亞低溫對SAH大鼠ROS表達水平及神經(jīng)元細胞的影響

姚書眈 王力航 湯倩 陳啟鸰 蒲興魏 陸廷盛 羅春山

(1貴州省骨科醫(yī)院脊柱外科，貴州 貴陽 550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)預(yù)后較差〔1〕。根據(jù)病理生理特征，該病的病程可分為兩個階段：早期腦損傷和晚發(fā)性腦血管痙攣〔2〕。研究表明，在SAH急性期，諸如顱內(nèi)壓升高和總腦血流量減少等病理變化是SAH預(yù)后不良的重要原因〔3〕。研究病因并探索減緩SAH急性期進程的有效措施對其治療至關(guān)重要〔4〕。線粒體的氧化應(yīng)激和異常的能量代謝是急性期SAH的重要原因之一。SAH急性期的腦缺血和缺氧會釋放大量線粒體活性氧(ROS)，并容易對神經(jīng)組織造成氧化損傷〔5,6〕。此外，過量ROS還可通過活化Toll樣受體(TLR)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等信號通路,導(dǎo)致線粒體細胞凋亡,抑制線粒體生物合成,損傷線粒體能量代謝,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞凋亡〔7〕。已有諸多研究報道顯示，亞低溫能夠顯著改善腦部疾病患者的組織損傷程度〔8〕。研究表明，在SAH急性期進行亞低溫干預(yù)對腦血管痙攣的延遲沒有緩解作用，但可以改善腦組織的缺氧耐受性，從而減少SAH的晚期腦損傷〔9〕。最近的研究表明，在SAH急性期誘導(dǎo)線粒體自噬可以通過消除受損的線粒體來減少神經(jīng)元凋亡。這表明線粒體功能是SAH急性期大腦保護的重要目標。但是，輕度低溫干預(yù)SAH線粒體功能的機制仍不清楚〔10〕。本研究旨在探究亞低溫對自發(fā)性SAH大鼠線粒體ROS功能及腦組織液的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 體重為150～186 g的3～4周齡健康雄性SD大鼠，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2儀器與試劑 氯醛(蘇州甫路生物科技有限公司)，石蠟(盛威石化有限公司)，酒精(八方化工有限公司)，乙醇(興旺化工有限公司)，蘇木素(甘肅益生祥生物公司)，伊紅(武漢華翔科潔生物公司)，二甲苯(濟南文泰化工有限公司)，谷氨酸(深圳樂芙生物科技公司)，蘋果酸(江蘇采薇生物科技公司)，二氯熒光素(美國Sigma公司)，蛋白酶K(廣州美基生物科技公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢海山科技有限公司)，樹膠(滄州蜂源蠟業(yè)有限公司)，兔抗鼠CGRP(英國Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Ferment公司)。實驗中所用引物由上海生工生物工程公司合成。MC-108型電子體溫計(美國Thermo Fisher公司)，恒溫加熱毯(河北方向電器有限公司)，SteponePlus型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3動物模型的制備及分組 將所選取的大鼠隨機分組，常溫(NT)組：制作SAH大鼠模型并處于常溫環(huán)境下生長；對照(CO)組：制作假手術(shù)模型，注射等量生理鹽水，處于常溫環(huán)境下生長；亞低溫(MH)組：制作SAH大鼠模型并處于亞低溫環(huán)境下生長，每組6只。

采用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)，將 MC-108型電子體溫計探頭插入大鼠直腸4～5 cm監(jiān)測肛溫，用恒溫加熱毯將肛溫維持于(37.0±0.5)℃。常規(guī)切開大鼠頭頂部皮膚，于前囟前中縫7.5 mm處鉆1孔，于冠狀縫后4.6 mm、中線兩側(cè)5 mm處各鉆1孔。30 min后，用1 ml注射器抽取大鼠自體股動脈血0.6 ml。將注射器針頭斜向后30°，刺入前囟前孔，針頭至視交叉前池前3 mm處顱底，于5 min內(nèi)注入動脈血。腦池注血后腦血流量降低至20%～40%定義為SAH模型制備成功。NT組和CO組大鼠維持腦溫度36.5～37.5℃，MH組大鼠用冰袋覆蓋大鼠體表進行降溫，維持腦溫度32.5～33.5℃，所有大鼠生存環(huán)境相同，常規(guī)處死大鼠用于后續(xù)試驗。

1.4腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察 左腦海馬CA1區(qū)固定于4%多聚甲醛24 h以上，將脫水盒放進吊籃里于脫水機內(nèi)依次梯度酒精進行脫水。取左腦海馬CA1區(qū)1 mm3經(jīng)石蠟包埋，切片后，將其置于烘箱烤2 h。于二甲苯中浸泡脫蠟2遍，每次15 min；梯度濃度酒精脫水；蒸饋水2 min。蘇木素染色液染色3 min。自來水沖洗5 min，蒸餾水浸泡10 min，95%乙醇5 s。伊紅染色液染色30 s。在顯微鏡下觀察染色情況，中性樹膠封片。置于通風處干燥后，在顯微鏡下觀察。

1.5線粒體ROS產(chǎn)生速率測定 采用二氯熒光素法檢測線粒體ROS生成速率，取5 mg線粒體加入測定介質(zhì)中，再加入谷氨酸、蘋果酸，濃度分別為10、5 mmol/L，啟動線粒體呼吸，繼而加入5 mmoL/L二氯熒光素，37℃避光水浴15 min，發(fā)射波長521 nm連續(xù)測定2 min，計算線粒體ROS產(chǎn)生速率。

1.6TUNEL法檢測神經(jīng)元細胞凋亡 石蠟切片置于切片架上烘箱烘烤2 h，脫蠟脫水。滴加20 g/ml不含DNase的蛋白酶K。37℃作用20 min，用PBS洗滌3次。3% H2O2的溶液中室溫作用10 min，PBS洗滌。加生物素標記液50 μl，37℃，孵育60 min，用PBS清洗。加0.1 ml反應(yīng)終止液終止，室溫作用10 min。在樣品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min。PBS洗滌3次。滴加0.2 ml二氨基聯(lián)苯胺(DAB)混合液，在顯微鏡下觀察作用時間。蘇木素復(fù)染，梯度濃度酒精脫水；二甲苯透明2遍，每次15 min。中性樹膠封片，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.7RT-PCR法檢測大鼠腦組織中CGRP mRNA的表達 把保存在-80℃環(huán)境中腦組織取出，研磨，提取總RNA，將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進行熒光反應(yīng)實驗。所有反應(yīng)嚴格按照反應(yīng)的條件進行擴增，內(nèi)參采用GAPDH，CGRP引物序列上游引物：5′-CCTGGTTGTCAGCATCTTG-3′，下游：5′-AGCCTCCTGTTCCTCCTC-3′。GAPDH上游引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。變性3 min 95℃，變性5 s 95℃，退火1 min 60℃，共進行40次。取得到的平均值后得到Ct值，采用2-△△Ct法進行計算并分析。

1.8Western印跡檢測大鼠腦組織中CGRP蛋白含量 洗凈烘干電泳槽及其他部件。將電泳裝置放置聚膠1 h，配制灌注成層膠。0.25%胰酶消化細胞，離心棄上清，加入細胞裂解液，在低溫高速30 min，吸取蛋白上清液。隨后95℃熱浴10 min，對蛋白進行變性。分別加入樣品懸液50 μg/孔。90 V電泳，電泳終止，取出凝膠，甲醇放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜放置5～10 s，加進轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜槽進行冰浴，70 V，1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成，用TBST洗2次，10 min/次。水平搖床密封2 h。然后把PVDF膜裝進有一抗(兔抗鼠CGRP，1∶1 500，英國Abcam公司)的自制雜交袋內(nèi)，4℃過夜。待膜取出，洗3次，10 min/次，沖洗完成后，把膜放入對應(yīng)的二抗(辣根過氧化酶標記熒光抗體，1∶2 000)中常溫孵育1.5 h。洗3次，10 min/次，將ECL顯色液A液和B液混合為工作液，按1:1比例，加工作液至PVDF膜內(nèi)。大概1 min。PVDF膜檢測采用自動化學(xué)發(fā)光成像分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織超微結(jié)構(gòu)比較 透射電鏡觀察顯示，CO組CA1區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)正常，核周邊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器豐富；NT組CA1區(qū)部分腦組織損傷明顯，細胞器溶解；MH組CA1區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)基本正常，細胞膜和細胞核結(jié)構(gòu)無明顯損傷，見圖1。

2.2各組線粒體ROS產(chǎn)生速率比較 NT組ROS產(chǎn)生速率〔(17.45±3.12)%〕顯著高于MH組〔(13.17±2.58)%〕；MH組ROS產(chǎn)生速率明顯高于CO組〔(6.43±1.48)%，P<0.05〕。

2.3各組神經(jīng)元細胞凋亡情況比較 NT組神經(jīng)元細胞凋亡率(23.65%)顯著高于MH組(13.64%，P<0.05)，MH組神經(jīng)元細胞凋亡率明顯高于CO組(8.47%，P<0.05)。

2.4各組腦組織中CGRP mRNA表達比較 NT組腦組織的CGRP mRNA表達(0.34±0.12)顯著低于MH組(0.59±0.21，P<0.05)，MH組腦組織的CGRP mRNA表達量明顯低于CO組(0.82±0.26，P<0.05)。

2.5各組腦組織中CGRP蛋白含量比較 NT組腦組織的CGRP 蛋白含量(0.46±0.12)顯著低于MH組(0.74±0.36，P<0.05)，MH組蛋白含量明顯低于CO組(1.03±0.56，P<0.05)。見圖2。

圖1 3組腦組織超微結(jié)構(gòu)

圖2 Western印跡檢測腦組織中CGRP蛋白表達

3 討 論

SAH指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，又稱為原發(fā)性SAH，約占急性腦卒中的10%，是較為嚴重的常見疾病〔11〕。導(dǎo)致SAH的常見病因有顱內(nèi)動脈瘤、動靜脈畸形等，該病在任何年齡均可發(fā)病，其中，多見于青年人。SAH發(fā)病急促，一旦出現(xiàn)異常癥狀應(yīng)及時救治，以免相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，對患者造成二次傷害〔12〕。

相關(guān)報道顯示，亞低溫在SAH大鼠發(fā)作期間能夠保護大腦，腦組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，腦血流量監(jiān)測結(jié)果顯示，亞低溫對腦池注血后腦血流量下降程度及恢復(fù)速度無明顯影響，提示亞低溫對SAH急性期的保護效應(yīng)可能是通過影響神經(jīng)元內(nèi)在因素而實現(xiàn)的〔13〕。研究結(jié)果表明，亞低溫降低了ROS在線粒體呼吸中所占比例，增加了呼吸鏈氧化磷酸化耦聯(lián)程度。腦缺血抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性是線粒體ROS產(chǎn)生增多和腦組織出現(xiàn)障礙的主要原因〔14〕。研究顯示，亞低溫可改善缺血心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性，同時，亞低溫可抑制SAH急性期線粒體氧化應(yīng)激，并促進線粒體能量代謝恢復(fù)，防止腦組織進一步受到傷害〔15〕。報道表明，患SAH大鼠體內(nèi)神經(jīng)元細胞的凋亡速率與正常健康大鼠相比較有顯著差異，其機制可能為由于疾病導(dǎo)致大鼠腦組織受損，進而加快細胞的凋亡〔16〕。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生SAH后的短時間內(nèi)，為維持腦內(nèi)血流量，神經(jīng)末梢內(nèi)的CGRP大量釋放入血液中，其水平明顯升高。隨時間推移神經(jīng)末梢中CGRP逐漸耗竭，血液中CGRP水平也逐漸下降，表明SAH的發(fā)生可導(dǎo)致CGRP水平大幅波動〔17,18〕。研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫干預(yù)抑制了SAH對腦組織CGRP表達的下調(diào)效應(yīng)，繼而推測，亞低溫可能通過上調(diào)CGRP表達來實現(xiàn)SAH急性期腦組織線粒體保護效應(yīng)，改善SAH急性期線粒體呼吸鏈工作效率，在提高線粒體能量輸出水平的同時也抑制了ROS的產(chǎn)生〔19～21〕。本研究結(jié)果與上述結(jié)論相近。

綜上，亞低溫可能通過上調(diào)CGRP的表達來降低SAH大鼠體內(nèi)線粒體ROS的活性，從而抑制神經(jīng)元凋亡。