高糖上調(diào)肺泡上皮細(xì)胞大麻素受體1表達(dá)加重結(jié)核分枝桿菌感染引起的細(xì)胞損傷

馬庭喜 唐朦

(西安市胸科醫(yī)院結(jié)核合并證科，陜西 西安 710061)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(M.tb)引起的一種慢性消耗性人畜共患傳染病，發(fā)病后會產(chǎn)生結(jié)核結(jié)節(jié)、鈣化灶或者干酪樣結(jié)節(jié)等病理性特征〔1〕。結(jié)核病早已成為全世界的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重影響并威脅人類身體健康〔2〕。近年來，糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者數(shù)量增長引發(fā)學(xué)者們探究兩者之間的關(guān)系。世界衛(wèi)生組織(WHO)已經(jīng)確定，糖尿病是肺結(jié)核重要且容易被忽視的危險因素〔3〕。大麻素受體(CB)1廣泛分布于人體各個系統(tǒng)。CB1在人體很多病理生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用〔4〕。CB1拮抗劑能夠降低胰島素耐受，對糖尿病患者有很好的治療效果〔5〕。有研究表明，CB1拮抗劑能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞損傷〔6〕，在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用。但其是否參與糖尿病合并肺結(jié)核的病理進(jìn)程，并沒有相關(guān)報道。本文通過構(gòu)建高糖環(huán)境下M.tb感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷模型，探討CB1對損傷模型細(xì)胞生物學(xué)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1材料 人肺泡上皮細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。M.tb菌株H37Rv為本實驗保存。利莫那班(WIN55212-2)購自英國Tocris公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex mixture購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；兔多克隆抗CB1抗體、鼠單克隆TLR4抗體和兔多克隆MyD88抗體購自美國Abcam公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，CCK-8檢測試劑盒，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理 肺泡上皮細(xì)胞A549使用含有10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，融合度達(dá)到80%～90%時傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，按照葡萄糖濃度分為0、5、10、25、50 mmol/L組，按分組處理細(xì)胞，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞總蛋白，檢測細(xì)胞中CB1蛋白表達(dá)；另外收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS檢測。為了構(gòu)建高糖環(huán)境下M.tb感染的細(xì)胞模型，用含有25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，加入感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的M.tb菌株H37Rv，再置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗。將A549細(xì)胞隨機(jī)分為高糖(HG)組，高糖M.tb(HG+M.tb)組，CB1激動劑(WIN55212-2)處理(HG+M.tb+WIN)組和拮抗劑(利莫那班)處理(HG+M.tb+LM)組，按分組處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞上清、蛋白等進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2體外細(xì)胞菌落形成單位(CFU)檢測 高糖作用24 h后，加入M.tb感染12 h，然后收集細(xì)胞，檢測細(xì)菌載量變化，具體方法如下：磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2遍,每孔加入0.1 % Triton-x-100水溶液裂解20 min。取裂解液稀釋不同濃度進(jìn)行涂板,檢測CFU。3～4 d后觀察菌落生長狀況并計數(shù)。CFU計算方法：CFU/ml=C×10n×20(C：3個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)均數(shù)，n為所計數(shù)的培養(yǎng)皿的稀釋倍數(shù))。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 按照試劑盒說明書，用無血清培養(yǎng)基以1∶1 000稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。以H2O2處理組的細(xì)胞為陽性對照。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L。去除各組細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，充分蓋住細(xì)胞，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光情況。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達(dá) 收集不同葡萄糖濃度處理之后的肺泡上皮A549細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。每孔40 μg蛋白質(zhì)總量進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h后，4℃下過夜孵育一抗稀釋液。一抗稀釋倍數(shù)為：CB1(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)。37℃條件下加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)孵育1 h，漂洗后暗室曝光，ECL顯色，Quantity One軟件分進(jìn)行灰度值測定。按分組收集CB1激動劑和拮抗劑處理后的A549細(xì)胞，按照上述方法檢測TLR4和MyD88蛋白表達(dá)。

1.2.5實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測mRNA表達(dá) 將A549細(xì)胞按上述方法處理之后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并檢測其純度以及完整性。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%～3%瓊脂糖凝膠上電泳，依據(jù)2-ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海生工生物工程公司合成,序列如下： MyD88正向:5′-GTG TCT GGT CTA TTG CTA GTG-3′， 反向:5′-CCT TGC TCT GCA GGT AAT C-3′。TLR4正向:5′-CCTGGACCTGAGCTTTAATC-3′,反向:5′-CTGGATTTCACACCTGGATAA-3′。

1.2.6CCK-8檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，按照1×105個/孔接種于96孔板，各組設(shè)定3個平行孔，培養(yǎng)24 h之后，按照上述方法處理各組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h之后加入10 μl CCK-8溶液，37℃下CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育3 h。酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長下的OD值，按照公式計算各孔的細(xì)胞活力：樣本孔讀數(shù)=實測數(shù)字-空白對照孔的讀數(shù)，每孔OD值平均值/對照組OD值的比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.7LDH檢測細(xì)胞毒性 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，按照1×105個/孔接種于96孔板，各組設(shè)定3個平行孔，培養(yǎng)24 h之后，按照上述方法處理各組細(xì)胞，24 h之后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于多孔板離心機(jī)中離心5 min，每孔取0.2 ml上清液進(jìn)行LDH實驗，0.2 ml細(xì)胞上清液加50 μl的LDH工作液，室溫下避光反應(yīng)30 min，在490 nm處檢測OD值。

1.2.8ELISA檢測炎性分子表達(dá) 收集經(jīng)過處理的A549損傷細(xì)胞上清液，取出TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA檢測試劑盒平衡至室溫，按照需要適當(dāng)稀釋樣品濃度，按照試劑盒操作說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α、IL-6、IL-8的最終濃度。

1.2.9流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 按分組收集CB1激動劑和拮抗劑處理后的A549細(xì)胞，按照膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒的說明步驟進(jìn)行操作檢測細(xì)胞凋亡水平。胰蛋白酶加入各組細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞消化，經(jīng)過離心，收集細(xì)胞。PBS清洗2次后重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和PI，室溫避光孵育15 min之后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.2.10試劑盒檢測含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)水平 按分組收集CB1激動劑和拮抗劑處理后的A549細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，去除上清，加入裂解緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)吹打均勻，在冰上裂解10 min。4℃下，10 000 r/min離心5 min收集上清液(胞質(zhì)提取液)并分裝轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度；加入含有二硫蘇糖醇(DTT)的反應(yīng)緩沖液，加入pNA標(biāo)記的蛋白酶底物，于37℃下避光孵育3 h。酶標(biāo)儀405 nm處檢測吸光度值(A405)，Caspase3/9活化水平以實驗組A405值與對照組A405值的比值來表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1高糖環(huán)境下肺泡上皮細(xì)胞中CB1表達(dá) 低濃度葡萄糖處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低。隨著葡萄糖濃度的升高，綠色熒光陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞內(nèi)熒光強度均增加，說明高濃度葡萄糖處理對A549細(xì)胞的損傷加重(圖1)。隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞中CB1蛋白表達(dá)逐漸上升，0、5、10、25、50 nmol/L組CB1蛋白灰度值分別為(1.00±0.09、1.17±0.08、1.49±0.04、2.09±0.12、2.57±0.07)在葡萄糖濃度達(dá)到10 nmol/L起，細(xì)胞中CB1表達(dá)即與正常環(huán)境中的表達(dá)存在顯著性差異(P<0.05)。見圖2。提示CB1可能參與高糖環(huán)境對肺泡上皮細(xì)胞A549的損傷。

圖1 不同濃度葡萄糖處理的肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549中ROS水平(×100)

1～5：0 nmol/L組，5 nmol/L組，10 nmol/L組，25 nmol/L組，50 nmol/L組圖2 Western印跡檢測各組細(xì)胞中CB1蛋白表達(dá)

2.2高糖環(huán)境下M.tb感染對肺泡上皮細(xì)胞的損傷 將A549細(xì)胞在25 nmol/L葡萄糖濃度下培養(yǎng)，隨后用M.tb感染構(gòu)建高糖環(huán)境下的細(xì)胞結(jié)核分枝桿菌感染模型。感染12 h后，與M.tb組相比，HG+M.tb組細(xì)菌存活率明顯降低(P<0.05)。CCK-8結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組和M.tb組細(xì)胞活性均顯著降低(P<0.05)；而HG+M.tb細(xì)胞活性較HG組、M.tb組顯著降低(P<0.05)。與NC組相比，HG組、M.tb組、HG+M.tb組LDH釋放顯著增加，且HG+M.tb組LDH釋放顯著高于HG組及M.tb組(P<0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與NC相比，HG組及M.tb組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8水平均顯著升高(P<0.05)；與HG組及M.tb組相比，HG+M.tb組細(xì)胞炎性因子水平也顯著升高(P<0.05)。提示高糖合并M.tb感染處理細(xì)胞顯著降低了A549細(xì)胞活性及細(xì)菌存活率，并提高了細(xì)胞炎性因子的分泌水平。見圖3、表1。

圖3 高糖環(huán)境下M.tb感染后A549細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

表1 高糖環(huán)境下M.tb感染后A549細(xì)胞活性及分泌的炎性因子水平比較

2.3高糖環(huán)境下CB1對M.tb感染的肺泡上皮細(xì)胞活性和凋亡的影響 構(gòu)建高糖環(huán)境下M.tb感染肺泡上皮細(xì)胞損傷的模型之后，用CB1激動劑(WIN)或拮抗劑(LM)處理細(xì)胞，CCK-8結(jié)果顯示，CB1激動劑處理之后，損傷細(xì)胞活性顯著降低，LDH釋放量顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，線粒體凋亡因子Caspase-3/9水平顯著升高(P<0.05)；而CB1拮抗劑處理之后，損傷細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯升高，LDH釋放明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞凋亡率則顯著降低，Caspase-3/9水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表2。提示高糖環(huán)境下造成肺泡上皮細(xì)胞的損傷，合并M.tb感染后，細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞活力降低更為明顯，細(xì)胞凋亡率更高。CB1激動劑(WIN)對高糖環(huán)境合并M.tb感染造成的細(xì)胞損傷有促進(jìn)作用；而CB1拮抗劑(LM)處理能緩解高糖環(huán)境合并M.tb感染對細(xì)胞的損傷。

圖4 CB1對高糖環(huán)境下M.tb感染之后A549細(xì)胞凋亡水平的影響

表2 CB1對高糖環(huán)境下M.tb感染之后A549細(xì)胞活性及凋亡水平的影響

2.4高糖環(huán)境下CB1對M.tb感染的肺泡上皮細(xì)胞中TLR通路及炎性分子的調(diào)節(jié) CB1激動劑處理損傷細(xì)胞模型后，細(xì)胞中炎癥反應(yīng)通路TLR相關(guān)分子TLR4、髓樣分化因子(MyD88)蛋白及mRNA表達(dá)顯著上升，炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著上升(P<0.05)；而CB1拮抗劑處理后，細(xì)胞中TLR4和MyD88蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8水平，明顯降低(均P<0.05)。見圖4、表3。提示CB1能夠促進(jìn)高糖環(huán)境合并M.tb感染下肺泡上皮細(xì)胞TLR炎癥通路的反應(yīng)及細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8水平。

1～4:HG組、HG+M.tb組、HG+M.tb+WIN組、HG+M.tb+LM組圖4 CB1對高糖環(huán)境下M.tb感染之后A549細(xì)胞中TLR4通路的影響

表3 CB1對高糖環(huán)境下M.tb感染之后A549細(xì)胞TLR4通路及炎性因子水平的影響

3 討 論

糖尿病合并肺結(jié)核患者主要由于營養(yǎng)代謝障礙、機(jī)體免疫力低下，容易被各種病原體感染。據(jù)報道，糖尿病患者肺結(jié)核的概率是正常人群的2～4倍，且兩者之間相互影響。肺泡Ⅱ型上皮是細(xì)胞M.tb由呼吸道吸入之后最先侵染的肺部細(xì)胞。研究表明，作為肺臟細(xì)胞重要組成的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是M.tb感染的主要靶細(xì)胞，也是機(jī)體抗M.tb感染的第一道防線〔7〕。

CB包括CB1和CB2，主要分布于腦部、脊髓及外周神經(jīng)系統(tǒng)中。其中CB1主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CB2主要分布于外周組織〔8〕。研究表明，CB1在2型糖尿病小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)浸潤胰島的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，表明CB1信號通路發(fā)揮促進(jìn)糖尿病進(jìn)展的作用〔9〕。另外，足細(xì)胞中CB1受體過表達(dá)加重了糖尿病腎病的病理進(jìn)程〔10〕。本研究提示CB1可能參與高糖處理對A549細(xì)胞的損傷作用。本研究成功建立了研究糖尿病合并肺結(jié)核的體外細(xì)胞模型。但與文獻(xiàn)報道不同，本研究發(fā)現(xiàn)，高糖A549細(xì)胞24 h后，M.tb感染合并處理12 h，A549細(xì)胞活性即出現(xiàn)明顯下降。而Fine-Coulson等〔7〕報道顯示M.tb單獨感染48 h后，細(xì)胞的線粒體組成及分布出現(xiàn)顯著變化。處理時間的差異可能是由于高糖預(yù)處理使A549細(xì)胞對M.tb感染更敏感。研究表明，CB1拮抗劑能改善脂質(zhì)代謝從而減輕肥胖〔11〕，而其在胰島細(xì)胞中的缺乏能夠保護(hù)高糖誘導(dǎo)的胰島功能障礙和炎性損傷〔12〕。提示CB1在糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的過程中發(fā)揮積極的作用。將CB1激動劑或拮抗劑作用于高糖環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌感染的A549細(xì)胞，結(jié)果表明CB1拮抗劑減輕了高糖環(huán)境下M.tb感染造成的細(xì)胞活性和凋亡的損傷。

TLRs是生物機(jī)體內(nèi)一類中藥的先天性模式識別受體，廣泛分布于心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞、免疫T細(xì)胞等表面。TLRs介導(dǎo)的信號通路中，研究最多的是由TLR2和TLR4介導(dǎo)的通路，可分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑〔13〕。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)敲除TLR2之后，在感染M.tb后體內(nèi)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)受損。而TLR4突變的小鼠與野生型的小鼠比較，前者更易感染M.tb，并出現(xiàn)炎癥增強、粒細(xì)胞增多等特征〔14〕，說明TLR4在M.tb感染細(xì)胞過程中起防御作用。研究表明，對M.tb感染誘導(dǎo)的TLR4/Myd88通路的調(diào)控，是肺結(jié)核的臨床治療的新方向〔15,16〕。本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下M.tb感染A549細(xì)胞之后，細(xì)胞中TLR4和MyD88表達(dá)及炎性因子水平顯著上升，而CB1拮抗劑作用之后降低了其表達(dá)水平。TLRs作為微生物產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器，在免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生局部變化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)CB1拮抗劑能減輕了細(xì)胞模型中的TLR4炎癥通路反應(yīng)，而CB1激動劑則抑制TLR4炎癥通路反應(yīng)。CB1可能通過調(diào)節(jié)TLR通路，進(jìn)一步影響A549細(xì)胞對M.tb的敏感性。但對于CB1如何影響TLR4信號通路，目前缺乏相關(guān)報道，有待進(jìn)一步研究。

綜上，高糖可以促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞表面CB1表達(dá)上調(diào)，從而增加了對M.tb感染后細(xì)胞損傷的易感性，其中與肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通路活化相關(guān)，而使用CB1抑制劑則可以明顯改善肺泡上皮細(xì)胞損傷則進(jìn)一步證明了CB1信號通路活化可能是造成M.tb感染后細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。