5 種食用菌水提物生物活性的比較

韓明月，李 俐，郝利民，王小龍，江慶伍，李 雪，劉可可，劉永奇，伊娟娟,*，魯吉珂,*

（1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院，北京 100010；3.河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001；4.安徽金寨喬康藥業(yè)有限公司，安徽 六安 237300）

食用菌通稱為蘑菇，是一類可供食用、子實(shí)體碩大的真菌[1]。食用菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有多種對(duì)人體有益的活性成分，包括酚類化合物、萜類化合物、黃酮類化合物、多糖類化合物等，相應(yīng)展現(xiàn)出多種生物學(xué)功能，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及輻射防護(hù)等作用[2-3]。

在生物體內(nèi)自由基的生成和清除通常處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，自由基過剩將會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定程度的氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)衰老、癌癥、肝損傷、心血管等疾病[4-5]。免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗各種病原微生物，如細(xì)菌、病毒和寄生蟲等的主要防御系統(tǒng)。機(jī)體在發(fā)揮免疫應(yīng)答時(shí)不僅依賴于胸腺、脾臟等免疫器官，還依賴于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6]。隨著核能技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人類經(jīng)常暴露于各種各樣的電離輻射中。但電離輻射會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫、造血、生殖等系統(tǒng)造成不同程度的氧化損傷[7]，天然輻射防護(hù)劑的開發(fā)在來源、效用、成本及安全等方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，對(duì)人類健康具有十分重要的意義。

食用菌具有開發(fā)成天然抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)劑和輻射防護(hù)劑的潛力，本研究以草菇、灰樹花、紅菇、雞腿菇、樹舌5 種食用菌水提物為實(shí)驗(yàn)材料，通過生物活性對(duì)比研究篩選出活性較高的食用菌水提物，為天然抗氧化劑和輻射防護(hù)劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草菇水提物（water extracts ofVolvariellavolvacea，WEVV）、灰樹花水提物（water extracts ofGrifolafrondosa，WEGF）、紅菇水提物（water extracts ofRussulavinosa Lindblad，WERV）、雞腿菇水提物（water extracts ofCoprinus comatus，WECC）和樹舌水提物（water extracts ofGanoderma applanatum，WEGA）由安徽金寨喬康藥業(yè)有限公司提供。

考馬斯亮藍(lán)G-250 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、沒食子酸、福林-酚 上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁 北京索萊寶科技有限公司；鐵氰化鉀、過硫酸鉀 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸 上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司；三氯化鐵、硫酸亞鐵 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；苯酚、抗壞血酸（ascorbic acid，VC）、水楊酸 天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；30%過氧化氫 煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。以上試劑均為分析純。

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）；小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12 南京三生生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、地塞米松、胰蛋白酶消化液北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑美國(guó)Sigma試劑公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 上海陶術(shù)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2SC型恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JW-1016型低速離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司；CMax Plus濾光片型光吸收酶標(biāo)儀美谷分子儀器（上海）有限公司；60Co γ輻射裝置（200萬 Ci） 河南省科學(xué)院同位素研究所有限公司；3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；QL-902型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食用菌水提物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用苯酚硫酸法測(cè)定食用菌水提物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、490 nm波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝13.435x－0.023 7（R2＝0.999 7）。

1.3.2 食用菌水提物中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定食用菌水提物中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9]。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、樣品反應(yīng)液在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝6.867 1x＋0.002 7（R2＝0.998 7）。

1.3.3 5 種食用菌水提物中粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

5 種食用菌水提物經(jīng)醇沉過夜，4 000 r/min離心10 min獲得粗多糖沉淀，將沉淀溶解定容，并參照出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》[8]測(cè)定樣品溶液中的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 食用菌水提物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用福林-酚法檢測(cè)食用菌水提物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、760 nm 波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝69.873x＋0.002 3（R2＝0.999 7）。

1.3.5 食用菌水提物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用NaNO2-AlCl3法測(cè)定食用菌水提物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11]。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、510 nm波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝7.577x－0.002 3（R2＝0.999 8）。

1.3.6 食用菌水提物的體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

采用劉宇琪等[12]的方法測(cè)定。7.4 mmol/L的ABTS和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，避光靜置12～16 h，用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)下的吸光度在0.70±0.02左右，制成ABTS工作液。取不同質(zhì)量濃度的食用菌水提物溶液（0.2～1.0 mg/mL）以及VC溶液（0.001～0.005 mg/mL）各1 mL，加6 mL ABTS工作液，混勻并在室溫下靜置6 min，測(cè)定混合液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式（1）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

式中：A0為以等體積蒸餾水代替水提物樣品溶液的吸光度；A1為1 mL水提物樣品溶液與6 mL ABTS工作液混合的吸光度；A2為以等體積蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

采用Luan Xiaoxu等[13]方法評(píng)估DPPH自由基清除活性并稍作修改。分別將食用菌水提物配制成質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL的樣品溶液，并分別取2 mL樣品溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混勻，靜置20 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合液的吸光度。質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組。以2 mL蒸餾水和2 mL無水乙醇混合液作為空白對(duì)照。根據(jù)公式（2）計(jì)算食用菌水提物清除DPPH自由基的能力。

式中：A0為2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混合的吸光度；A1為2 mL DPPH溶液與2 mL水提物樣品溶液混合的吸光度；A2為2 mL無水乙醇溶液與2 mL水提物樣品溶液混合的吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除率的測(cè)定

參照Z(yǔ)hang Tao等[14]方法并稍作改進(jìn)。取不同質(zhì)量濃度的食用菌水提物（1.0～5.0 mg/mL）及VC溶液（0.1～0.5 mg/mL）各1 mL，依次加入1 mL 5 mmol/L FeSO4溶液、1 mL蒸餾水、1 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液及1 mL 5 mmol/L H2O2溶液，混合均勻，37 ℃下放置30 min，測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0為等體積蒸餾水代替水提物樣品溶液的吸光度；A1為水提物樣品溶液的吸光度；A2為等體積蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.6.4 總還原力測(cè)定

根據(jù)Zhang Jingjing等[15]的方法并稍作修改，進(jìn)行總還原力測(cè)定。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度食用菌水提物溶液（0.2～1.0 mg/mL），依次加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻，50 ℃下靜置20 min，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氟乙酸終止反應(yīng)，3 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液與2 mL蒸餾水、0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液混合均勻，50 ℃下靜置10 min，檢測(cè)混合液700 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以吸光度表征總還原力的強(qiáng)弱。以蒸餾水為空白對(duì)照。以質(zhì)量濃度0.001～0.005 mg/mL的VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7 食用菌水提物的體外免疫活性檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖活性[16]。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于96 孔板中，過夜培養(yǎng)巨噬細(xì)胞使其充分貼壁。次日，5 種食用菌水提物（質(zhì)量濃度10～200 μg/mL）分別作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）組和LPS（質(zhì)量濃度1 μg/mL）組分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做5 個(gè)重復(fù)孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

24 h之后，棄去96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，并避光配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10% CCK-8溶液的DMEM培養(yǎng)基，每孔避光加入110 μL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度，并按公式（4）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A0為CCK-8溶液吸光度；A1為陰性對(duì)照孔的吸光度；A2為樣品孔的吸光度。

1.3.8 食用菌水提物的體外抗輻射活性檢測(cè)

將小鼠正常肝細(xì)胞AML-12在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1% ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑和質(zhì)量濃度40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3.8.1 AML-12細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8方法檢測(cè)5 種食用菌水提物對(duì)AML-12細(xì)胞活力的影響[17-18]。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AML-12細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，按照約5 000 個(gè)/孔加入96 孔板中，于體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入10 μL不同質(zhì)量濃度的樣品，刺激AML-12細(xì)胞，PBS組作為陰性對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做5 個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，棄去96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，并避光配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10% CCK-8溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔避光加入110 μL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度，并按公式（5）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A0為CCK-8溶液吸光度；A1為陰性對(duì)照孔的吸光度；A2為樣品孔的吸光度。

1.3.8.2 輻射防護(hù)實(shí)驗(yàn)

通過60Co γ照射建立肝細(xì)胞AML-12輻射損傷模型，并采用CCK-8方法檢測(cè)5 種食用菌水提物對(duì)AML-12細(xì)胞的放射保護(hù)作用[17-18]。AML-12細(xì)胞培養(yǎng)步驟與1.3.8.1節(jié)相同。當(dāng)樣品作用于細(xì)胞后于體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行60Co γ射線輻射處理，輻射劑量為6 Gy，劑量率為2 Gy/min。以輻照后的PBS組作為模型（model control，MC）組。培養(yǎng)24 h后，棄去96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，并避光配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10% CCK-8溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔避光加入110 μL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度，并按公式（6）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A0為CCK-8溶液吸光度；A1為未輻照陰性對(duì)照孔的吸光度；A2為樣品孔吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種食用菌水提物中總糖、總蛋白、粗多糖、總酚及總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

為了探究5 種食用菌水提物的主要成分，對(duì)其總糖、總蛋白、粗多糖、總酚及總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定及對(duì)比，結(jié)果見表1。5 種食用菌水提物的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過50%以上，其中WECC和WEVV總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為（84.87±7.31）%和（80.90±1.20）%，表明糖類組分在5 種食用菌水提物中的占比較大。WEGA和WEGF總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.50±0.05）%和（1.06±0.03）%，其余水提物的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低。為了探究水提物中多糖的含量，將5 種食用菌水提物經(jīng)醇沉得到的粗多糖進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，5 種食用菌水提物中WEGF的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（61.28±2.95）%。值得注意的是，WEGA的總酚、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于其余食用菌水提物，分別為（2.62±0.01）%和（3.03±0.02）%。以上研究結(jié)果初步顯示，5 種食用菌水提物均含有一定含量的活性成分，而糖類化合物是該5 種食用菌水提物的主要成分。已有報(bào)道表明，食用菌多糖具有抗氧化[19]、抗輻射[20]、降血糖[21]、降血脂[22]及增強(qiáng)免疫力[23]等多種生物活性。因而，有必要對(duì)這5 種食用菌水提物的生物活性進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

表1 5 種食用菌水提物中總糖、總蛋白、粗多糖、總酚及總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of total sugar,total proteins,crude polysaccharides,total phenols and total flavonoids in water extracts from five edible mushrooms

2.2 食用菌水提物的體外抗氧化活性

2.2.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

ABTS陽(yáng)離子自由基是由ABTS與過硫酸鉀發(fā)生氧化反應(yīng)生成的，呈現(xiàn)藍(lán)綠色，并在734 nm波長(zhǎng)下有特征吸收峰。當(dāng)向ABTS陽(yáng)離子自由基中補(bǔ)充自由基清除劑后，藍(lán)綠色變淡，其吸光度也會(huì)隨著抗氧化劑的抗氧化能力的增加而降低。因而，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率可以作為評(píng)價(jià)樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)[24]。如圖1所示，陽(yáng)性對(duì)照VC及5 種食用菌水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基均具有清除能力。在樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，WEGA、WEGF、WERV、WEVV、WECC對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率分別為（99.78±0.10）%、（71.43±0.67）%、（65.54±0.92）%、（40.47±0.44）%和（38.58±0.42）%，其中WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最強(qiáng)。據(jù)Shi Min等[25]從豆腐渣發(fā)酵的靈芝中提取4 種多糖，靈芝多糖組分4（Ganoderma lucidumpolysaccharide-IV，GLP-IV）對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除活性最高，其質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)清除率為98.68%。與GLP-IV相比，質(zhì)量濃度1 mg/mL的WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率高于質(zhì)量濃度5 mg/mL的GLP-IV，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。綜上所述，WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力較高。

圖1 5 種食用菌水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig.1 2,2’-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)cation radical scavenging capacity of water extracts from fvie edible mushrooms

2.2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

DPPH自由基乙醇溶液呈紫色，當(dāng)加入具有清除自由基能力的樣品時(shí)，能夠使得DPPH自由基的孤對(duì)電子被配對(duì)，原本紫色的DPPH自由基乙醇溶液顏色變淺，根據(jù)顏色變淺的程度可以判斷樣品抗氧化能力的大小[26]。如圖2所示，陽(yáng)性對(duì)照VC及5 種食用菌水提物的質(zhì)量濃度與DPPH自由基的清除能力呈正相關(guān)。在0.2～1.0 mg/mL食用菌水提物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，WEGA的DPPH自由基清除率均高于其他4 種食用菌水提物，但低于陽(yáng)性對(duì)照VC的DPPH自由基清除率。在樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，5 種食用菌水提物的DPPH自由基清除率分別為WEGA（88.36±0.30）%、WEGF（85.37±0.41）%、WERV（62.81±0.39）%、WEVV（59.69±0.63）%、WECC（54.85±0.23）%。其中WEGA對(duì)DPPH自由基清除率最高，且高于真空技術(shù)提取的香菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除率（低于50%）[27]?？偟膩碚f，5 種食用菌水提物中WEGA對(duì)DPPH自由基的清除能力最好。

圖2 5 種食用菌水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity of water extracts from five edible mushrooms

2.2.3 羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

在已知的自由基中，羥自由基的氧化能力比較強(qiáng)，其氧化能力可以對(duì)幾乎所有的生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、糖類等造成氧化損傷，因而測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的清除能力具有十分重要的意義[28]。如圖3所示，當(dāng)VC質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時(shí)，其羥自由基清除率為（68.92±5.89）%，高于5 種食用菌水提物的羥自由基的清除能力。5 種食用菌水提物對(duì)羥自由基的清除能力均呈現(xiàn)濃度依賴性增加。但與DPPH自由基清除能力相比，5 種食用菌水提物對(duì)羥自由基的清除作用較弱。在1～5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，WEGA的羥自由基清除活性高于其他食用菌。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，WEGA羥自由基清除率達(dá)到最大，為（33.44±0.07）%，并高于從平菇子實(shí)體中分離出的兩種多糖組分PSPO-1a和PSPO-4a對(duì)羥自由基的清除能力，PSPO-1a和PSPO-4a的清除率均低于25%[29]。結(jié)果表明WEGA是一種潛在的羥自由基清除劑。

圖3 5 種食用菌水提物對(duì)羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of water extracts from five edible mushrooms

2.2.4 總還原力測(cè)定結(jié)果

抗氧化劑是通過自身的還原作用清除自由基，表現(xiàn)為還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)，因此可以通過還原能力的大小判斷其抗氧化水平的高低。如圖4所示，每種食用菌水提物的總還原能力均隨著樣品質(zhì)量濃度增加，呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)。在0.2～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，WEGA的總還原能力高于其他食用菌水提物。5 種食用菌水提物總還原能力的大小依次為WEGA＞W(wǎng)ERV＞W(wǎng)EGF＞W(wǎng)EVV＞W(wǎng)ECC。結(jié)果表明WEGA比其他4 種食用菌水提物具有更強(qiáng)的總還原能力。

圖4 5 種食用菌水提物的總還原力Fig.4 Total reducing power of water extracts from five edible mushrooms

2.3 食用菌水提物的體外免疫活性分析結(jié)果

巨噬細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中占有非常重要的地位，其體外增殖能力可以作為評(píng)價(jià)生物活性化合物免疫調(diào)節(jié)作用的指標(biāo)[30-31]。如圖5所示，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與陰性對(duì)照組相比，WECC和WEVV對(duì)巨噬細(xì)胞增殖具有較弱的促進(jìn)作用。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在40～200 μg/mL時(shí)，WERV對(duì)巨噬細(xì)胞增殖有劑量依賴性抑制作用。WEGF在10～160 μg/mL時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞的促增殖作用與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，這一結(jié)果與Ma Xiaolei等[32]報(bào)道的灰樹花多糖組分GFP-A對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性的趨勢(shì)一致。并且當(dāng)WEGF質(zhì)量濃度在80～200 μg/mL時(shí)，WEGF與其他4 種食用菌水提物相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖促進(jìn)能力最強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，5 種食用菌水提物中WEGA對(duì)巨噬細(xì)胞增殖促進(jìn)能力最強(qiáng)，并與陽(yáng)性對(duì)照作用相當(dāng)。綜上所述，WEGA具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。已有報(bào)道表明樹舌多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性[33]，與本研究結(jié)果相一致。

圖5 5 種食用菌水提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effects of water extracts from five edible mushrooms on RAW264.7 cell viability

2.4 食用菌水提物的體外抗輻射活性

電離輻射是能引起一切物質(zhì)電離的總稱[34]。電離輻射會(huì)對(duì)機(jī)體造成直接和間接的傷害，嚴(yán)重危害人類身體健康[35]。肝臟是生物體的重要代謝器官，電離輻射也會(huì)對(duì)肝臟造成損傷[17,36]。因此，60Co γ輻射氧化損傷的小鼠肝細(xì)胞AML-12可以作為評(píng)價(jià)生物活性化合物的輻射防護(hù)作用的細(xì)胞模型。

如圖6A所示，5 種食用菌水提物均能促進(jìn)AML-12細(xì)胞的增殖，并對(duì)AML-12細(xì)胞無毒性作用。如圖6B所示，60Co γ輻射后，與陰性對(duì)照組相比，MC組AML-12細(xì)胞存活率極顯著下降（P＜0.01）。WEGF在質(zhì)量濃度80～200 μg/mL時(shí)，能夠改善AML-12細(xì)胞存活率的下降，但改善作用較弱。與MC組相比，WECC和WERV在質(zhì)量濃度10～200 μg/mL范圍內(nèi)均能改善輻射所致的肝細(xì)胞AML-12的損傷，但隨質(zhì)量濃度的增加WECC對(duì)AML-12細(xì)胞的輻射防護(hù)作用逐漸下降。在質(zhì)量濃度10～200 μg/mL范圍內(nèi)，與其余4 種食用菌水提物相比，WEVV能夠明顯改善電離輻射導(dǎo)致的AML-12細(xì)胞存活率下降。WEGA在低質(zhì)量濃度（10～40 μg/mL）時(shí)對(duì)肝細(xì)胞AML-12細(xì)胞存活率下降表現(xiàn)出顯著的改善作用（P＜0.05、P＜0.01）。因而，WEGA、WEVV、WECC和WERV均可作為天然的輻射防護(hù)劑進(jìn)行開發(fā)利用。此外，課題組前期采用AML-12細(xì)胞進(jìn)行輻射防護(hù)作用研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)布拉氏酵母發(fā)酵的山藥多糖對(duì)60Co γ射線誘導(dǎo)的AML-12細(xì)胞損傷表現(xiàn)出較好的輻射防護(hù)作用[18]。而本研究水提物主要組分分析顯示，糖類是5 種食用菌水提物的主要成分，由此推測(cè)多糖可能是食用菌水提物發(fā)揮輻射防護(hù)作用的主要因素，值得進(jìn)一步探究。

圖6 5 種食用菌水提物對(duì)AML-12細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effects of water extracts from five edible mushrooms on AML-12 cell viability

3 討論

近些年來，關(guān)于食用菌生物活性的研究備受科研工作者的關(guān)注，食用菌中的功能性成分已成為天然藥物資源開發(fā)的領(lǐng)域之一[37]。目前，關(guān)于食用菌生物活性方面的研究，主要是針對(duì)單種食用菌的生物活性進(jìn)行研究。本研究選用草菇、灰樹花、紅菇、雞腿菇、樹舌5 種食用菌水提物為研究對(duì)象，進(jìn)行主要成分分析及生物活性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 種食用菌水提物均具有一定的抗氧化活性、免疫活性和輻射防護(hù)作用，這可能與5 種食用菌水提物富含糖類化合物相關(guān)。WEGA的還原能力、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均高于WEVV、WEGF、WERV、WECC，特別是當(dāng)WEGA質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率高達(dá)（99.78±0.10）%，表明其是天然抗氧化功能食品開發(fā)的良好原料來源。

同時(shí)，5 種食用菌水提物的體外免疫活性結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度（10 μg/mL）時(shí)，WEGA對(duì)巨噬細(xì)胞的促增殖能力強(qiáng)于其他食用菌水提物；在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（10～160 μg/mL），WEGF對(duì)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的促增殖效果。此外，5 種食用菌水提物對(duì)60Co γ輻射下的肝細(xì)胞AML-12輻射防護(hù)結(jié)果顯示，WEVV的輻射防護(hù)作用較強(qiáng)；WEGA的抗輻射活性結(jié)果與其體外免疫活性結(jié)果相似，在低質(zhì)量濃度（10～40 μg/mL）時(shí)明顯改善電離輻射導(dǎo)致的肝細(xì)胞AML-12的損傷。綜合比較，WEGA具有較好的抗氧化、免疫及抗輻射活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為WEGA相關(guān)功能產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路。