茶多酚對(duì)十二指腸潰瘍模型黏膜碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用

肖鵬 肖宏 金海

(1遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000；遵義醫(yī)科大學(xué) 2第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院 附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

十二指腸潰瘍(DU)是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，與幽門螺桿菌(HP)感染、藥物損傷、精神心理因素、不良飲食習(xí)慣、自身免疫等因素密切相關(guān)〔1〕。其發(fā)生機(jī)制主要是由于十二指腸黏膜損傷因素和保護(hù)因素失衡引起。十二指腸黏膜碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌的碳酸氫鹽是抵抗胃酸、胃蛋白酶損害的主要防御機(jī)制〔2〕。因此增加十二指腸潰瘍患者的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌有助于十二指腸潰瘍的愈合。茶多酚是一種天然的生物制劑，研究顯示，茶多酚在創(chuàng)面損傷、口腔潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病中具有一定作用〔3〕。本研究探討茶多酚對(duì)十二指腸黏膜碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 人十二指腸黏膜組織均取自2020年1月至2020年6月就診于遵義市紅花崗人民醫(yī)院內(nèi)鏡中心的患者?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)。SD大鼠：40只8～12周齡SD大鼠，體重180～220 g，均購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，飼養(yǎng)于貴州省消化疾病研究所動(dòng)物室。

1.2主要藥物及試劑 茶多酚購(gòu)于成都瑞芬思公司；半胱胺鹽酸鹽(C106201-100 g，阿拉丁公司)；Anti-離子交換體(SLC)26A3抗體(ab83545)，Anti-囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)抗體(ab2784)購(gòu)于Abcam公司；兔二抗(HS101-01)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(DQ111-01)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)劑(DW101-01)、actin內(nèi)參抗體(HC201-02)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AE311-03)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增酶(AQ601-02)均購(gòu)于全式金生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物造模及給藥 將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量組(茶多酚100 mg/kg)及高劑量組(茶多酚300 mg/kg)各10只。所有大鼠禁食不禁水24 h后，模型組及低、高劑量組于大鼠經(jīng)頸背后皮下松弛處皮下注射10%鹽酸半胱胺(300 mg/kg)，對(duì)照組采用同樣操作，在頸背后注射同等劑量生理鹽水，自由飲食。造模24 h后，為了保持潰瘍的慢性過(guò)程，此后給模型組和低、高劑量組大鼠飲用1% 的半胱胺水來(lái)替代飲用水，對(duì)照組飲水正常；造模后48 h開(kāi)始，連續(xù)以灌胃法給予低、高劑量組茶多酚，對(duì)照組和模型組給予同等劑量生理鹽水；觀察大鼠的精神活動(dòng)、飲食飲水等情況，連續(xù)給藥4 w后處死大鼠，觀察大鼠十二指腸潰瘍的肉眼觀及蘇木素-伊紅(HE)染色情況，評(píng)判治療效果。收集大鼠十二指腸組織，用RT-PCR，Western印跡檢測(cè)組織中碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CFTR及SLC26A3的含量。

1.4十二指腸黏膜組織HE染色及SLC26A3和CFTR測(cè)定 HE染色：將固定好的十二指腸組織脫水、包埋、切片，80℃烤箱烤片20 min，過(guò)二甲苯2×15 min，自然水洗后，蘇木素染色1 min，過(guò)1%鹽酸乙醇進(jìn)行分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，伊紅染色1 min，過(guò)梯度酒精后，過(guò)二甲苯2×15 min，封片、晾干、觀察。Western印跡：提取蛋白，測(cè)定濃度后，加入上樣緩沖液進(jìn)行煮沸后上樣，進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)；轉(zhuǎn)膜后采用含5%脫脂牛奶TBST進(jìn)行封閉，室溫封閉2 h；加入1抗4℃過(guò)夜，用TBST清洗3次×10 min；加入2抗，室溫孵育1 h，用TBST清洗3次×10 min；加入ECL液后進(jìn)行曝光，采用Graphpad軟件進(jìn)行分析。免疫組化染色：將固定好的十二指腸組織脫水、包埋、切片，80℃烤箱烤片20 min，過(guò)二甲苯2×15 min，過(guò)梯度酒精進(jìn)行水化，采用枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次×5 min，采用3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，PBS清洗3次×5 min，封閉內(nèi)源性抗原，滴加一抗過(guò)夜，PBS清洗3次×5 min，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素染核，過(guò)梯度酒精，封片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1十二指腸潰瘍患者CFTR、SLC26A3表達(dá) 正常組織十二指腸黏膜上皮黏膜完整，無(wú)水腫，僅少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而潰瘍組十二指腸黏膜上皮連續(xù)性破壞，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體水腫。免疫組化顯示，正常黏膜上皮均表達(dá)CFTR和SLC26A3，而十二指腸潰瘍組織十二指腸黏膜上皮表達(dá)量明顯下降。見(jiàn)圖1。與正常組織比較，十二指腸潰瘍組織CFTR、SLC26A3蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖2、表1。

圖1 人十二指腸黏膜上皮HE染色及CFTR、SLC26A3免疫組化染色(×200)

圖2 正常組織和十二指腸潰瘍組織CFTR和SLC26A3蛋白表達(dá)

2.2茶多酚對(duì)大鼠體重及進(jìn)食情況的影響 在造模前各組體重及進(jìn)食量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。造模后，大鼠體重增長(zhǎng)較對(duì)照組明顯慢，進(jìn)食量較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。給予茶多酚灌胃后，高劑量組體重及進(jìn)食量與模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR、SLC26A3免疫組化 與對(duì)照組相比，模型組十二指腸黏膜上皮CFTR和SLC26A3表達(dá)減少，服藥后，低劑量組和高劑量組CFTR和SLC26A3表達(dá)均增加，高劑量組表達(dá)增加明顯。見(jiàn)圖3。

2.4茶多酚治療UC大鼠十二指腸黏膜的形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組十二指腸黏膜形態(tài)完整，黏膜上皮細(xì)胞排列緊密，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少見(jiàn)。模型組十二指腸絨毛損傷嚴(yán)重，固有層分布疏散，黏膜上皮大面積脫落，中央乳糜管消失，固有層及黏膜下層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。給予茶多酚治療后，黏膜較模型組大鼠黏膜好轉(zhuǎn)，固有層排列尚整齊，上皮損傷和脫落減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖3。

2.5茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA 表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組十二指腸黏膜上皮CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。服藥后，低劑量組和高劑量組CFTR和SLC26A3表達(dá)均增加，高劑量組CFTR和SLC26A3的蛋白和mRNA表達(dá)增加明顯，較模型組差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表3。

表1 正常組織和十二指腸潰瘍組織CFTR、SLC26A3蛋白和mRNA表達(dá)

表2 茶多酚對(duì)十二指腸潰瘍大鼠體重變化及進(jìn)食量的影響

圖3 茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜HE染色和CFTR、SLC26A3免疫組化染色(×200)

圖4 茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR和SLC26A3蛋白表達(dá)

表3 茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA 表達(dá)

3 討 論

目前中醫(yī)藥及生物制劑在消化性潰瘍的臨床研究及實(shí)驗(yàn)研究中顯示了良好的療效〔4〕。這些制劑在消化性潰瘍的治療作用主要通過(guò)減弱損傷性因子和加強(qiáng)防御性因子實(shí)現(xiàn)的〔5〕。其療效及作用機(jī)制在胃潰瘍中的研究較多，而對(duì)十二指腸潰瘍治療療效及其作用機(jī)制尚缺乏。

研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸潰瘍的發(fā)生除了與胃酸和胃蛋白酶的侵襲作用加強(qiáng)，也與十二指腸黏膜碳酸氫鹽的分泌減少〔6〕。碳酸氫鹽分泌的除了受神經(jīng)體液、激素、胃酸、膽汁等的影響外，還受到碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控。十二指腸碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括CFTR和Cl-/HCO3-SLC26家族〔7，8〕。SLC26A6在胃腸道碳酸氫鹽的分泌中起著重要作用。CFTR和SLC26家族在多種器官如：肝臟、胰腺、腎臟、胃腸道、心臟、肺臟等有豐度的表達(dá)，在pH值穩(wěn)態(tài)維持、免疫、腫瘤的發(fā)生、生物的發(fā)育中等起著重要作用〔9〕。CTTR和SLC26受多種信號(hào)通路的調(diào)控〔10，11〕。近年來(lái)，茶多酚這一天然生物制劑在抗氧化、抗感染、抗衰老、抗菌、抗癌變及在心肌保護(hù)、潰瘍性結(jié)腸炎治療、難治性口腔潰瘍治療和心血管疾病預(yù)防中起到重要作用〔12〕。而茶多酚通過(guò)多種作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)其保護(hù)作用，如通過(guò)降低或者減少氧自由基的產(chǎn)生、調(diào)控磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路、核因子(NF)-κB信號(hào)通路及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路等〔13，14〕。可推測(cè)茶多酚能夠通過(guò)調(diào)控十二指腸碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，提高碳酸氫鹽的分泌，促進(jìn)十二指腸潰瘍的愈合。本研究結(jié)果提示，茶多酚對(duì)十二指腸潰瘍的保護(hù)作用可能通過(guò)促進(jìn)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高碳酸氫鹽的分泌量實(shí)現(xiàn)的。

綜上，十二指腸潰瘍的誘因復(fù)雜，包括HP感染、非甾體類抗炎藥物、自身免疫因素、飲食、生活規(guī)律差、社會(huì)心理因素等。十二指腸潰瘍主要臨床表現(xiàn)是腹痛和消化不良，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起消化道出血及穿孔。質(zhì)子泵抑制劑(PPI)能夠有效治療十二指腸潰瘍，但對(duì)于難治性潰瘍，藥物服用依存性差、PPI制劑不良反應(yīng)較多的患者，可以考慮采用茶多酚這一安全有效的生物制劑。