• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的研究

    2023-03-09 04:27:14于曉婷陳曉藝王淑婧王添譽(yù)李憲臻
    關(guān)鍵詞:羧甲基海藻硅膠

    于曉婷,陳曉藝,李 苗,王淑婧,王添譽(yù),李 僉,李憲臻

    (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

    酶是一種生物催化劑,因其擁有綠色、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注。但是,由于其物理和化學(xué)特性的不穩(wěn)定,使得在實(shí)際使用中不能長時(shí)間維持其催化活性,因而不能充分發(fā)揮其催化作用[1]。酶固定化技術(shù)是通過采用合適的固定化工藝,將游離酶固定到易于循環(huán)利用的載體上,固定化材料、制備方法、酶用量以及固定化條件等皆會(huì)影響酶的固定化效果[2]。

    從1910 年開始,隨著新型固定化載體的不斷涌現(xiàn),固定化酶領(lǐng)域發(fā)展迅速。載體通常需要根據(jù)固定化酶的應(yīng)用要求進(jìn)行選擇[3]。固定化酶常用的載體可以分為以下4 類:無機(jī)載體(二氧化硅、活性炭等[4])、天然有機(jī)物(纖維素、殼聚糖、海藻酸鈉等[5-6])、合成高分子材料(環(huán)氧樹脂、聚丙烯腈膜等[7])和復(fù)合載體(有機(jī)物質(zhì)與無機(jī)物質(zhì)混合構(gòu)成的載體,例如磁性復(fù)合微球等[8])。常用的固定化酶方法有以下幾種:1)吸附法是指通過范德華力作用,酶和載體進(jìn)行結(jié)合,但是這樣的力常常不是很強(qiáng),造成酶和載體之間反應(yīng)不夠牢固,在使用時(shí),酶很容易脫落進(jìn)入反應(yīng)溶液中,造成回收困難[9]。2)交聯(lián)法是通過兩種或多種功能的交聯(lián)劑,將酶分子和載體連接起來的固定化方式。為了避免酶從載體上掉落,通常不單獨(dú)使用交聯(lián)法,而與包埋法或吸附法組合應(yīng)用[10]。3)共價(jià)偶聯(lián)法(又稱為共價(jià)結(jié)合法)是通過在酶和載體之間形成共價(jià)鍵來固定酶的一種工藝。和其他方法相比,該方法反應(yīng)條件較復(fù)雜,不僅在一定程度上會(huì)引起酶蛋白在空間上特定結(jié)構(gòu)的變化,還有可能破壞酶的活性中心,從而導(dǎo)致酶活力降低。

    柚皮苷是一種二氫類黃酮化合物,口感苦澀,在柑橘類果品中十分常見。為了改善其苦澀味道,柚苷酶通常用于去除柚柑類產(chǎn)品(如果汁等)的苦味[11]。柚苷酶是一種復(fù)合酶,具有α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)兩種活性[12-14],其在自然界中的動(dòng)物、植物、微生物中普遍存在[13]。柚苷酶水解柚皮苷主要經(jīng)過兩個(gè)步驟:第一步,柚皮苷經(jīng)過α-L-鼠李糖苷酶水解為α-L-鼠李糖和普魯寧兩種物質(zhì),普魯寧的苦味遠(yuǎn)低于柚皮苷(其苦味值僅為柚皮苷的一半);第二步,普魯寧被β-D-葡萄糖苷酶水解生成葡萄糖及柚皮素,這兩種產(chǎn)物均沒有苦味[14]。迄今為止,柚苷酶在柑橘類水果脫苦、葡萄酒調(diào)味、醫(yī)藥工業(yè)等方面發(fā)揮著重要作用[15-18]。

    在已有固定化柚苷酶的報(bào)道中,殼聚糖是一種較為常用的固定化載體,是廣泛存在于自然界的天然高分子物質(zhì),具有生物相容性好[19]、安全無毒、易降解等優(yōu)點(diǎn)[20]。段志濤等分別用殼聚糖和海藻酸鈉微球?qū)﹁周彰高M(jìn)行共價(jià)鍵合,其酶比活力分別為14.34 U/g 和12.18 U/g[21]。此外,作為殼聚糖的衍生物,羧甲基殼聚糖是將羧甲基等基團(tuán)加入到殼聚糖的內(nèi)部,其中富含大量的羧基和氨基等功能基團(tuán),在中性和堿性條件下,水溶性較好,因此有效改善了殼聚糖的溶解性能[22]。并且與單純的殼聚糖材料相比較,羧甲基殼聚糖表現(xiàn)出更優(yōu)異的生物相容性,同時(shí)能夠與Ca2+交聯(lián)產(chǎn)生致密結(jié)構(gòu),對活性化合物的吸附和控制釋放有非常好的效果。肖安風(fēng)等用聚乙烯醇和海藻酸鈉形成的復(fù)合材料進(jìn)行固定化柚苷酶的相關(guān)研究,酶比活力達(dá)到19 U/g[23]。與此同時(shí),海藻酸鈉也是一種天然多糖類物質(zhì),同樣可以與Ca2+交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)[24]。雖然海藻酸鹽微球羥基和羧基含量豐富,但由于其強(qiáng)度不高,導(dǎo)致微球結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定,最好引入一些無機(jī)載體來增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度,例如二氧化硅,是最受歡迎的無機(jī)載體之一,具有良好的物理和機(jī)械穩(wěn)定性,無膨脹,耐有機(jī)物、高酸度和高溫等顯著優(yōu)點(diǎn)[25]。與此同時(shí),海藻酸鈉、硅膠、羧甲基殼聚糖均為綠色、對環(huán)境友好、價(jià)格相對便宜的原料,能夠有效降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。

    迄今為止,鮮有關(guān)于羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠為材料對柚苷酶進(jìn)行固定化的報(bào)道,作者以羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、硅膠為基材制備微球,對柚苷酶進(jìn)行固定化,優(yōu)化了硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比、交聯(lián)時(shí)間、固定化溫度、偶聯(lián)時(shí)間等條件,并探索和分析了固定化柚苷酶和游離柚苷酶發(fā)生酶解反應(yīng)的最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度、重復(fù)使用性等,為創(chuàng)新酶固定化載體,不斷拓寬柚苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供了技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.2 儀器與設(shè)備

    DENVER INSTRUMENT TP-213 精密天平:美國丹佛儀器有限公司產(chǎn)品;78-1 型磁力加熱攪拌器:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品;知楚三層立式搖床:上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品;PHS-3C 型pH 計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品;HH-8 型恒溫水浴鍋:常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;Tecan 酶標(biāo)儀:勒菲生物科技(上海)有限公司產(chǎn)品。

    1.3 方法

    1.3.1 微球載體及固定化柚苷酶的制備

    1)滴入法制備海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球 首先配制1.5 g/dL 海藻酸鈉溶液(溶液A),將100 mL 去離子水和1.5 g 海藻酸鈉加入到250 mL 的燒杯中,置于磁力加熱攪拌器上進(jìn)行攪拌至溶解后,再加入1.0 g 硅膠和1.5 g 羧甲基殼聚糖,繼續(xù)劇烈攪拌待其形成均一溶液后停止。配制2 g/dL CaCl2溶液(溶液B),稱取4 g CaCl2于燒杯中加水溶解,轉(zhuǎn)移到200 mL 容量瓶中定容。將溶液B 轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中,加入磁子后,將其置于恒溫加熱磁力攪拌器上,在溫度為25 ℃條件下進(jìn)行低速攪拌。利用1 mL 的注射器將溶液A 緩慢逐滴加入到溶液B 中,滴入瞬間在溶液B 中可以看到生成的微球,注意滴入速度不能過快,防止微球粘連。溶液A 全部加入后,微球?yàn)V出加入新的CaCl2溶液,同樣的低轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌1 h,結(jié)束后,用去離子水將微球洗滌數(shù)次。最后,將微球平鋪在濾紙上,吸干其表面水分,4 ℃冷藏。

    2)戊二醛交聯(lián)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球的制備 將0.4 g 上述微球放入到1 mL 體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛溶液中,在25 ℃搖床中交聯(lián)2.0 h。反應(yīng)結(jié)束后,用去離子水洗滌數(shù)次,將微球平鋪在濾紙上,吸干其表面水分,即得到戊二醛交聯(lián)的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球,冷藏備用。

    3)固定化柚苷酶的制備 取0.4 g 已交聯(lián)的微球載體,加入4 mL 柚苷酶酶液,置于25 ℃搖床上振蕩2 h,并于4 ℃冰箱中靜置吸附偶聯(lián)4 h。用去離子水清洗數(shù)次,將載體表面未固定化的剩余酶液沖洗干凈,濾紙吸干水分獲得固定化柚苷酶,于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 酶學(xué)性質(zhì)表征

    提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣,可幫助學(xué)生改善學(xué)習(xí)效率,并使生物成績快速提升。在教學(xué)實(shí)踐中,教師可通過引導(dǎo)學(xué)生觀察大自然的方式提升學(xué)生對于生物課程的興趣。首先教師可利用假期時(shí)間,邀請學(xué)生進(jìn)入到大自然中開展活動(dòng),在活動(dòng)中,教師可開展相關(guān)的生物實(shí)驗(yàn),以幫助學(xué)生認(rèn)識到大自然的魅力與生物的多樣性。之后教師可組織學(xué)生在課堂中將活動(dòng)的體會(huì)進(jìn)行分享。通過這樣的活動(dòng)學(xué)生將對自然環(huán)境產(chǎn)生新的認(rèn)識,并將在教師的引導(dǎo)下對生物課程產(chǎn)生較為濃厚的興趣。

    1)酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化 研究了海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶酶解反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、pH 穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性。通過測定4 ℃、30 d 內(nèi)酶活力變化,研究了固定化柚苷酶的儲藏穩(wěn)定性,同時(shí)計(jì)算了固定化柚苷酶的載酶率和酶活力回收率。

    2)酶活力的測定 選擇改進(jìn)的Davis 法[26-29],稱取0.4 g 固定化柚苷酶或移取0.2 mL 游離柚苷酶于1.5 mL 離心管中,加入0.8 mL 的柚皮苷溶液(0.8 mg/mL),混合均勻并置于恒溫水浴鍋中,在溫度為55 ℃條件下加熱30 min,反應(yīng)停止后,取0.1 mL 上清液,加入到提前配制好的溶液C(體積分?jǐn)?shù)95%一縮二乙二醇5 mL 和4 mol/L 氫氧化鈉0.1 mL)中,振蕩混勻,待其反應(yīng)10 min 后,在波長為420 nm 條件下測定OD 值。

    柚苷酶酶活力:在最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度條件下,在1 min 內(nèi)酶解質(zhì)量為1 μg 的柚皮苷所需要的酶量稱作一個(gè)酶活力單位,其單位為U。

    酶比活力:在最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度條件下,1 g 固定化柚苷酶或1 mL 游離柚苷酶具有的酶活力,其單位為U/g 或U/mL。

    3)相關(guān)計(jì)算公式[30]固定化柚苷酶的載酶率由下式(1)計(jì)算得出:

    式中:B 為載酶率,%;A0為柚苷酶固定前游離柚苷酶的總酶活力;A1為柚苷酶固定后上清液中剩余的酶活力。

    酶活力回收率由下式(2)計(jì)算得出:

    式中:R 為酶活力回收率,%;A2為固定化柚苷酶的總酶活力。

    固定化柚苷酶相對酶活力計(jì)算公式如下式(3):

    式中:Q 為相對酶活力,%;P 為某一條件下的酶活力;K 為該條件下的最高酶活力。

    1.3.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定 取0.2 mL 游離柚苷酶,加入0.8 mL 柚皮苷溶液中(質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),在pH 為4.5,溫度為55 ℃條件下,進(jìn)行酶解反應(yīng),測定酶活力;取40 mg 固定化柚苷酶,加入0.8 mL 柚皮苷溶液中(質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),在pH 為7.5、溫度為55 ℃條件下,進(jìn)行酶解反應(yīng),測定酶活力。最大反應(yīng)速度(Vmax)和表觀米氏常數(shù)(Km)由Lineweaver-Burk 方程計(jì)算得出,如下式(4):

    2 結(jié)果與分析

    2.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球制備工藝的優(yōu)化

    2.1.1 硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對固定化柚苷酶酶活力的影響 首先,研究了硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對固定化柚苷酶酶活力的影響,結(jié)果如圖1(a)所示。當(dāng)硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比為1.0∶1.5 時(shí),酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)羧甲基殼聚糖質(zhì)量增大時(shí),酶活力隨之減小,這可能是由于微球通過靜電作用形成了復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[31],當(dāng)羧甲基殼聚糖含量過高時(shí),所產(chǎn)生的微球結(jié)構(gòu)相對牢固,壁膜結(jié)構(gòu)致密[32],減少了酶分子與載體結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量。因此,采用硅膠/羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比1.0∶1.5 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1(b)所示,在最佳工藝條件下制備出了機(jī)械強(qiáng)度高、表面光滑且成球性好的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球。

    圖1 硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對固定化柚苷酶酶活力的影響及最佳條件下制備的固定化材料Fig.1 Effect of silica gel/carboxymethyl chitosan mass ratio on the activity of immobilized naringinase and immobilized materials prepared under the optimum conditions

    2.1.2 交聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響 作者以海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球?yàn)檩d體,進(jìn)行固定化柚苷酶。結(jié)果如圖2 所示,載體加入戊二醛溶液后,交聯(lián)時(shí)間在1.0~3.0 h 時(shí),交聯(lián)反應(yīng)2.0 h 達(dá)到最大酶活力,這是因?yàn)榻宦?lián)時(shí)間過短,會(huì)引起酶的脫落[33];交聯(lián)時(shí)間過長,會(huì)造成過高交聯(lián)度,使微球內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑過小,不利于酶促反應(yīng)進(jìn)行,所以交聯(lián)時(shí)間超過2.0 h 后,固定化柚苷酶的酶活力會(huì)明顯降低。綜上所述,采用2.0 h 作為交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)研究。

    圖2 交聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.2 Effect of crosslinking time on the activity of immobilized naringinase

    2.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的工藝研究

    2.2.1 固定化溫度對固定化柚苷酶酶活力的影響 由圖3 可以看出,當(dāng)固定化溫度在20~40 ℃時(shí),固定化柚苷酶最佳的固定化溫度為25 ℃,酶活力達(dá)到最高;大于25 ℃后,酶活力隨之下降,溫度對于柚苷酶的性質(zhì)影響較大,酶分子的構(gòu)象由此可能發(fā)生變化,導(dǎo)致游離柚苷酶酶活力下降,不能與載體更好地進(jìn)行結(jié)合,進(jìn)而使固定化柚苷酶的酶活力下降。故選擇25 ℃為柚苷酶的最佳固定化溫度。

    圖3 固定化溫度對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization temperature on the activity of immobilized naringinase

    2.2.2 偶聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響將已交聯(lián)的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球與柚苷酶酶液充分混合并使其結(jié)合,因其孔道中存在大量的活性基團(tuán),可以使酶分子與載體逐步連接。由圖4 可以看出,當(dāng)交聯(lián)時(shí)間小于4 h 時(shí),偶聯(lián)時(shí)間越長,固定化柚苷酶酶活力越大,在4 h 時(shí)達(dá)到最高;偶聯(lián)時(shí)間大于4 h 時(shí),酶活力隨時(shí)間的延長不增反而降低。這是由于偶聯(lián)時(shí)間過長材料表面的酶分子過于聚集,形成立體效應(yīng),致使酶分子不能與底物充分接觸,從而使酶活力下降;同時(shí),一部分酶分子深入到載體微球的孔隙中,致使底物難以和孔道內(nèi)部的酶進(jìn)一步反應(yīng),導(dǎo)致酶活力降低[34]。

    圖4 偶聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.4 Effect of coupling time on the activity of immobilized naringinase

    2.2.3 給酶量對固定化柚苷酶酶活力的影響 如圖5 所示,一定范圍內(nèi),固定化柚苷酶的酶活力隨著給酶量的增加逐漸增加,當(dāng)給酶量為465.6 U/mL時(shí),酶活力達(dá)到最高,之后隨著給酶量進(jìn)一步增加,酶活力降低。這是因?yàn)楫?dāng)給酶量為465.6 U/mL 時(shí),載體的反應(yīng)位點(diǎn)可能被酶分子完全占據(jù),而給酶量的進(jìn)一步增加,會(huì)使過多酶分子通過擠壓現(xiàn)有酶分子覆蓋的孔位置來擴(kuò)大其與載體的連接[35],致使酶和底物不能進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng),最終導(dǎo)致酶活力降低。作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期對固定化柚苷酶的相關(guān)研究及其他相關(guān)文獻(xiàn)中也出現(xiàn)了類似的實(shí)驗(yàn)規(guī) 律[12,21,35-41]。

    圖5 給酶量對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the activity of immobilized naringinase

    2.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

    2.3.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 如圖6(a)所示,游離柚苷酶在pH 為3.0~6.0 時(shí),酶活力變化比較大,在pH 為6.0 時(shí)僅剩余32%的酶活力,當(dāng)pH 為8.0 時(shí)酶活力非常低(接近于0);而固定化柚苷酶在pH 為4.5~8.0 時(shí),一直保持46%以上的酶活力。與游離柚苷酶相比,固定化柚苷酶有更好的耐堿性,且隨pH 的增加,變化趨勢較為緩和。

    固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 與材料性能及其所在的微環(huán)境有較大關(guān)系。本研究中,固定化柚苷酶的最適pH 向堿性方向發(fā)生了偏移,這可能是由于羧甲基殼聚糖帶有游離氨基,為陽離子型載體,當(dāng)柚苷酶被固定在微球上時(shí),表面會(huì)帶有一定的負(fù)電荷,從而吸附溶液中的部分陽離子特別是氫離子[42],使固定化柚苷酶擴(kuò)散層的氫離子濃度稍高于外部溶液,即呈弱酸性,因此外部溶液的pH(即固定化柚苷酶的最佳pH)需要調(diào)節(jié)為弱堿性(即pH為7.5,如圖6(a)所示),才能抵消微環(huán)境的作用[43]。作者所在研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中制備了多種固定化柚苷酶,其中部分固定化柚苷酶的最佳pH 在4.5~5.5[12,36-37],主要應(yīng)用于一些酸性柚柑果汁的脫苦處理和酒類增香等;另外一部分固定化柚苷酶的最佳pH 在7.0~8.0[38-40],可用于堿性醫(yī)藥中間體(如普魯寧等)的制備。進(jìn)一步結(jié)合柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶活性的特性,固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 變化較大,非但不會(huì)限制柚苷酶的應(yīng)用,反而在很大程度上拓寬了其在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用范圍。

    同時(shí),在圖6(b)中可以看出,將固定化柚苷酶和游離柚苷酶分別加入到pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中。將其放在4 ℃冰箱內(nèi)保存2 h,測定酶活力。固定化柚苷酶酶活力的變化比游離柚苷酶的緩和,說明固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的pH 穩(wěn)定性。

    圖6 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性Fig.6 Optimum reaction pH and pH stability of free enzyme and immobilized naringinase

    2.3.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 如圖7(a)所示,固定化柚苷酶和游離柚苷酶的酶活力均隨著反應(yīng)溫度的升高表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度均為55 ℃,但當(dāng)溫度在40~65 ℃時(shí),固定化柚苷酶酶活力保持在80%以上,而游離柚苷酶在溫度低于45 ℃和高于60 ℃時(shí)酶活力小于80%。與此同時(shí),由圖7(b)可以看出,將固定化柚苷酶和游離柚苷酶,同時(shí)置于55 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)0、2、4、6、8 h,分別測其酶活力。與游離柚苷酶相對比,隨著時(shí)間的變化,固定化柚苷酶的酶活力變化更緩和,故固定化柚苷酶比游離柚苷酶表現(xiàn)出更優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。

    圖7 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性Fig.7 Optimum reaction temperature and thermal stability of free enzyme and immobilized naringinase

    2.3.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的儲藏穩(wěn)定性 如圖8 所示,固定化柚苷酶在4 ℃的條件下儲藏30 d 后,仍然剩余70%以上的酶活力;而游離柚苷酶在儲藏期間酶活力顯著降低,在儲藏15 d 后酶活力迅速下降,保存30 d 后只剩余25%的酶活力。結(jié)果表明,固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的儲藏穩(wěn)定性[44],尤其是在酶需要長時(shí)間保存和長距離運(yùn)輸上有巨大的潛力。

    圖8 固定化柚苷酶的儲藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized naringinase

    2.4 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的載酶率、酶活力回收率及重復(fù)使用性

    在最佳條件下,利用海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球?qū)﹁周彰高M(jìn)行固定化,其酶比活力、載酶率和酶活力回收率分別為203.33 U/g、36.80%以及62.15%。同時(shí),在弱堿性條件下(pH 為7.5),固定化柚苷酶經(jīng)過3 次重復(fù)使用后,仍能保持46.90%的初始酶活力,比作者所在團(tuán)隊(duì)之前研究中固定化柚苷酶在堿性條件下制備普魯寧的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(pH為8.0 時(shí),經(jīng)過3 次重復(fù)使用后,固定化柚苷酶的酶活力剩余38.80%[40])有顯著提高。這也在很大程度上表明,堿性條件下應(yīng)用固定化柚苷酶進(jìn)行催化反應(yīng)的難度始終較大,但是對于制備堿性醫(yī)藥中間體(如普魯寧等)具有十分重要的研究意義,需要進(jìn)一步突破研究瓶頸。

    2.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究

    游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線如圖9 所示。經(jīng)計(jì)算,固定化柚苷酶水解柚皮苷的Km值為0.94 g/L,高于游離柚苷酶水解柚皮苷的Km值(0.81 g/L),可以得出,相對于游離柚苷酶而言,固定化柚苷酶對柚皮苷的親和力更低;海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶與底物發(fā)生酶解反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax(0.51 g/(L·min))比游離柚苷酶水解反應(yīng)的Vmax(1.88 g/(L·min))小,這是因?yàn)楣潭ɑ周彰妇哂锌臻g效應(yīng),使底物難以與酶接觸,進(jìn)而使得酶促反應(yīng)速率下降[45]。進(jìn)一步由Vmax=kcat[E]可得kcat=Vmax/[E],固定化柚苷酶的最大反應(yīng)速率Vmax雖然比游離柚苷酶小,但固定化柚苷酶的[E]也比游離柚苷酶小得多,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,固定化柚苷酶與游離柚苷酶對底物降解的kcat值分別為1.41 min-1和1.33 min-1,表明固定化柚苷酶具有更高的催化效率。

    圖9 游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線Fig.9 Double reciprocal curve of enzymatic hydrolysis of free naringinase and immobilized naringinase

    3 結(jié)語

    以海藻酸鈉、羧甲基殼聚糖及硅膠為原材料制備的微球?yàn)檩d體,以體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛作交聯(lián)劑,對柚苷酶進(jìn)行固定化。結(jié)果表明,最佳固定化條件:硅膠/羧甲基殼聚糖微球質(zhì)量比1.0∶1.5、交聯(lián)時(shí)間2.0 h、最佳固定化溫度25 ℃、偶聯(lián)時(shí)間4 h、給酶量465.6 U/mL,此時(shí)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的酶比活力、載酶率和酶活力回 收率分別為 203.33 U/g、36.80% 以 及62.15%。同時(shí),固定化柚苷酶在弱堿性條件下,循環(huán)利用3 次之后,依然剩余46.90%的酶活力,在制備堿性醫(yī)藥中間體(如普魯寧等)方面具有較大的應(yīng)用潛力。另外,對海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示,相比游離柚苷酶,固定化柚苷酶對pH 和溫度都表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性,具有良好的操作穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性。作者將羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠作為載體進(jìn)行柚苷酶的固定化研究,所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為創(chuàng)新酶固定化載體,進(jìn)一步拓寬柚苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供了充分的技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。

    猜你喜歡
    羧甲基海藻硅膠
    海藻保鮮膜:來自海洋的天然“塑料”
    軍事文摘(2023年18期)2023-10-31 08:10:50
    海藻球
    海藻與巖石之間
    歐盟:海藻酸、海藻酸鹽作為食品添加劑無安全風(fēng)險(xiǎn)
    厚樸酚中壓硅膠柱層析純化工藝的優(yōu)化
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:46
    羧甲基纖維素鈉凝膠載體的制備及其控制釋放作用的研究
    粗孔活性硅膠從含鈾廢水中吸附鈾的研究
    羧甲基羅望子膠的制備與表征
    人參皂苷Rg1鍵合硅膠固定相的制備、表征及應(yīng)用(二)
    羧甲基甘薯淀粉鈉的理化特性研究
    婷婷色综合大香蕉| 国产精品一国产av| 水蜜桃什么品种好| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美国产精品一级二级三级| 性少妇av在线| 精品国产露脸久久av麻豆| 黄色一级大片看看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 少妇精品久久久久久久| av视频免费观看在线观看| 午夜免费观看性视频| 国产深夜福利视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 免费看av在线观看网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 中文字幕制服av| 涩涩av久久男人的天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 老熟女久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产一区二区 视频在线| 国产成人啪精品午夜网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品成人在线| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产av精品麻豆| 亚洲国产精品999| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av综合色区一区| 人妻人人澡人人爽人人| 观看美女的网站| 午夜日韩欧美国产| 免费日韩欧美在线观看| 曰老女人黄片| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品一区蜜桃| 老司机靠b影院| 久久精品久久久久久久性| 欧美日韩亚洲高清精品| 三上悠亚av全集在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品久久久久久久久免| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 最近的中文字幕免费完整| 欧美日韩精品网址| 久久久久久人人人人人| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 99香蕉大伊视频| 婷婷色综合大香蕉| 最黄视频免费看| 69精品国产乱码久久久| 观看av在线不卡| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片 在线播放| 国产 一区精品| 又大又爽又粗| 亚洲av电影在线进入| 久久国产精品大桥未久av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 女人久久www免费人成看片| 久久av网站| 亚洲精品美女久久av网站| 国产高清不卡午夜福利| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜福利免费观看在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美xxⅹ黑人| 日韩一本色道免费dvd| 中文欧美无线码| 国产精品国产三级专区第一集| 成人手机av| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 日日撸夜夜添| 国产成人啪精品午夜网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 99久久综合免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av不卡在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲欧洲日产国产| 中国三级夫妇交换| 操出白浆在线播放| 国产精品免费大片| 国产精品一国产av| 麻豆av在线久日| 亚洲av福利一区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成人影院久久| 黄色怎么调成土黄色| av不卡在线播放| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 下体分泌物呈黄色| 久久精品久久久久久久性| 高清在线视频一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 午夜福利,免费看| 国产免费福利视频在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 90打野战视频偷拍视频| 国产免费现黄频在线看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久精品国产亚洲av高清一级| 在线看a的网站| 亚洲av日韩在线播放| 精品福利永久在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲三区欧美一区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 女性被躁到高潮视频| 国产片特级美女逼逼视频| 老司机影院成人| 五月天丁香电影| 韩国av在线不卡| 青春草国产在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品一二三| 久久女婷五月综合色啪小说| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品一二三| 看免费成人av毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩伦理黄色片| 精品午夜福利在线看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 天美传媒精品一区二区| 一级毛片我不卡| 免费黄色在线免费观看| av在线app专区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成年人免费黄色播放视频| 国产av码专区亚洲av| 十八禁人妻一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美另类一区| 一二三四中文在线观看免费高清| 在现免费观看毛片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 波多野结衣av一区二区av| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 青草久久国产| 精品一区二区免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 各种免费的搞黄视频| 99香蕉大伊视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品国产一区二区久久| 国产男人的电影天堂91| 国产1区2区3区精品| www日本在线高清视频| av在线app专区| 女人久久www免费人成看片| 18在线观看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 午夜免费鲁丝| 一二三四在线观看免费中文在| 免费黄网站久久成人精品| a级片在线免费高清观看视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产97色在线日韩免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲国产日韩一区二区| 国产探花极品一区二区| 午夜日本视频在线| 一级片'在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜精品国产一区二区电影| 九草在线视频观看| 国产一区二区在线观看av| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 青春草国产在线视频| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | h视频一区二区三区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 桃花免费在线播放| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲欧洲日产国产| 成年人午夜在线观看视频| av在线老鸭窝| 午夜福利在线免费观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 七月丁香在线播放| 啦啦啦在线免费观看视频4| 黄色视频在线播放观看不卡| 蜜桃在线观看..| 欧美日韩一级在线毛片| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲伊人色综图| 天天操日日干夜夜撸| 欧美久久黑人一区二区| 女人精品久久久久毛片| 男人舔女人的私密视频| 婷婷色av中文字幕| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美97在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 三上悠亚av全集在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 日本色播在线视频| 一级毛片我不卡| av视频免费观看在线观看| 一区在线观看完整版| 一区二区三区乱码不卡18| avwww免费| 亚洲av国产av综合av卡| 一区二区三区四区激情视频| 如何舔出高潮| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| svipshipincom国产片| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产一区有黄有色的免费视频| av网站免费在线观看视频| 国产精品免费大片| 欧美 日韩 精品 国产| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久ye,这里只有精品| 婷婷色av中文字幕| 成人免费观看视频高清| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久久久精品性色| 尾随美女入室| 大香蕉久久网| 久久精品亚洲av国产电影网| 午夜免费鲁丝| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| a级毛片在线看网站| 亚洲情色 制服丝袜| 嫩草影视91久久| 久久人妻熟女aⅴ| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品国产区一区二| 看十八女毛片水多多多| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 看非洲黑人一级黄片| 一本大道久久a久久精品| 亚洲国产看品久久| 久久99精品国语久久久| 大片免费播放器 马上看| 国产又色又爽无遮挡免| 成人国产麻豆网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本av免费视频播放| av国产久精品久网站免费入址| 久久久精品免费免费高清| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品少妇内射三级| 久久久久久人妻| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产 一区精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 午夜福利在线免费观看网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 午夜久久久在线观看| 飞空精品影院首页| 男女边摸边吃奶| 99久国产av精品国产电影| 精品视频人人做人人爽| 亚洲免费av在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲国产看品久久| 少妇的丰满在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美精品一区二区免费开放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美精品一区二区免费开放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一级,二级,三级黄色视频| 无限看片的www在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 久久 成人 亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产精品一区二区精品视频观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 丝袜喷水一区| av免费观看日本| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 97人妻天天添夜夜摸| 免费观看人在逋| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产高清国产精品国产三级| 久久毛片免费看一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本欧美视频一区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日本91视频免费播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 最新的欧美精品一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 看十八女毛片水多多多| 卡戴珊不雅视频在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲国产精品一区三区| 尾随美女入室| 成人漫画全彩无遮挡| 考比视频在线观看| 欧美中文综合在线视频| 人妻 亚洲 视频| 亚洲欧洲日产国产| 日韩电影二区| 国产精品三级大全| kizo精华| 制服人妻中文乱码| 国产精品二区激情视频| 天堂8中文在线网| 欧美黄色片欧美黄色片| 人人澡人人妻人| 免费在线观看完整版高清| 男女国产视频网站| 国产毛片在线视频| 午夜免费鲁丝| av有码第一页| 亚洲成人手机| 99国产综合亚洲精品| 久久 成人 亚洲| 国产精品.久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 啦啦啦 在线观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久精品人妻al黑| 最近中文字幕高清免费大全6| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产精品一区三区| 欧美日本中文国产一区发布| 久久 成人 亚洲| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产欧美网| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 91精品国产国语对白视频| 成年人免费黄色播放视频| 国产99久久九九免费精品| 十八禁网站网址无遮挡| 中文字幕高清在线视频| 色94色欧美一区二区| 午夜91福利影院| 亚洲成色77777| 好男人视频免费观看在线| 国产精品一区二区在线观看99| 嫩草影院入口| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲一区中文字幕在线| 最近最新中文字幕大全免费视频 | av视频免费观看在线观看| 夫妻午夜视频| 亚洲,欧美,日韩| 天堂8中文在线网| 日本黄色日本黄色录像| 91精品伊人久久大香线蕉| 女性生殖器流出的白浆| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产免费现黄频在线看| av不卡在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 又大又爽又粗| 韩国高清视频一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲图色成人| 777米奇影视久久| 精品一区二区三卡| 久久ye,这里只有精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 高清不卡的av网站| 午夜福利在线免费观看网站| www日本在线高清视频| 电影成人av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品二区激情视频| 亚洲第一区二区三区不卡| xxx大片免费视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日日爽夜夜爽网站| 精品人妻在线不人妻| 香蕉国产在线看| 亚洲色图综合在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品一国产av| 晚上一个人看的免费电影| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕制服av| 操美女的视频在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一级片'在线观看视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品第二区| 老司机影院成人| 国产一区二区激情短视频 | 校园人妻丝袜中文字幕| 国产探花极品一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 国产又色又爽无遮挡免| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品一品国产午夜福利视频| 超色免费av| 大片免费播放器 马上看| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品一区蜜桃| 男女下面插进去视频免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 男女免费视频国产| 9191精品国产免费久久| 捣出白浆h1v1| 一级毛片电影观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 90打野战视频偷拍视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久这里只有精品19| 老司机靠b影院| 满18在线观看网站| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利在线免费观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲国产精品国产精品| 美女主播在线视频| 国产精品一二三区在线看| 午夜福利在线免费观看网站| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜影院在线不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久精品人人爽人人爽视色| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产一区二区三区综合在线观看| 成人影院久久| 美女中出高潮动态图| 日日撸夜夜添| 国产成人欧美| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产 精品1| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丝袜美足系列| 国产精品二区激情视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产精品成人在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 午夜免费鲁丝| 美女午夜性视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线观看人妻少妇| 精品久久蜜臀av无| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| xxxhd国产人妻xxx| 大香蕉久久网| 国精品久久久久久国模美| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 999精品在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产片特级美女逼逼视频| 18在线观看网站| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品国产三级专区第一集| 99久久综合免费| 黑丝袜美女国产一区| 高清欧美精品videossex| 色网站视频免费| 国产在视频线精品| 国产成人精品久久二区二区91 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲综合色网址| 国产淫语在线视频| 欧美中文综合在线视频| 久久亚洲国产成人精品v| 美女福利国产在线| 老司机影院毛片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 美女大奶头黄色视频| 久久久久网色| 色94色欧美一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 久久99一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 欧美xxⅹ黑人| 在线 av 中文字幕| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一本久久精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产免费视频播放在线视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 无限看片的www在线观看| 看十八女毛片水多多多| 超碰成人久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲少妇的诱惑av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人三级做爰电影| 欧美黑人精品巨大| 观看美女的网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲中文av在线| 99久国产av精品国产电影| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本91视频免费播放| 国产男人的电影天堂91| 亚洲,欧美,日韩| 9191精品国产免费久久| 男女下面插进去视频免费观看| 国产 精品1| 免费在线观看黄色视频的| 一个人免费看片子| 高清av免费在线| 国产不卡av网站在线观看| 久久热在线av| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲成人手机| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品免费视频内射| 男人操女人黄网站| 国产野战对白在线观看| xxx大片免费视频| 另类亚洲欧美激情| av在线播放精品| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产亚洲av高清不卡| 婷婷色麻豆天堂久久| 韩国精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 美女午夜性视频免费| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲久久久国产精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精品视频女| 丰满饥渴人妻一区二区三| 女人精品久久久久毛片| av国产久精品久网站免费入址| 国产av码专区亚洲av| 最近的中文字幕免费完整| 国产麻豆69| 午夜免费观看性视频| 久久综合国产亚洲精品|