甘南牦牛三種血液原蟲(chóng)多重PCR檢測(cè)方法建立及流行病學(xué)調(diào)查

陳亞明 李勇生 高生智 張 莉 徐庚全 潘陽(yáng)陽(yáng) 余四九 ，*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730070）

牦牛是分布于高原地區(qū)的重要畜種，是當(dāng)?shù)卦S多牧民家庭的主要生活和經(jīng)濟(jì)來(lái)源，并且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用［1］。牦牛在放牧飼養(yǎng)過(guò)程中通常會(huì)感染各類寄生蟲(chóng)，且寄生蟲(chóng)感染多呈慢性持續(xù)感染，臨床癥狀不易觀察；雖然牦牛抵抗力強(qiáng)，寄生蟲(chóng)感染的致死率不高，但牦牛的生產(chǎn)性能和生長(zhǎng)發(fā)育都會(huì)受到影響［2］。弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）、環(huán)形泰勒蟲(chóng)（Theileria annulata）和新孢子蟲(chóng)（Neospora caninum）是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，家畜寄生蟲(chóng)感染，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，更對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害［3］。因此檢測(cè)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的感染和流行情況對(duì)這3種疾病的防治具有十分重要的意義。

弓形蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)均為牛體內(nèi)的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，牛群感染后臨床癥狀相似，且發(fā)生混合感染的情況日趨嚴(yán)重，主要引起母畜出現(xiàn)木乃伊胎、死胎、流產(chǎn)以及神經(jīng)系統(tǒng)障礙［4-5］。新孢子蟲(chóng)病和弓形蟲(chóng)病分別由新孢子蟲(chóng)和剛地弓形蟲(chóng)寄生于宿主所引起［6］，犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物分別是新孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)的終末宿主［7］。其中新孢子蟲(chóng)對(duì)牛造成的危害最為嚴(yán)重，而弓形蟲(chóng)病是一種人獸共患寄生蟲(chóng)病，牛和其他反芻動(dòng)物是弓形蟲(chóng)的主要中間宿主［8］，這兩種寄生蟲(chóng)具有水平和垂直傳播兩種傳播方式。環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染牛的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、貧血、消瘦、高熱和食欲不振［9］，重癥可出現(xiàn)死亡病例，我國(guó)已將此病定為二類疫?。?0］。但目前尚無(wú)可用于預(yù)防弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的成熟疫苗［11-12］。當(dāng)前，弓形蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)在世界各主要的養(yǎng)牛國(guó)家普遍流行［13-15］，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今，弓形蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)在我國(guó)大多數(shù)省份均有報(bào)道［16-17］，部分省份也有牛群中存在環(huán)形泰勒蟲(chóng)的相關(guān)報(bào)道［18］。

綜合上述進(jìn)展表明，準(zhǔn)確判斷弓形蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)感染須經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)和診斷。迄今，鑒別檢測(cè)弓形蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的常用方法有PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Lamp）等檢測(cè)方法，其中已有同時(shí)檢測(cè)新孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)的雙重PCR 檢測(cè)方法［19］。但是，鑒別檢測(cè)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)的多重PCR 方法仍鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)針對(duì)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)設(shè)計(jì)特異性引物，建立弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的三重PCR 方法，以期為臨床流行病學(xué)調(diào)查提供后備支持，從而掌握甘肅省甘南地區(qū)3 種寄生蟲(chóng)的流行狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

弓形蟲(chóng)DNA、環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA 和新孢子蟲(chóng)DNA均為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)所用牦牛629 份血清樣品均采自甘南地區(qū)牦牛養(yǎng)殖區(qū)。

1.2 儀器與試劑

全血基因組DNA 提取試劑盒、Taq 聚合酶、PCR 試劑、DNA Marker（DL 2000），寶生物工程（大連）有限公司；T100 型PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；BioSpectrum 310 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP 公司；高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)弓形蟲(chóng)hypothetical protein基因（GenBank 登錄號(hào)：MG003442.1）、環(huán)形泰勒蟲(chóng)Tams1基因（GenBank登錄號(hào)：LC549654.1）和新孢子蟲(chóng)Nc-p43（GenBank 登錄號(hào)：EF469765.1），應(yīng)用Primer premier 6.0 軟件各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為520、341 和156 bp（表1）。引物由天津卡梅德生物科技有限公司合成。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Multiplex PCR primer sequences

1.4 單重PCR方法的建立

PCR 體系共25 μL：牛弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的基因組DNA 模板各1 μL，2×Taq Master Mix 12 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL，混合均勻后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.5 多重PCR方法的建立與優(yōu)化

利用1.4 的反應(yīng)體系，以弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的基因組DNA為模板。根據(jù)設(shè)計(jì)的3對(duì)引物擴(kuò)增溫度的參考值，分別設(shè)置55、56、57、58、59 ℃共5 個(gè)梯度進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，以篩選最佳反應(yīng)溫度。

1.6 多重PCR特異性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后的多重PCR方法，分別對(duì)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)、牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)（Babesia bigemina）和牛卵形巴貝斯蟲(chóng)（Babesia ovata）單一DNA 及其不同組合進(jìn)行核酸樣品擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的特異性。

1.7 多重PCR敏感性試驗(yàn)

將弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)3 種原蟲(chóng)的DNA 模板濃度稀釋到相同數(shù)量級(jí)，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重PCR 方法，對(duì)弓形蟲(chóng)+環(huán)形泰勒蟲(chóng)、牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)+環(huán)形泰勒蟲(chóng)+新孢子蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)+新孢子蟲(chóng)、牛卵形巴貝斯蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)+新孢子蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)+環(huán)形泰勒蟲(chóng)+新孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)+新孢子蟲(chóng)、陰性對(duì)照和環(huán)形泰勒蟲(chóng)樣本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證多重PCR 方法穩(wěn)定性。

1.9 流行病學(xué)調(diào)查

將采集到的629 份甘南地區(qū)牦牛血清樣本，提取DNA 模板，應(yīng)用本試驗(yàn)所建立的多重PCR 方法檢測(cè)。出現(xiàn)預(yù)期大小520、341、156 bp 條帶為陽(yáng)性，未出現(xiàn)相應(yīng)條帶為陰性。

1.10 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用F檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)判定季節(jié)和年齡與牦牛感染3 種原蟲(chóng)之間存在的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系。P＞0.05 代表差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即該因素不是感染寄生蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物的確定

分別以弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，獲得與預(yù)期片段大小一致的目的片段520（弓形蟲(chóng)）、341（環(huán)形泰勒蟲(chóng)）和156 bp（新孢子蟲(chóng)），未見(jiàn)非特異性條帶出現(xiàn)（圖1），說(shuō)明本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的3對(duì)引物特異性良好，可對(duì)3種目標(biāo)蟲(chóng)體的DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增。

圖1 單一PCR引物的特異性檢測(cè)Fig.1 Specific detection of a single PCR primer

2.2 多重PCR反應(yīng)體系的建立及退火溫度優(yōu)化

以單一PCR 反應(yīng)條件為基礎(chǔ)構(gòu)建多重PCR，反應(yīng)體系為3 種原蟲(chóng)的模板和引物，優(yōu)化退火溫度。結(jié)果顯示，在56、57、58 ℃都有特異性條帶出現(xiàn)，57 ℃時(shí)3種PCR產(chǎn)物亮度最高。因此，該多重PCR 反應(yīng)最佳溫度為57 ℃（圖2）。

圖2 多重PCR反應(yīng)體系的建立及退火溫度優(yōu)化Fig.2 Establishment of multiplex PCR reaction system and optimization of annealing temperature

2.3 多重PCR特異性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，用3 對(duì)引物分別對(duì)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的單一DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，均可擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段（圖3，泳道1～3）；對(duì)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)3種原蟲(chóng)的混合DNA 模板，擴(kuò)增出3 條目的片段（圖3，泳道4）；對(duì)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的DNA 模板進(jìn)行不同組合擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出2條目的條帶（圖3，泳道5～7），且無(wú)其他非特異性條帶；而對(duì)牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)、牛卵形巴貝斯蟲(chóng)DNA 和水為模板（圖3，泳道8～10）時(shí)均無(wú)條帶出現(xiàn)，表明該多重PCR方法具有良好的特異性。

圖3 多重PCR的特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity of multiplex PCR

2.4 多重PCR敏感性試驗(yàn)

檢測(cè)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的DNA 濃度，并將上述3 份DNA 分別稀釋到相同數(shù)量級(jí)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該方法可檢測(cè)到弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)DNA的最低濃度分別是0.01、0.02和0.01 ng·μL-1（圖4）。說(shuō)明該多重PCR 反應(yīng)敏感性良好，且敏感性能夠滿足對(duì)臨床3種蟲(chóng)體DNA濃度的要求。

圖4 多重PCR敏感性試驗(yàn)Fig.4 Multiplex PCR sensitivity assay

2.5 多重PCR重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的多重PCR 方法對(duì)12 份樣本以及陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶（圖5），且無(wú)其他非特異性條帶的出現(xiàn)。此外，該多重PCR 方法對(duì)牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)、牛卵形巴貝斯蟲(chóng)的擴(kuò)增效果均為陰性，表明該多重PCR穩(wěn)定性較好。

圖5 多重PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Multiplex PCR repeatability test results

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用所建立的多重PCR 方法，檢測(cè)采集自甘南地區(qū)的629 份血清，結(jié)果如表2 所示。弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為4.29%，環(huán)形泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率為3.66%，新孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性率為5.88%。3 種原蟲(chóng)血清陽(yáng)性率之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 629份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of test results of 629 clinical samples

2.7 混合感染情況匯總

將629 份臨床樣品的混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3 所示。弓形蟲(chóng)和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的混合感染率為2.23%，弓形蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的混合感染率為3.50%，新孢子蟲(chóng)和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的混合感染率為4.13%，3種原蟲(chóng)的混合感染率為3.82%?；旌细腥镜目傆?jì)感染率為13.68%。

表3 629份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果混合感染統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical table of mixed infection of 629 clinical samples

2.8 不同季節(jié)檢測(cè)結(jié)果匯總

對(duì)629 份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果按季節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表4所示。春季、夏季、冬季檢測(cè)牦牛3種原蟲(chóng)陽(yáng)性率總計(jì)分別為29.34%、23.12%、29.37%?？傮w不同季節(jié)的陽(yáng)性率差異不顯著（P＞0.05）。

表4 629份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果時(shí)間統(tǒng)計(jì)表Table 4 Time statistics table of test results of 629 clinical samples

2.9 不同年齡牦牛檢測(cè)結(jié)果匯總

629 份血清樣品按照牦牛不同年齡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行匯總，結(jié)果如表5 所示。0～3 歲的牦牛感染3 種原蟲(chóng)的總計(jì)陽(yáng)性率為27.83%，大于3 歲感染3 種原蟲(chóng)的總計(jì)陽(yáng)性率為27.46%?？傮w2 組不同年齡牦牛間的陽(yáng)性率差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同年齡牦牛檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 5 Statistical table of detection results of yaks of different ages

2.10 影響牦牛弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)因素

運(yùn)用F檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)判定牦牛的年齡和不同季節(jié)與其感染這3 種原蟲(chóng)之間存在的相關(guān)聯(lián)系。結(jié)果如表6所示，季節(jié)和年齡均不是牦牛感染3種原蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)因素（P＞0.05）。

表6 年齡和季節(jié)與牦牛感染弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系Table 6 Odds ratio of age and season of yak as risk factors for T.gondii，T.annulata and N.caninum

3 討論

由于弓形蟲(chóng)與新孢子蟲(chóng)的混合感染加重了治療的復(fù)雜性［20-21］，加之環(huán)形泰勒蟲(chóng)在牛群中的普遍存在對(duì)牛具有的潛在危害［22］。為此，本研究建立了檢測(cè)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的多重PCR 方法，可為預(yù)防上述3種寄生蟲(chóng)感染提供參考。

在多重PCR 建立過(guò)程中，引物的設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)的特異性和擴(kuò)增效率起著至關(guān)重要的作用［23］。因此，本研究根據(jù)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的保守序列，分別設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性引物，且擴(kuò)增弓形蟲(chóng)（520 bp）、環(huán)形泰勒蟲(chóng)（341 bp）、新孢子蟲(chóng)（156 bp）的片段大小差異大于100 bp，便于電泳后觀察條帶。此外，對(duì)多重PCR反應(yīng)的退火溫度、循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化［24］。本試驗(yàn)首先優(yōu)化單重PCR 反應(yīng)體系，確定多重PCR 反應(yīng)體系中最佳循環(huán)數(shù)為35個(gè)循環(huán)，最佳退火溫度為57 ℃，并且弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)最低檢出下限分別達(dá)到0.01、0.02和0.01 ng·μL-1，成功建立了弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)3種常見(jiàn)寄生蟲(chóng)的多重PCR檢測(cè)方法。

本研究應(yīng)用該多重PCR 檢測(cè)方法，對(duì)甘南地區(qū)2021年采集的629份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)混合感染率分別為4.29%、3.66%、5.88%，表明弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)在甘南牦牛中均有感染，其中新孢子蟲(chóng)單一陽(yáng)性率最高，環(huán)形泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率最低，混合感染率高達(dá)13.67%。本試驗(yàn)在甘南地區(qū)采集的629 份牦牛血清中，新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為5.88%，這與Koiwai等［25］對(duì)日本的2 420份牛血清進(jìn)行研究，陽(yáng)性率為5.8%的結(jié)果接近。趙鵬等［26］報(bào)道長(zhǎng)春地區(qū)牛感染弓形蟲(chóng)的總體陽(yáng)性率為6.00%；王芝英等［27］研究發(fā)現(xiàn)重慶市牛弓形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為27.25%；而巴西米納斯吉拉斯地區(qū)的牛弓形蟲(chóng)血清陽(yáng)性率高達(dá)60.29%［28］。本研究發(fā)現(xiàn)甘南地區(qū)牦牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)的陽(yáng)性率為3.66%，低于其他研究，但環(huán)形泰勒蟲(chóng)對(duì)牛群的危害仍不能輕視。此外，本試驗(yàn)對(duì)甘南地區(qū)的牦牛血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率整體低于我國(guó)各個(gè)地區(qū)的平均值［29］，說(shuō)明不同地區(qū)、不同國(guó)家牛群間的弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)感染率差異較大。甘南地區(qū)牦牛弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)感染水平較低的原因可能與該地區(qū)氣候條件有關(guān)。甘南地處高原，大部分地區(qū)海拔在3 000 m 以上，常年氣溫較低，晝夜溫差大，日照強(qiáng)烈，這些環(huán)境因素均不利于弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)卵囊的生長(zhǎng)和繁殖，這與Sarvi 等［30］研究結(jié)果不同。與寒冷干燥地區(qū)相比，弓形蟲(chóng)卵囊通常在溫暖、潮濕的氣候和低海拔地區(qū)更普遍，存活時(shí)間更長(zhǎng)［31］。對(duì)于弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的混合感染，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較少，而本研究發(fā)現(xiàn)2021年甘南地區(qū)牦牛弓形蟲(chóng)和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的混合感染率為2.23%，弓形蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的混合感染率為3.50%，新孢子蟲(chóng)和梨形蟲(chóng)的混合感染率為4.13%，3 種原蟲(chóng)的混合感染率為3.82%，其中二重感染為混合感染的主要模式，占混合感染的9.86%?；旌细腥绢愋统识鄻踊?，臨床不易區(qū)分，傳統(tǒng)或單一PCR 檢測(cè)方法可易造成漏檢和誤診。當(dāng)前甘南地區(qū)牦牛3 種血液原蟲(chóng)的混合感染嚴(yán)重程度較低，混合感染的總計(jì)感染率為13.68%，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)流行現(xiàn)狀和趨勢(shì)，防止牦牛出現(xiàn)大規(guī)模混合感染。

本研究還分析了3 種原蟲(chóng)血清陽(yáng)性率和季節(jié)、年齡之間的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著春、夏、冬季節(jié)的變化，3 種原蟲(chóng)的單一感染率逐漸增加，3 種原蟲(chóng)均為冬季的血清陽(yáng)性率最高，其次是夏季，春季血清陽(yáng)性率最低。同一季節(jié)中，均表現(xiàn)為新孢子蟲(chóng)的血清陽(yáng)性率最高，其次是弓形蟲(chóng)，環(huán)形泰勒蟲(chóng)血清陽(yáng)性率最低，這與于晉海等［32］的研究結(jié)果相符。但風(fēng)險(xiǎn)因素分析發(fā)現(xiàn)季節(jié)不是牦牛感染3 種原蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)因子（P＞0.05）。其次，弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性率在不同年齡之間差異不顯著（P＞0.05），可知年齡不是牦牛感染弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)因素，說(shuō)明3種原蟲(chóng)均可感染各個(gè)年齡階段的牦牛，推測(cè)牦牛感染寄生蟲(chóng)的主要原因是牦牛放牧的牧場(chǎng)有其他動(dòng)物（馬、牛、狗）并與其頻繁接觸。不同地區(qū)的環(huán)境差異可能是造成牦牛弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)感染率不同的原因。

4 結(jié)論

本研究建立了一種靈敏性好、特異性強(qiáng)的弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)多重PCR 檢測(cè)方法，并對(duì)甘肅省甘南地區(qū)牦牛感染弓形蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，其混合感染率為13.68%，在風(fēng)險(xiǎn)因素方面，耗牛感染3 種血液原蟲(chóng)均與季節(jié)、年齡無(wú)關(guān)。