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    海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的研究

    2023-03-09 04:27:14于曉婷陳曉藝王淑婧王添譽(yù)李憲臻
    關(guān)鍵詞:羧甲基海藻硅膠

    于曉婷,陳曉藝,李 苗,王淑婧,王添譽(yù),李 僉,李憲臻

    (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

    酶是一種生物催化劑,因其擁有綠色、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注。但是,由于其物理和化學(xué)特性的不穩(wěn)定,使得在實(shí)際使用中不能長時(shí)間維持其催化活性,因而不能充分發(fā)揮其催化作用[1]。酶固定化技術(shù)是通過采用合適的固定化工藝,將游離酶固定到易于循環(huán)利用的載體上,固定化材料、制備方法、酶用量以及固定化條件等皆會(huì)影響酶的固定化效果[2]。

    從1910 年開始,隨著新型固定化載體的不斷涌現(xiàn),固定化酶領(lǐng)域發(fā)展迅速。載體通常需要根據(jù)固定化酶的應(yīng)用要求進(jìn)行選擇[3]。固定化酶常用的載體可以分為以下4 類:無機(jī)載體(二氧化硅、活性炭等[4])、天然有機(jī)物(纖維素、殼聚糖、海藻酸鈉等[5-6])、合成高分子材料(環(huán)氧樹脂、聚丙烯腈膜等[7])和復(fù)合載體(有機(jī)物質(zhì)與無機(jī)物質(zhì)混合構(gòu)成的載體,例如磁性復(fù)合微球等[8])。常用的固定化酶方法有以下幾種:1)吸附法是指通過范德華力作用,酶和載體進(jìn)行結(jié)合,但是這樣的力常常不是很強(qiáng),造成酶和載體之間反應(yīng)不夠牢固,在使用時(shí),酶很容易脫落進(jìn)入反應(yīng)溶液中,造成回收困難[9]。2)交聯(lián)法是通過兩種或多種功能的交聯(lián)劑,將酶分子和載體連接起來的固定化方式。為了避免酶從載體上掉落,通常不單獨(dú)使用交聯(lián)法,而與包埋法或吸附法組合應(yīng)用[10]。3)共價(jià)偶聯(lián)法(又稱為共價(jià)結(jié)合法)是通過在酶和載體之間形成共價(jià)鍵來固定酶的一種工藝。和其他方法相比,該方法反應(yīng)條件較復(fù)雜,不僅在一定程度上會(huì)引起酶蛋白在空間上特定結(jié)構(gòu)的變化,還有可能破壞酶的活性中心,從而導(dǎo)致酶活力降低。

    柚皮苷是一種二氫類黃酮化合物,口感苦澀,在柑橘類果品中十分常見。為了改善其苦澀味道,柚苷酶通常用于去除柚柑類產(chǎn)品(如果汁等)的苦味[11]。柚苷酶是一種復(fù)合酶,具有α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)兩種活性[12-14],其在自然界中的動(dòng)物、植物、微生物中普遍存在[13]。柚苷酶水解柚皮苷主要經(jīng)過兩個(gè)步驟:第一步,柚皮苷經(jīng)過α-L-鼠李糖苷酶水解為α-L-鼠李糖和普魯寧兩種物質(zhì),普魯寧的苦味遠(yuǎn)低于柚皮苷(其苦味值僅為柚皮苷的一半);第二步,普魯寧被β-D-葡萄糖苷酶水解生成葡萄糖及柚皮素,這兩種產(chǎn)物均沒有苦味[14]。迄今為止,柚苷酶在柑橘類水果脫苦、葡萄酒調(diào)味、醫(yī)藥工業(yè)等方面發(fā)揮著重要作用[15-18]。

    在已有固定化柚苷酶的報(bào)道中,殼聚糖是一種較為常用的固定化載體,是廣泛存在于自然界的天然高分子物質(zhì),具有生物相容性好[19]、安全無毒、易降解等優(yōu)點(diǎn)[20]。段志濤等分別用殼聚糖和海藻酸鈉微球?qū)﹁周彰高M(jìn)行共價(jià)鍵合,其酶比活力分別為14.34 U/g 和12.18 U/g[21]。此外,作為殼聚糖的衍生物,羧甲基殼聚糖是將羧甲基等基團(tuán)加入到殼聚糖的內(nèi)部,其中富含大量的羧基和氨基等功能基團(tuán),在中性和堿性條件下,水溶性較好,因此有效改善了殼聚糖的溶解性能[22]。并且與單純的殼聚糖材料相比較,羧甲基殼聚糖表現(xiàn)出更優(yōu)異的生物相容性,同時(shí)能夠與Ca2+交聯(lián)產(chǎn)生致密結(jié)構(gòu),對活性化合物的吸附和控制釋放有非常好的效果。肖安風(fēng)等用聚乙烯醇和海藻酸鈉形成的復(fù)合材料進(jìn)行固定化柚苷酶的相關(guān)研究,酶比活力達(dá)到19 U/g[23]。與此同時(shí),海藻酸鈉也是一種天然多糖類物質(zhì),同樣可以與Ca2+交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)[24]。雖然海藻酸鹽微球羥基和羧基含量豐富,但由于其強(qiáng)度不高,導(dǎo)致微球結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定,最好引入一些無機(jī)載體來增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度,例如二氧化硅,是最受歡迎的無機(jī)載體之一,具有良好的物理和機(jī)械穩(wěn)定性,無膨脹,耐有機(jī)物、高酸度和高溫等顯著優(yōu)點(diǎn)[25]。與此同時(shí),海藻酸鈉、硅膠、羧甲基殼聚糖均為綠色、對環(huán)境友好、價(jià)格相對便宜的原料,能夠有效降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。

    迄今為止,鮮有關(guān)于羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠為材料對柚苷酶進(jìn)行固定化的報(bào)道,作者以羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、硅膠為基材制備微球,對柚苷酶進(jìn)行固定化,優(yōu)化了硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比、交聯(lián)時(shí)間、固定化溫度、偶聯(lián)時(shí)間等條件,并探索和分析了固定化柚苷酶和游離柚苷酶發(fā)生酶解反應(yīng)的最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度、重復(fù)使用性等,為創(chuàng)新酶固定化載體,不斷拓寬柚苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供了技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.2 儀器與設(shè)備

    DENVER INSTRUMENT TP-213 精密天平:美國丹佛儀器有限公司產(chǎn)品;78-1 型磁力加熱攪拌器:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品;知楚三層立式搖床:上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品;PHS-3C 型pH 計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品;HH-8 型恒溫水浴鍋:常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;Tecan 酶標(biāo)儀:勒菲生物科技(上海)有限公司產(chǎn)品。

    1.3 方法

    1.3.1 微球載體及固定化柚苷酶的制備

    1)滴入法制備海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球 首先配制1.5 g/dL 海藻酸鈉溶液(溶液A),將100 mL 去離子水和1.5 g 海藻酸鈉加入到250 mL 的燒杯中,置于磁力加熱攪拌器上進(jìn)行攪拌至溶解后,再加入1.0 g 硅膠和1.5 g 羧甲基殼聚糖,繼續(xù)劇烈攪拌待其形成均一溶液后停止。配制2 g/dL CaCl2溶液(溶液B),稱取4 g CaCl2于燒杯中加水溶解,轉(zhuǎn)移到200 mL 容量瓶中定容。將溶液B 轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中,加入磁子后,將其置于恒溫加熱磁力攪拌器上,在溫度為25 ℃條件下進(jìn)行低速攪拌。利用1 mL 的注射器將溶液A 緩慢逐滴加入到溶液B 中,滴入瞬間在溶液B 中可以看到生成的微球,注意滴入速度不能過快,防止微球粘連。溶液A 全部加入后,微球?yàn)V出加入新的CaCl2溶液,同樣的低轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌1 h,結(jié)束后,用去離子水將微球洗滌數(shù)次。最后,將微球平鋪在濾紙上,吸干其表面水分,4 ℃冷藏。

    2)戊二醛交聯(lián)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球的制備 將0.4 g 上述微球放入到1 mL 體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛溶液中,在25 ℃搖床中交聯(lián)2.0 h。反應(yīng)結(jié)束后,用去離子水洗滌數(shù)次,將微球平鋪在濾紙上,吸干其表面水分,即得到戊二醛交聯(lián)的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球,冷藏備用。

    3)固定化柚苷酶的制備 取0.4 g 已交聯(lián)的微球載體,加入4 mL 柚苷酶酶液,置于25 ℃搖床上振蕩2 h,并于4 ℃冰箱中靜置吸附偶聯(lián)4 h。用去離子水清洗數(shù)次,將載體表面未固定化的剩余酶液沖洗干凈,濾紙吸干水分獲得固定化柚苷酶,于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 酶學(xué)性質(zhì)表征

    提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣,可幫助學(xué)生改善學(xué)習(xí)效率,并使生物成績快速提升。在教學(xué)實(shí)踐中,教師可通過引導(dǎo)學(xué)生觀察大自然的方式提升學(xué)生對于生物課程的興趣。首先教師可利用假期時(shí)間,邀請學(xué)生進(jìn)入到大自然中開展活動(dòng),在活動(dòng)中,教師可開展相關(guān)的生物實(shí)驗(yàn),以幫助學(xué)生認(rèn)識到大自然的魅力與生物的多樣性。之后教師可組織學(xué)生在課堂中將活動(dòng)的體會(huì)進(jìn)行分享。通過這樣的活動(dòng)學(xué)生將對自然環(huán)境產(chǎn)生新的認(rèn)識,并將在教師的引導(dǎo)下對生物課程產(chǎn)生較為濃厚的興趣。

    1)酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化 研究了海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶酶解反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、pH 穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性。通過測定4 ℃、30 d 內(nèi)酶活力變化,研究了固定化柚苷酶的儲藏穩(wěn)定性,同時(shí)計(jì)算了固定化柚苷酶的載酶率和酶活力回收率。

    2)酶活力的測定 選擇改進(jìn)的Davis 法[26-29],稱取0.4 g 固定化柚苷酶或移取0.2 mL 游離柚苷酶于1.5 mL 離心管中,加入0.8 mL 的柚皮苷溶液(0.8 mg/mL),混合均勻并置于恒溫水浴鍋中,在溫度為55 ℃條件下加熱30 min,反應(yīng)停止后,取0.1 mL 上清液,加入到提前配制好的溶液C(體積分?jǐn)?shù)95%一縮二乙二醇5 mL 和4 mol/L 氫氧化鈉0.1 mL)中,振蕩混勻,待其反應(yīng)10 min 后,在波長為420 nm 條件下測定OD 值。

    柚苷酶酶活力:在最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度條件下,在1 min 內(nèi)酶解質(zhì)量為1 μg 的柚皮苷所需要的酶量稱作一個(gè)酶活力單位,其單位為U。

    酶比活力:在最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度條件下,1 g 固定化柚苷酶或1 mL 游離柚苷酶具有的酶活力,其單位為U/g 或U/mL。

    3)相關(guān)計(jì)算公式[30]固定化柚苷酶的載酶率由下式(1)計(jì)算得出:

    式中:B 為載酶率,%;A0為柚苷酶固定前游離柚苷酶的總酶活力;A1為柚苷酶固定后上清液中剩余的酶活力。

    酶活力回收率由下式(2)計(jì)算得出:

    式中:R 為酶活力回收率,%;A2為固定化柚苷酶的總酶活力。

    固定化柚苷酶相對酶活力計(jì)算公式如下式(3):

    式中:Q 為相對酶活力,%;P 為某一條件下的酶活力;K 為該條件下的最高酶活力。

    1.3.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定 取0.2 mL 游離柚苷酶,加入0.8 mL 柚皮苷溶液中(質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),在pH 為4.5,溫度為55 ℃條件下,進(jìn)行酶解反應(yīng),測定酶活力;取40 mg 固定化柚苷酶,加入0.8 mL 柚皮苷溶液中(質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),在pH 為7.5、溫度為55 ℃條件下,進(jìn)行酶解反應(yīng),測定酶活力。最大反應(yīng)速度(Vmax)和表觀米氏常數(shù)(Km)由Lineweaver-Burk 方程計(jì)算得出,如下式(4):

    2 結(jié)果與分析

    2.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球制備工藝的優(yōu)化

    2.1.1 硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對固定化柚苷酶酶活力的影響 首先,研究了硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對固定化柚苷酶酶活力的影響,結(jié)果如圖1(a)所示。當(dāng)硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比為1.0∶1.5 時(shí),酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)羧甲基殼聚糖質(zhì)量增大時(shí),酶活力隨之減小,這可能是由于微球通過靜電作用形成了復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[31],當(dāng)羧甲基殼聚糖含量過高時(shí),所產(chǎn)生的微球結(jié)構(gòu)相對牢固,壁膜結(jié)構(gòu)致密[32],減少了酶分子與載體結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量。因此,采用硅膠/羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比1.0∶1.5 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1(b)所示,在最佳工藝條件下制備出了機(jī)械強(qiáng)度高、表面光滑且成球性好的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球。

    圖1 硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對固定化柚苷酶酶活力的影響及最佳條件下制備的固定化材料Fig.1 Effect of silica gel/carboxymethyl chitosan mass ratio on the activity of immobilized naringinase and immobilized materials prepared under the optimum conditions

    2.1.2 交聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響 作者以海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球?yàn)檩d體,進(jìn)行固定化柚苷酶。結(jié)果如圖2 所示,載體加入戊二醛溶液后,交聯(lián)時(shí)間在1.0~3.0 h 時(shí),交聯(lián)反應(yīng)2.0 h 達(dá)到最大酶活力,這是因?yàn)榻宦?lián)時(shí)間過短,會(huì)引起酶的脫落[33];交聯(lián)時(shí)間過長,會(huì)造成過高交聯(lián)度,使微球內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑過小,不利于酶促反應(yīng)進(jìn)行,所以交聯(lián)時(shí)間超過2.0 h 后,固定化柚苷酶的酶活力會(huì)明顯降低。綜上所述,采用2.0 h 作為交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)研究。

    圖2 交聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.2 Effect of crosslinking time on the activity of immobilized naringinase

    2.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的工藝研究

    2.2.1 固定化溫度對固定化柚苷酶酶活力的影響 由圖3 可以看出,當(dāng)固定化溫度在20~40 ℃時(shí),固定化柚苷酶最佳的固定化溫度為25 ℃,酶活力達(dá)到最高;大于25 ℃后,酶活力隨之下降,溫度對于柚苷酶的性質(zhì)影響較大,酶分子的構(gòu)象由此可能發(fā)生變化,導(dǎo)致游離柚苷酶酶活力下降,不能與載體更好地進(jìn)行結(jié)合,進(jìn)而使固定化柚苷酶的酶活力下降。故選擇25 ℃為柚苷酶的最佳固定化溫度。

    圖3 固定化溫度對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization temperature on the activity of immobilized naringinase

    2.2.2 偶聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響將已交聯(lián)的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球與柚苷酶酶液充分混合并使其結(jié)合,因其孔道中存在大量的活性基團(tuán),可以使酶分子與載體逐步連接。由圖4 可以看出,當(dāng)交聯(lián)時(shí)間小于4 h 時(shí),偶聯(lián)時(shí)間越長,固定化柚苷酶酶活力越大,在4 h 時(shí)達(dá)到最高;偶聯(lián)時(shí)間大于4 h 時(shí),酶活力隨時(shí)間的延長不增反而降低。這是由于偶聯(lián)時(shí)間過長材料表面的酶分子過于聚集,形成立體效應(yīng),致使酶分子不能與底物充分接觸,從而使酶活力下降;同時(shí),一部分酶分子深入到載體微球的孔隙中,致使底物難以和孔道內(nèi)部的酶進(jìn)一步反應(yīng),導(dǎo)致酶活力降低[34]。

    圖4 偶聯(lián)時(shí)間對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.4 Effect of coupling time on the activity of immobilized naringinase

    2.2.3 給酶量對固定化柚苷酶酶活力的影響 如圖5 所示,一定范圍內(nèi),固定化柚苷酶的酶活力隨著給酶量的增加逐漸增加,當(dāng)給酶量為465.6 U/mL時(shí),酶活力達(dá)到最高,之后隨著給酶量進(jìn)一步增加,酶活力降低。這是因?yàn)楫?dāng)給酶量為465.6 U/mL 時(shí),載體的反應(yīng)位點(diǎn)可能被酶分子完全占據(jù),而給酶量的進(jìn)一步增加,會(huì)使過多酶分子通過擠壓現(xiàn)有酶分子覆蓋的孔位置來擴(kuò)大其與載體的連接[35],致使酶和底物不能進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng),最終導(dǎo)致酶活力降低。作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期對固定化柚苷酶的相關(guān)研究及其他相關(guān)文獻(xiàn)中也出現(xiàn)了類似的實(shí)驗(yàn)規(guī) 律[12,21,35-41]。

    圖5 給酶量對固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the activity of immobilized naringinase

    2.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

    2.3.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 如圖6(a)所示,游離柚苷酶在pH 為3.0~6.0 時(shí),酶活力變化比較大,在pH 為6.0 時(shí)僅剩余32%的酶活力,當(dāng)pH 為8.0 時(shí)酶活力非常低(接近于0);而固定化柚苷酶在pH 為4.5~8.0 時(shí),一直保持46%以上的酶活力。與游離柚苷酶相比,固定化柚苷酶有更好的耐堿性,且隨pH 的增加,變化趨勢較為緩和。

    固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 與材料性能及其所在的微環(huán)境有較大關(guān)系。本研究中,固定化柚苷酶的最適pH 向堿性方向發(fā)生了偏移,這可能是由于羧甲基殼聚糖帶有游離氨基,為陽離子型載體,當(dāng)柚苷酶被固定在微球上時(shí),表面會(huì)帶有一定的負(fù)電荷,從而吸附溶液中的部分陽離子特別是氫離子[42],使固定化柚苷酶擴(kuò)散層的氫離子濃度稍高于外部溶液,即呈弱酸性,因此外部溶液的pH(即固定化柚苷酶的最佳pH)需要調(diào)節(jié)為弱堿性(即pH為7.5,如圖6(a)所示),才能抵消微環(huán)境的作用[43]。作者所在研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中制備了多種固定化柚苷酶,其中部分固定化柚苷酶的最佳pH 在4.5~5.5[12,36-37],主要應(yīng)用于一些酸性柚柑果汁的脫苦處理和酒類增香等;另外一部分固定化柚苷酶的最佳pH 在7.0~8.0[38-40],可用于堿性醫(yī)藥中間體(如普魯寧等)的制備。進(jìn)一步結(jié)合柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶活性的特性,固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 變化較大,非但不會(huì)限制柚苷酶的應(yīng)用,反而在很大程度上拓寬了其在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用范圍。

    同時(shí),在圖6(b)中可以看出,將固定化柚苷酶和游離柚苷酶分別加入到pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中。將其放在4 ℃冰箱內(nèi)保存2 h,測定酶活力。固定化柚苷酶酶活力的變化比游離柚苷酶的緩和,說明固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的pH 穩(wěn)定性。

    圖6 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性Fig.6 Optimum reaction pH and pH stability of free enzyme and immobilized naringinase

    2.3.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 如圖7(a)所示,固定化柚苷酶和游離柚苷酶的酶活力均隨著反應(yīng)溫度的升高表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度均為55 ℃,但當(dāng)溫度在40~65 ℃時(shí),固定化柚苷酶酶活力保持在80%以上,而游離柚苷酶在溫度低于45 ℃和高于60 ℃時(shí)酶活力小于80%。與此同時(shí),由圖7(b)可以看出,將固定化柚苷酶和游離柚苷酶,同時(shí)置于55 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)0、2、4、6、8 h,分別測其酶活力。與游離柚苷酶相對比,隨著時(shí)間的變化,固定化柚苷酶的酶活力變化更緩和,故固定化柚苷酶比游離柚苷酶表現(xiàn)出更優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。

    圖7 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性Fig.7 Optimum reaction temperature and thermal stability of free enzyme and immobilized naringinase

    2.3.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的儲藏穩(wěn)定性 如圖8 所示,固定化柚苷酶在4 ℃的條件下儲藏30 d 后,仍然剩余70%以上的酶活力;而游離柚苷酶在儲藏期間酶活力顯著降低,在儲藏15 d 后酶活力迅速下降,保存30 d 后只剩余25%的酶活力。結(jié)果表明,固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的儲藏穩(wěn)定性[44],尤其是在酶需要長時(shí)間保存和長距離運(yùn)輸上有巨大的潛力。

    圖8 固定化柚苷酶的儲藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized naringinase

    2.4 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的載酶率、酶活力回收率及重復(fù)使用性

    在最佳條件下,利用海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球?qū)﹁周彰高M(jìn)行固定化,其酶比活力、載酶率和酶活力回收率分別為203.33 U/g、36.80%以及62.15%。同時(shí),在弱堿性條件下(pH 為7.5),固定化柚苷酶經(jīng)過3 次重復(fù)使用后,仍能保持46.90%的初始酶活力,比作者所在團(tuán)隊(duì)之前研究中固定化柚苷酶在堿性條件下制備普魯寧的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(pH為8.0 時(shí),經(jīng)過3 次重復(fù)使用后,固定化柚苷酶的酶活力剩余38.80%[40])有顯著提高。這也在很大程度上表明,堿性條件下應(yīng)用固定化柚苷酶進(jìn)行催化反應(yīng)的難度始終較大,但是對于制備堿性醫(yī)藥中間體(如普魯寧等)具有十分重要的研究意義,需要進(jìn)一步突破研究瓶頸。

    2.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究

    游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線如圖9 所示。經(jīng)計(jì)算,固定化柚苷酶水解柚皮苷的Km值為0.94 g/L,高于游離柚苷酶水解柚皮苷的Km值(0.81 g/L),可以得出,相對于游離柚苷酶而言,固定化柚苷酶對柚皮苷的親和力更低;海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶與底物發(fā)生酶解反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax(0.51 g/(L·min))比游離柚苷酶水解反應(yīng)的Vmax(1.88 g/(L·min))小,這是因?yàn)楣潭ɑ周彰妇哂锌臻g效應(yīng),使底物難以與酶接觸,進(jìn)而使得酶促反應(yīng)速率下降[45]。進(jìn)一步由Vmax=kcat[E]可得kcat=Vmax/[E],固定化柚苷酶的最大反應(yīng)速率Vmax雖然比游離柚苷酶小,但固定化柚苷酶的[E]也比游離柚苷酶小得多,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,固定化柚苷酶與游離柚苷酶對底物降解的kcat值分別為1.41 min-1和1.33 min-1,表明固定化柚苷酶具有更高的催化效率。

    圖9 游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線Fig.9 Double reciprocal curve of enzymatic hydrolysis of free naringinase and immobilized naringinase

    3 結(jié)語

    以海藻酸鈉、羧甲基殼聚糖及硅膠為原材料制備的微球?yàn)檩d體,以體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛作交聯(lián)劑,對柚苷酶進(jìn)行固定化。結(jié)果表明,最佳固定化條件:硅膠/羧甲基殼聚糖微球質(zhì)量比1.0∶1.5、交聯(lián)時(shí)間2.0 h、最佳固定化溫度25 ℃、偶聯(lián)時(shí)間4 h、給酶量465.6 U/mL,此時(shí)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的酶比活力、載酶率和酶活力回 收率分別為 203.33 U/g、36.80% 以 及62.15%。同時(shí),固定化柚苷酶在弱堿性條件下,循環(huán)利用3 次之后,依然剩余46.90%的酶活力,在制備堿性醫(yī)藥中間體(如普魯寧等)方面具有較大的應(yīng)用潛力。另外,對海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示,相比游離柚苷酶,固定化柚苷酶對pH 和溫度都表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性,具有良好的操作穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性。作者將羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠作為載體進(jìn)行柚苷酶的固定化研究,所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為創(chuàng)新酶固定化載體,進(jìn)一步拓寬柚苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供了充分的技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。

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