腸道微生態(tài)與免疫檢查點抑制劑的臨床應用管理

王鈞 王強 郭智

隨著基因組學和代謝組學的技術進步，利用下一代測序技術(NGS)可檢測腸道微生物的分類和功能屬性，通過綜合方式研究整個微生物組[1]。腸道微生物群可通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境(TME)來影響腫瘤免疫，基于腸道菌群與免疫治療相關性挖掘微生物信息，開發(fā)可行的微生物干預方法[2-5]，有望優(yōu)化免疫檢查點抑制劑(ICI)不良反應尤其是腸道并發(fā)癥的管理，通過對異常微生態(tài)系統(tǒng)的監(jiān)測減少ICI的不良反應，避免ICI療效減低，也可通過微生態(tài)指標的監(jiān)測對ICI的療效進行早期判斷，還能夠通過糞菌移植(FMT)[6]、益生菌[7]等改善ICI療效，通過移植正常腸道微生物作為調(diào)節(jié)抗原激活內(nèi)源性T細胞,把冷腫瘤變成熱腫瘤，進而使用ICI靶向腫瘤細胞。此外在ICI治療中，抗生素的合理用藥、針對ICI原發(fā)和繼發(fā)耐藥及不良反應的早期預警也是臨床ICI應用管理中關注的熱點問題?；跇?gòu)建腸道微生物群(抗原)與腫瘤抗原相似的“抗原模擬”策略可刺激體內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，增強ICI抗腫瘤治療效果。

一、腸道微生態(tài)與機體免疫

1.腸道微生態(tài)的組成及功能

隨著科技的進步，人體腸道微生物組數(shù)量和分類在持續(xù)修正。這些微生物主要是細菌，還包括古生菌、真菌、病毒和蠕蟲等，多數(shù)存在于遠端腸道。目前已知腸道微生物群可影響宿主免疫功能、提供必需維生素合成、影響宿主細胞增殖和血管形成、調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳導及腸道內(nèi)分泌功能等，腸道菌群失衡會導致炎癥性腸病，與風濕病、肥胖、糖尿病、特應性過敏等有關[8-9]。目前大多數(shù)關于微生物組的研究文獻均集中于細菌或細菌組，已明確腸道細菌基因由數(shù)百萬個堿基對組成，稱為16S核糖體RNA多態(tài)性區(qū)域。目前NGS即基于16S DNA的定量鑒定進行細菌類型特征序列測定，如以糞便中腸桿菌的DNA為模板設計用于擴增部分16S區(qū)域的引物擴增基因。盡管細菌在微生物群落中占主導地位，但病毒、古生菌和真菌也可能在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用，只是由于病毒和真菌生物群落豐度較低及缺乏特征性識別和分類優(yōu)化工具，精選參考數(shù)據(jù)庫相對研究較少。

腸道病毒組主要包括DNA或RNA噬菌體，真菌主要包括曲霉屬、念珠菌屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬和酵母菌屬，腸道古生菌主要是產(chǎn)甲烷菌及嗜鹽(嗜鹽微生物)古生菌，蠕蟲物種從宿主-寄生蟲相互作用進行免疫調(diào)節(jié)。另外，一些傳染性非共生DNA和RNA病毒(如人乳頭瘤病毒、人類皰疹病毒8、EB病毒、巨細胞病毒、丙型肝炎病毒和人嗜T淋巴細胞病毒)均有致癌性。因此，人體微生物組被認為是人體第二基因組，我們對腸道微生態(tài)的認知才剛剛起步[10]。

2.腸道微生態(tài)與免疫系統(tǒng)及腫瘤發(fā)生的影響

腸道微生物組在免疫治療中的作用受到越來越多關注。細菌、病毒和真菌通過巨噬細胞激活固有免疫系統(tǒng)，進而通過T細胞[如輔助性T細胞(Th)1、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)]來激活適應性免疫系統(tǒng)。需要注意的是腸道中性菌即條件致病菌，如腸桿菌。腸道微生態(tài)平衡時它們是無害的，但在某些條件下具有攻擊性。有害細菌即腸道病原體，主要包括霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌和致病性大腸桿菌。如果人體腸道內(nèi)有害細菌過多，免疫系統(tǒng)就會被削弱，甚至會產(chǎn)生致癌物等有害物質(zhì)[11]。

腸道菌群在人體環(huán)境中起著重要作用，能刺激機體淋巴組織增生并產(chǎn)生大量淋巴細胞，從而促進全身免疫系統(tǒng)和黏膜免疫系統(tǒng)正常發(fā)育及逐漸成熟。腸道菌群失衡可促進多種惡性腫瘤的發(fā)展，如胃腸道惡性腫瘤。與其他內(nèi)臟和黏膜組織相比，腸道在集體穩(wěn)態(tài)下持續(xù)暴露于飲食和腸道微生物群[外來抗原(Ag)]，將有或無膳食Ag和腸道微生物群條件下飼養(yǎng)的小鼠進行對比，發(fā)現(xiàn)微生物抗原可深刻影響腸道CD4+T細胞，尤其是腸道Treg細胞。廣泛的微生物物種能夠誘導腸道Foxp3+Treg(pTreg)細胞和Th17細胞。由微生物群和腫瘤新抗原介導的特異性T細胞具有多樣性、高表達的T細胞受體(TCR)，是宿主抵御眾多病原體及控制腫瘤生長的關鍵因素，腸道微生物群誘導CD4+T細胞分化為各種Th亞群，如腸外周pTreg和Th17細胞，由腸道微生物群產(chǎn)生的Treg細胞可防止來自飲食和腸道微生物的免疫反應，如天然淋巴細胞(ILC)可通過調(diào)節(jié)IL-7的可用性來調(diào)節(jié)組織駐留T細胞的維持，尤其是組織駐留記憶CD8+T細胞。產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)的微生物可增強針對病毒的特異性長記憶CD8+T細胞。這些局部 CD8+T細胞是靶向細胞內(nèi)病原體和腫瘤細胞的基礎 。此外，腸道中的CD8+T細胞，尤其是腸上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)可通過響應腸道微生物群產(chǎn)生抗菌因子和組織修復因子，有助于組織穩(wěn)態(tài)和上皮修復[12]。這些效應T細胞中，Th17具有促炎作用并有抗腫瘤功能，而IL-10介導的Treg細胞具有抗炎作用并導致效應T細胞的抑制，CD8+T細胞產(chǎn)生的干擾素-γ(IFN-γ)具有抗腫瘤作用。除了細胞免疫系統(tǒng)，腸道上皮Peyer斑被認為是一個組織良好的生發(fā)中心，其由不同的B細胞庫組成，分泌的IgA抗體是體液免疫的關鍵部分[13]。

3.TME內(nèi)的相互作用

TME對免疫應答的負向調(diào)節(jié)會促進腫瘤進展，腫瘤能夠表達特異性免疫檢查點并利用此機制逃避T細胞攻擊，特別是T細胞受體程序性死亡受體1(PD-1)、PD-配體1(PD-L1)和PD-L2，這些配體通過PD-1與T細胞結(jié)合來阻止其激活。此外，腫瘤通過改變主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ的表達來對抗免疫應答，從而限制交叉反應性腫瘤相關抗原(TAA)表現(xiàn)為CTL。通過細胞因子和生長因子積累產(chǎn)生的慢性炎癥狀態(tài)促進免疫抑制細胞募集和誘導，如Treg細胞、髓源性抑制細胞(MDSC)和腫瘤相關巨噬細胞(TAM)。腫瘤來源的免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，如IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和粒細胞-單核細胞-集落刺激因子(GM-CSF)及前列腺素E2導致代謝失調(diào)和組織缺氧，有助于單核細胞和巨噬細胞向TAM極化。TAM分泌蛋白酶和細胞因子，如表皮生長因子(EGF)或VEGF，可進一步促進黑色素瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而有利于癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和新生血管生成?？傊琓ME構(gòu)成了一個免疫調(diào)節(jié)環(huán)境，其損害活化免疫細胞(包括T效應細胞)的浸潤，T效應細胞可能在血管邊界發(fā)揮抗腫瘤活性作用[14]。

二、免疫療法及ICI

1.免疫檢查點及免疫療法

免疫系統(tǒng)在腫瘤防治中至關重要，致癌因素導致基因突變形成腫瘤，但腫瘤的持續(xù)進展取決于其逃避宿主免疫監(jiān)視的能力。免疫檢查點的生理作用是限制免疫應答，通過“關閉”CTL實現(xiàn)自我耐受、避免自我攻擊，但這也導致腫瘤細胞逃逸于T細胞的攻擊。癌細胞通過免疫檢查點途徑直接抑制CD8+CTL來逃避免疫，如PD-1和CTL活化抗原-4(CTLA-4)。免疫療法是加強或誘導免疫系統(tǒng)的治療技術，分為主動非特異性、主動特異性和被動方式[如給予腫瘤抗原、DNA或RNA疫苗、樹突細胞疫苗、抗腫瘤抗原受體、嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)、溶瘤病毒抗體等]。免疫療法是針對免疫細胞(T細胞)和(或)癌細胞上的免疫檢查點的抗體激活腫瘤特異性免疫反應起作用[15-17]。

2.ICI及不良反應

隨著伊匹利單抗成為首個商品化ICI，至今ICI的適應證已擴大到黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤和其他實體腫瘤，如非小細胞肺癌、結(jié)腸癌和腎細胞癌等。ICI可單藥或與化療及其他ICI(雙重免疫檢查點阻斷)聯(lián)合使用，促進T細胞活化并靶向腫瘤細胞，目前研究最廣泛的是CTLA-4和PD-1/PD-L1。ICI單藥及聯(lián)合治療已成為許多不同類型腫瘤的標準治療方案。與ICI相關的獨特不良反應稱為免疫相關不良反應(irAE)，其與T細胞活化作用機制有關。幾乎所有器官系統(tǒng)都可能受到irAE的影響，包括皮膚、胃腸道、肺臟、內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)。不良反應從輕微到危及生命，其發(fā)生時間可能延遲數(shù)周，不易管理。輕度irAE對癥治療即可，Ⅱ～Ⅳ級的irAE需評估是否停止治療并應用ICI治療。irAE患者管理涉及個體患者長期目標的多學科觀察協(xié)調(diào)，在使用ICI前臨床醫(yī)生必須了解與免疫療法相關的獨特且可能致命的毒理學特征，確保及時診斷管理[18]。

所有因疑似發(fā)生irAE的患者應由具有irAE專業(yè)知識的腫瘤學?？漆t(yī)生進行評估。腫瘤科醫(yī)生與各亞專科醫(yī)生協(xié)調(diào)會診，這些專科醫(yī)生包括但不限于免疫檢驗學、心臟病學、皮膚病學、內(nèi)分泌學、胃腸病學、血液學、腎臟病學、神經(jīng)病學、眼科、呼吸病學、風濕病學及ICU團隊的專家。Ⅰ～Ⅱ級irAE患者可繼續(xù)使用ICI治療，也可短暫中斷治療和監(jiān)測。重度irAE患者(Ⅲ～Ⅳ級)應停用ICI。任何重新開始ICI的決定都應在患者與其醫(yī)生團隊討論后作出，并考慮其器官特異性毒性、疾病復發(fā)可能性、預后和潛在的替代療法。

三、腸道微生態(tài)與ICI的交叉管理

1.ICI不良反應管理

一項Meta分析結(jié)果顯示，約10%～30%的受試者出現(xiàn)≥Ⅲ級irAE，包括14%使用PD-1單藥的患者、34%使用CTLA-4單藥治療的患者及55%ICI聯(lián)合治療的患者均可能出現(xiàn)嚴重的不良反應，需使用高劑量ICI并住院治療。此外irAE發(fā)展的分子機制仍不明確，也缺乏針對性預測的標志物來早期識別可能發(fā)生ICI不良反應風險的個體。隨著ICI治療成為腫瘤治療的核心支柱，irAE的發(fā)病率將隨著ICI的使用而顯著增加[19-21]。

2.抗生素治療對腫瘤免疫治療期間ICI的負調(diào)節(jié)

流行病學研究揭示抗生素對免疫治療的有害影響，抗生素治療可引起腸道微生物群紊亂，可能降低相關ICI獲益。臨床試驗和臨床常規(guī)治療結(jié)果均顯示ICI治療后接受抗生素治療患者總生存率和治療反應率均有降低，抗生素應用可能與腸道微生物群受損有關，進而影響免疫細胞的發(fā)育和功能。在抗生素抑制腸道益生菌后，Th1/Th2細胞和Treg細胞的數(shù)量和性能發(fā)生了變化，抗菌肽表達水平降低，IgA分泌減少，IFN-γ表達水平下調(diào)，機體更易受感染。抗生素對腸道微生物群影響也可能干擾ICI的功效，但目前評估微生物群、抗生素和ICI之間關系的研究多為回顧性，建議在評估后不用或僅選用窄譜抗生素[22-23]。

3.腫瘤對ICI的耐藥與腸道微生態(tài)

腫瘤對ICI的耐藥分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性耐藥是指腫瘤細胞通過改變與DNA損傷反應、細胞信號通路或免疫識別相關過程來獲得對ICI的耐藥性，機制包括以下方面：(1)腫瘤新抗原的呈遞或表觀遺傳學上改變，影響免疫反應激活和效應T細胞募集；(2)腫瘤MHCⅡ/Ⅰ結(jié)構(gòu)的改變影響抗原呈遞；(3)干擾素(INF)信號通路功能失調(diào)導致抗腫瘤T細胞效應功能不足。繼發(fā)性耐藥的影響因素包括TME、年齡等宿主因素、遺傳背景、合并癥、飲食、抗生素和類固醇的使用、代謝和腸道微生物群等。任何判斷及評估耐藥、及時調(diào)整藥物包括聯(lián)合用藥對患者的預后均具有重要價值[24]。

4.微生物特異性T細胞對自身抗原和新抗原交叉反應用于腫瘤治療

抗原模擬是腸道微生物群在腫瘤耐藥中發(fā)揮作用的一個方面，可以利用給予腫瘤耐藥患者移植腸道微生物群并將其作為“腫瘤抗原模擬物”策略誘導機體產(chǎn)生特異性T細胞，在克服腫瘤耐藥中發(fā)揮作用。腸道微生物群決定了腫瘤患者對ICI治療的反應，該治療可重振腫瘤相關Ag特異性耗盡的CD8+T細胞。對ICI治療有反應的腫瘤患者中腸道微生物群的微生物組成與無反應者不同。此外，糞便微生物群從應答者轉(zhuǎn)移到荷瘤的無菌(GF)小鼠中可增加抗腫瘤效果，減少腫瘤負擔。從健康個體移植糞便微生物群，重建患者抗原系統(tǒng)使無應答者對ICI治療有反應，如某些具有抗腫瘤作用的微生物通過Toll樣受體(TLR)激活樹突狀細胞，并促進Th1和CD8+T細胞反應，有助于腫瘤免疫監(jiān)視和根除。腸道微生物是一種Ag來源，可刺激交叉反應性腫瘤相關Ag(TAA)特異性CD8+T細胞?；谏镄畔W和計算分析揭示腸道微生物群中TAAs與微生物Ags之間的模擬性，可合理地設計微生物聯(lián)盟，由可能通過抗原模擬誘導TAA特異性CD8+T細胞反應的微生物組成。能否通過腸道微生物群(厚壁菌和擬桿菌門)產(chǎn)生的TAA和腫瘤抗原之間的同源性，即腸道微生物與Ag之間的抗原模擬激發(fā)ICI反應，是目前科學研究的一個方向[25-26]。

5.基于微生態(tài)的ICI調(diào)節(jié)

盡管通過益生菌與FMT來調(diào)節(jié)微生物組在一些臨床和實驗模型中產(chǎn)生了有希望的結(jié)果，但其中大多數(shù)并不一致，且可能無法提供一致的臨床益處。如益生菌(單菌株或多菌株)被認為是腸道微生物組成的天然、安全和有益的調(diào)節(jié)劑，但其功效取決于菌株和劑量，且并非所有益生菌都能對抗全部疾病。另外一種方法是FMT，如從抗PD-1應答者中制備糞便樣本，其樣本中所攜的共生菌做為抗原，能誘被移植患者腸道產(chǎn)生有活性的淋巴細胞，然后再通過內(nèi)窺鏡將微生物移植到抗PD-1耐藥且腸道組成不佳的患者體內(nèi)。這種方法與已證明有效用于治療患者難治性/艱難梭菌感染的策略相同。豐富的腸道微生物菌群在PD-1免疫治療和T細胞反應中充當免疫佐劑，可能與PD-1/PD-L1免疫治療聯(lián)系較深。有大量T細胞浸潤的熱腫瘤對腫瘤免疫治療反應率最高。靶向抑制Vps34可將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為“熱腫瘤”，從而增強PD-L1/PD-1阻斷療法的療效，基于生物信息學和計算分析揭示腸道微生物群中TAAs與微生物Ags之間的模擬性，可合理地設計微生物聯(lián)盟，由可能通過抗原模擬誘導TAA特異性CD8+CTL反應的微生物組成。通過結(jié)合分析腫瘤浸潤T細胞的TCR庫及基于TCR序列的肽-MHC特異性預測，進一步改善療效[27-30]。

四、總語

腸道微生態(tài)對腫瘤的影響取決于微生物群、腫瘤和免疫系統(tǒng)之間的相互作用。人腸道微生物群參與宿主免疫應答并調(diào)節(jié)腫瘤免疫周期的多個步驟，包括抗原呈遞、T細胞啟動和激活。通過結(jié)合微生物組和宿主多組學表征的方法(如16S核糖體RNA基因擴增子測序、微生物組的鳥槍法宏基因組測序和代謝組學表征及宿主的單細胞RNA測序)結(jié)合臨床前模型(無菌小鼠模型)，以便改善ICI在腫瘤患者治療中的效果。此外，抗生素的使用現(xiàn)已被證明是影響ICI療效的動態(tài)因素，識別微生物群將促進臨床治療個體化(如使用窄譜抗生素或FMT等)發(fā)展。同時希望ICI耐藥患者通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的方式激活正常細胞免疫以改善ICI的療效。