兩種常見(jiàn)大鼠心肌缺血再灌注損傷模型造模方法比較

胡建春

(貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴陽(yáng) 551400)

心肌缺血再灌注損傷模型(MIRI)是在動(dòng)物體內(nèi)阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)造成的急性心肌缺血，并在預(yù)定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供予以再灌注，是模擬人類缺血性心臟病恢復(fù)供血治療必需的實(shí)驗(yàn)方法。由于大鼠在進(jìn)化關(guān)系上比較接近人類，冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少，心肌壞死出現(xiàn)早，心律失常發(fā)生率高，穩(wěn)定性好且制作模型費(fèi)用低，成為了制作心肌缺血再灌注損傷模型的首選。

結(jié)扎大鼠LAD形成心肌梗死是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的模型制備方法[1]。通用的造模方法為常規(guī)開(kāi)胸法和快速手術(shù)法，但MIRI模型制備過(guò)程中存在諸多難點(diǎn)，如常規(guī)手術(shù)需要斷肋骨，造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)重創(chuàng)傷，術(shù)后預(yù)后不良，死亡率升高。手術(shù)時(shí)反復(fù)多次將心臟牽拉到胸腔外，造成動(dòng)物死亡率增加。術(shù)后胸腔空氣未排盡，引發(fā)氣胸，導(dǎo)致死亡率升高，再灌注時(shí)結(jié)扎線不易解開(kāi)(剪斷)，輕者再灌注失敗，重則可能導(dǎo)致左心耳破裂，造成大出血，動(dòng)物死亡。文獻(xiàn)[2-4]報(bào)道了冠狀動(dòng)脈的定位部位不一，造成模型缺血損傷部位及損傷程度不一致等。

通過(guò)對(duì)常規(guī)開(kāi)胸手術(shù)和快速手術(shù)兩種造模方式作橫向?qū)Ρ?，?duì)模型成功率、死亡率、手術(shù)時(shí)間等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為科研提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠，雄性，250±20 g，購(gòu)買自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0008。

主要儀器與試劑：BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20191011)，TTC(SIGMA，批號(hào)BCBP3272V)，DW-20002小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立

20只SD大鼠隨機(jī)分為快速操作組和常規(guī)開(kāi)胸手術(shù)組，每組10只。由專人飼養(yǎng)管理，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)并每日更換新鮮純凈水。動(dòng)物室光照充足，通風(fēng)良好，室溫18℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，動(dòng)物飼養(yǎng)室定期消毒。

常規(guī)開(kāi)胸手術(shù)組[2-4]：健康大鼠0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，二導(dǎo)聯(lián)下實(shí)時(shí)測(cè)心電圖。經(jīng)口插氣管，連接呼吸機(jī)，設(shè)置潮氣量12，呼吸比1∶2，呼吸頻率90次/分。從胸中線到左腋下斜開(kāi)口(5～6 cm)，分離皮膚和肌肉，見(jiàn)肋骨。在左側(cè)3～4肋間用手術(shù)刀輕輕劃開(kāi)肌肉，再用止血鉗分開(kāi)肋間隙，使用擴(kuò)胸器擴(kuò)開(kāi)胸腔。用鑷子撕開(kāi)心包膜，暴露心臟。采用6-0縫合線，在心臟中下部穿線用于牽引固定心臟位置，左手輕輕牽拉牽引線，固定心臟位置，右手從左心耳下沿稍靠右的位置進(jìn)針，結(jié)扎LAD。觀察心電圖ST段是否抬高，若抬高，則結(jié)扎成功。 將牽引線拔出，撤出擴(kuò)胸器，閉合胸腔，縫合肋骨，用手?jǐn)D壓大鼠胸腔排除腔內(nèi)空氣，縫合肌肉和皮膚。結(jié)扎LAD時(shí)，將結(jié)扎線打活節(jié)，一段露在皮膚表面。60 min后，輕拉線頭，將活結(jié)打開(kāi)，減掉外露線頭，實(shí)現(xiàn)再灌注。

快速操作組[5-6]：健康SD大鼠按0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，二導(dǎo)聯(lián)下實(shí)時(shí)測(cè)心電圖。左胸部備毛，消毒，于胸骨左緣心臟搏動(dòng)處縱行切開(kāi)皮膚約2 cm，用止血鉗逐層分離皮下組織、肌肉，再用拉鉤拉開(kāi)剝離開(kāi)的肌肉，暴露手術(shù)視野。在心臟搏動(dòng)明顯的3～4肋間打開(kāi)胸腔，左手從右前區(qū)沿心臟跳動(dòng)方向擠壓，同時(shí)右手用止血鉗深入胸腔引導(dǎo)，使心臟彈出胸腔，左手拇指、食指和中指輕捏住心臟，在左心耳下方以心臟表面左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，用6-0無(wú)創(chuàng)縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過(guò)心肌表層，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針，作一活結(jié)以結(jié)扎左冠脈前降支，迅速將心臟塞回胸腔，用力擠壓胸腔排空腔內(nèi)空氣，觀察心電圖，Ⅱ?qū)?lián)下ST段抬高，表明缺血成功，縫合皮膚。60 min后松結(jié)扎線，心電圖ST段下降表明心肌組織恢復(fù)再灌注。

1.2.2 觀測(cè)指標(biāo)

造模存活率。以手術(shù)成功且再灌注24 h仍存活的大鼠計(jì)算兩組的造模存活率。

ST段抬高幅度。通過(guò)觀察二導(dǎo)聯(lián)下大鼠心電圖ST段的變化，確認(rèn)大鼠是否存在心肌缺血現(xiàn)象，以ST段抬高幅度作為判定指標(biāo)之一。

心臟TTC染色結(jié)果[7-8]。手術(shù)再灌注24h后，股動(dòng)脈采血，立即取心臟，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液清洗干凈，于-20℃冷凍20 min，取出切片，置于1%TTC PBS溶液中，37℃水浴避光染色10 min，可見(jiàn)缺血灶呈蒼白色，正常組織為紅色肌肉組織，取出置4%多聚甲醛中固定24 h，以梗死區(qū)域重量除以心肌組織總重，計(jì)算梗死率。

心臟HE染色結(jié)果[8-9]。手術(shù)結(jié)束，再灌注24 h后，股動(dòng)脈采血，立即取心臟，冷凍后進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

A.造模存活率。常規(guī)開(kāi)胸組10只大鼠中，造模成功9只，存活的共5只，造模存活率50%；快速操作手術(shù)組10只大鼠中，存活8只，造模成功7只，造模存活率70%。

B.大鼠心電圖變化。通過(guò)二導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測(cè)，兩種方法造模成功的大鼠心電圖均呈現(xiàn)ST段抬高的現(xiàn)象。

圖1 MIRI大鼠心電圖變化(A：心肌缺血，ST段抬高；B：正常心電圖)Fig.1 MIRI rats ECG changes(A: myocardial ischemia, ST segment elevation; B: normal ECG)

對(duì)比兩種造模方法ST段抬高幅度，常規(guī)開(kāi)胸組ST段平均抬高0.158 mV，快速操作手術(shù)組ST段平均抬高0.154 mV，無(wú)明顯差異，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 兩種造模方法下大鼠ST段變化統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistics of ST segment changes in rats under two modeling methods

C.TTC染色結(jié)果[10]。TTC染色時(shí)，梗死區(qū)域心肌組織呈蒼白色，正常心肌組織呈紅色，具體見(jiàn)圖2。以梗死區(qū)域心肌組織重量/心肌總重量計(jì)算梗死率，兩組大鼠梗死率見(jiàn)表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，常規(guī)操作組平均心肌梗死率為36.84%，快速操作組為37.49%。結(jié)果中個(gè)別大鼠心肌梗死率相較更高，可能是由于結(jié)扎手法、位點(diǎn)不統(tǒng)一，引發(fā)心臟缺血位置不一致導(dǎo)致的。

D.HE染色結(jié)果。 HE染色可見(jiàn)正常心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊。病變區(qū)肌纖維排列紊亂，部分區(qū)域性變性壞死，部分核固縮，心肌間質(zhì)可見(jiàn)灶性水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 MIRI大鼠心臟TTC染色結(jié)果(左為常規(guī)手術(shù)法，右為快速操作法)Fig.2 Results of MIRI rats heart TTC staining(the left is the conventional operation, and the right is the rapid operation)

表2 兩種造模方法下大鼠心肌梗死率統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistics of myocardial infarction rate in rats under two modeling methods

圖3 MIRI大鼠心臟HE染色結(jié)果(左為正常心肌組織，右為病變區(qū)域)Fig.3 Results of MIRI rats heart HE staining(the left is normal cardiac muscle tissue, and the right is lesion region)

3 討論

兩種手術(shù)操作比較：常規(guī)手術(shù)組直接在胸腔結(jié)扎LAD，不牽拉心臟，不變動(dòng)心臟位置，利于準(zhǔn)確結(jié)扎LAD位點(diǎn)。但其操作時(shí)間長(zhǎng)(約15～20 min)，必須氣管插管或經(jīng)口插管，采用呼吸機(jī)輔助手術(shù)，才能保證存活率。手術(shù)過(guò)程步驟多，較復(fù)雜?？焖偈中g(shù)組需要將心臟牽拉出胸腔，快速結(jié)扎后將心臟返回胸腔，整個(gè)過(guò)程在1～2 min完成，難以保證結(jié)扎位置的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員熟練度要求更高。快速操作法由于手術(shù)時(shí)間短，熟練操作后可不需要呼吸機(jī)輔助手術(shù)操作，快速結(jié)扎后擠壓胸腔排氣、縫合皮膚即可獲得較好的手術(shù)效果。

大鼠術(shù)后恢復(fù)：常規(guī)手術(shù)組胸部開(kāi)口較大，肌肉和肋骨是經(jīng)銳器(刀片)分離，不能自主閉合，必須縫合?？焖偈中g(shù)組開(kāi)口小，肌肉經(jīng)鈍器分離，無(wú)需縫合即可閉合。二者相比，快速手術(shù)組更利于動(dòng)物術(shù)后傷口愈合和恢復(fù)。

對(duì)后續(xù)研究的影響：常規(guī)手術(shù)組縫合時(shí)會(huì)使用頭孢類等消炎藥抗感染，確保動(dòng)物存活率，可能會(huì)因?yàn)樗幬锵嗷プ饔枚绊懞罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？焖偈中g(shù)組鈍性分離肌肉，無(wú)需使用消炎藥即可獲得較高的存活率，且對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)影響較小。

通過(guò)同步實(shí)驗(yàn)，對(duì)常規(guī)開(kāi)胸手術(shù)和快速操作手術(shù)兩種造模方法成功的大鼠進(jìn)行造模存活率、心機(jī)梗死率、心電圖ST段變化等指標(biāo)的比較，發(fā)現(xiàn)二者在存活率、梗死率及心電圖變化上無(wú)顯著差別，但快速操作組在手術(shù)時(shí)間、造模存活率、對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響等方面顯著優(yōu)于常規(guī)操作組，因此經(jīng)過(guò)反復(fù)練習(xí)、熟練手術(shù)操作的情況下，選擇快速操作法，可快捷、有效地完成MIRI模型的制備。