4%的多聚甲醛），0.5%Triton X-100（PBS 配制）在室溫通透，時(shí)間控制在20 min 左右；在玻片上滴加正常山羊血清，室溫下封閉，時(shí)間約30 min；將足量稀釋好的一抗滴加在每張玻片上，將所有玻片放入濕盒，將溫度調(diào)至4 ℃，孵育過夜。第2 天：加熒光二抗：PBST 重復(fù)浸洗爬片，滴加稀釋好的熒光二抗，將玻片放入濕盒中，在20 ℃～37 ℃的溫度下孵育1 h，再次用PBST 浸洗切片。復(fù)染核：滴加DAPI 在黑暗處孵育，對標(biāo)本進(jìn)行染核；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.4 造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞檢測 通過對造釉細(xì)胞型顱咽管瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞過表達(dá)和敲低miR-200c，研究miR-200c 對造釉細(xì)胞型顱咽管瘤侵襲性的影響及作用機(jī)制：A：造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞+miRNA control；B：造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞+miR-200c mimic；C：造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞+miR-200c inhibitor。Q-PCR 檢測各組造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞中的miRNA-200c 表達(dá)差異，Transwell檢測miR-200c 對造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞侵襲能力的影響；免疫熒光及WB 檢測各組細(xì)胞E-cadherin和β-catenin 的表達(dá)，操作步驟同原代細(xì)胞檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以（）表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的LSD 法（最小顯著性法），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 miR-200 家族在顱咽管瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)情況

2.1.1 Q-PCR 檢測兩組原代細(xì)胞的miRNA-200 家族各亞型表達(dá) 與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞相比，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤組中miRNA-200 家族表達(dá)呈整體下降趨勢，其中miRNA-200c 的下降最為明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著（P＜0.001），見圖1。

圖1 造釉細(xì)胞型顱咽管瘤及鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞各亞型miRNA 的表達(dá)水平

2.1.2 Transwell 檢測兩組原代細(xì)胞的侵襲能力 結(jié)晶紫的染色結(jié)果可以看到造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中穿過膜的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤的細(xì)胞，見圖2A、圖2B；造釉細(xì)胞型顱咽管瘤穿過膜的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤的細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C，說明造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的細(xì)胞比鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤的細(xì)胞更有侵襲性。

圖2 Transwell 檢測ACP 和PCP 原代細(xì)胞的侵襲能力

2.1.3 免疫熒光檢測兩組原代細(xì)胞中β-catenin 的表達(dá)差異 以DAPI 染核進(jìn)行定位。從Merge 的結(jié)果來看，β-catenin 在鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤中的表達(dá)主要在細(xì)胞膜上，而造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中的表達(dá)主要在細(xì)胞核中，見圖3。

圖3 免疫熒光檢測ACP 和PCP 原代細(xì)胞β-catenin 的表達(dá)

2.1.4 免疫熒光檢測兩組原代細(xì)胞中E-cadherin 的表達(dá) 以DAPI 染核進(jìn)行定位，從Merge 的結(jié)果來看，E-cadherin 在鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤中的表達(dá)高于造釉細(xì)胞型顱咽管瘤，見圖4。

圖4 免疫熒光檢測ACP 和PCP 原代細(xì)胞E-cadherin 的表達(dá)

2.1.5 WB 檢測兩組原代細(xì)胞中E-cadherin 和β-catenin 的表達(dá) 與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞相比，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而β-catenin 表達(dá)上調(diào)，見圖5。

圖5 WB 檢測ACP 和PCP 原代細(xì)胞E-cadherin和β-catenin 的表達(dá)

2.2 對造釉細(xì)胞型顱咽管瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞過表達(dá)和敲低miR-200c 對其侵襲性的影響

2.2.1 Q-PCR 檢測各組造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞中的miRNA-200c 表達(dá)差異 與對照組相比，經(jīng)mimic，miRNA-200c 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），而inhibitor干預(yù)后miRNA-200c 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），見圖6。

圖6 各組miR-200c 表達(dá)情況

2.2.2 Transwell 檢測miR-200c 對造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞侵襲能力的影響 與對照組相比，在miR-200c mimics 組，miR-200c 結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量減少；而在miR-200c inhibitor 組，miR-200c 結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量增加，見圖7A～圖7C。從細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，與對照組相比，miR-200cmimics組結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05），而miR-200c inhibitor 組結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05）。miR-200c inhibitor 組細(xì)胞數(shù)顯著多于miR-200c mimics 組（P＜0.01），見圖7D。

圖7 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲性

2.2.3 免疫熒光檢測miR-200c 對造釉細(xì)胞型顱咽管瘤原代細(xì)胞中β-catenin 和E-cadherin 的表達(dá)影響過表達(dá)miR-200c 能促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)，而抑制β-catenin 的表達(dá)；抑制miR-200c 的表達(dá)能抑制E-cadherin 的表達(dá)，促進(jìn)β-catenin 的表達(dá)，見圖8。

圖8 免疫熒光檢測各組β-catenin 和E-cadherin 表達(dá)情況

2.2.4 Western blot 檢測各組細(xì)胞E-cadherin 和β-catenin 的表達(dá)差異 β-catenin 在miRNA-200C增高后表達(dá)下調(diào)，被抑制后又有恢復(fù)性表達(dá)，E-cadherin 則相反，見圖9。

圖9 Western blot 檢測各組β-catenin和E-cadherin 表達(dá)情況

3 討論

miRNA-200 家族共有5 個(gè)成員組成，根據(jù)其“種子序列”不同又可分為2 個(gè)亞族：miRNA-200c、miRNA -141 和 miRNA -200a、miRNA -200b 及miRNA-429，前者共同序列為AAUACU，后者為AACACU。兩者之間相差一個(gè)核苷酸（C 和U），因它們擁有不同的種子序列，所以具有不同的結(jié)合特異性，調(diào)節(jié)的靶基因也有細(xì)微的差別，但它們?nèi)杂性S多共同的靶基因。miRNA-200c 是miRNA-200 家族中的一員，其編碼基因位于12 號染色體上。國內(nèi)外學(xué)者們通過大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200c 在多種惡性腫瘤中的表達(dá)量與正常組織或者癌旁組織有明顯差異，目前已在乳腺癌[3]、卵巢癌[4-6]、肝癌[7，8]、腸癌[9]、膠質(zhì)瘤[10]、胃癌[11]、肺癌[12]、胰腺癌[13]、膀胱癌[14]等惡性腫瘤中證實(shí)。

本課題通過原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分別培養(yǎng)出鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤及造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的原代細(xì)胞，利用qRT-PCR 測定各組miRNA-200 家族的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤相比，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤組中miRNA-200 家族表達(dá)整體呈下降趨勢，其中miRNA-200c 的下降最為明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著（P＜0.001），因此可能是影響兩種不同類型顱咽管瘤侵襲差異的主要原因。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮特性的細(xì)胞通過一系列的生物學(xué)轉(zhuǎn)變過程后，細(xì)胞極性和粘附性丟失或減弱，而細(xì)胞的遷移能力及細(xì)胞的侵襲性明顯增強(qiáng)[15，16]。EMT 是上皮性腫瘤發(fā)生遷移和侵襲的重要原因。EMT 的特征性改變包括：E-cadherin 表達(dá)降低，波形蛋白表達(dá)升高等。E-cadherin 是一種鈣依賴性的跨膜糖蛋白，它能介導(dǎo)同種細(xì)胞間相互粘合，主要分布于上皮細(xì)胞的表面，在維持上皮細(xì)胞表型、細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性、細(xì)胞極型、組織結(jié)構(gòu)的完整性中有重要作用[17，18]。E-cadherin 表達(dá)下降是發(fā)生EMT 的關(guān)鍵一步。本實(shí)驗(yàn)中Western blot 結(jié)果顯示，與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞相比，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的原代細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)下調(diào)。β-catenin 是一種多功能、高度保守的細(xì)胞骨架蛋白，由CTNNB1 編碼。β-catenin 可以存在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，研究發(fā)現(xiàn)正常神經(jīng)細(xì)胞中的β-catenin 存在于細(xì)胞膜中表達(dá)，而造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中β-catenin 在細(xì)胞膜低表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)過表達(dá)，并且這些細(xì)胞多位于實(shí)體瘤邊緣浸潤性較強(qiáng)的位置。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光檢測及Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示，與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞相比，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的細(xì)胞中β-catenin 表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)入細(xì)胞核。E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物可使E-cadherin集中定位于細(xì)胞間的接觸部位，維持細(xì)胞的連接及細(xì)胞極性[19]。β-catenin 可與細(xì)胞膜上的E-cadherin結(jié)合形成復(fù)合物，從而增強(qiáng)細(xì)胞間的粘附作用。在造釉細(xì)胞型顱咽管瘤原代細(xì)胞中，β-catenin 主要分布在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核內(nèi)，使E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物的形成減少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞黏附減弱，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲性生長[20]。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細(xì)胞相比，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的原代細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性。

本實(shí)驗(yàn)通過mimic 過表達(dá)或inhibitor 抑制造釉細(xì)胞型顱咽管瘤原代細(xì)胞中miRNA-200c 的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)mimic 干預(yù)后，miRNA-200c 表達(dá)水平明顯升高；而經(jīng)inhibitor 干預(yù)后miRNA-200c 表達(dá)水平明顯下降，出現(xiàn)的表達(dá)情況符合預(yù)期，表明可以通過人為干預(yù)，過表達(dá)或抑制miRNA-200c 的表達(dá)，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。EMT 使細(xì)胞間粘附降低，增加了細(xì)胞的運(yùn)動性和播散能力。miRNA-200c 在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用[21]。經(jīng)免疫熒光檢測及Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-200c 后E-cadherin 的表達(dá)明顯增加，β-catenin 的表達(dá)明顯降低；而抑制miR-200c后E-cadherin 的表達(dá)明顯降低，β-catenin 的表達(dá)升高，且導(dǎo)致β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核，β-catenin 入核后，E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物將會相應(yīng)減少。E-cadherin 或者β-catenin 的表達(dá)降低，均會影響E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物的形成，使得細(xì)胞間的粘附作用降低，細(xì)胞極性消失，可能因此增加了細(xì)胞的侵襲性。從Transwell 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，與對照組相比，miR-200c mimics 組結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量減少，而miR-200cinhibitor 組結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量增加，miR-200c inhibitor 組細(xì)胞數(shù)顯著多于miR-200c mimics 組，說明過表達(dá)miR-200c 后能夠抑制造釉細(xì)胞型顱咽管瘤細(xì)胞的侵襲性。

綜上所述，在造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中，可能存在這樣一個(gè)通路，隨著造釉細(xì)胞型顱咽管瘤miRNA-200c 表達(dá)明顯下調(diào)，使E-cadherin 的表達(dá)受到了明顯抑制，而β-catenin 則表達(dá)增加并入核。E-cadherin 的表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)了EMT 的發(fā)生，β-catenin 入核后在細(xì)胞膜的低表達(dá)通過影響E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物的形成，也促進(jìn)了EMT的發(fā)生，導(dǎo)致了造釉細(xì)胞型顱咽管瘤的侵襲性增加。