抗β2 糖蛋白1 抗體檢測(cè)結(jié)果差異化的研究進(jìn)展

謝茜，趙鐵鎖（通信作者），丁亞輝，李忠信，王文強(qiáng)

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 （河南 新鄉(xiāng) 453003）；2 鄭州安圖生物工程股份有限公司 （河南 鄭州450016）

抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）是一種以反復(fù)動(dòng)靜脈血栓形成、病態(tài)妊娠（通常表現(xiàn)為多次不明原因流產(chǎn)或死胎）、血小板減少等為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病。APS 的臨床表征可累及心臟、肺部、腎臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等全身各個(gè)器官，屬于非器官特異的自身免疫性疾病，同時(shí)還伴有抗磷脂抗體（antiphospholipid-antibody，aPL）持續(xù)陽(yáng)性[1]?？功?糖蛋白1抗體（anti-beta2 glycoprotein 1，anti-β2-GP1）作為APS 分類的重要指標(biāo)之一，自2006年的札幌會(huì)議后，其在APS 診斷中的作用逐漸被臨床重視起來(lái)[2]。隨著對(duì)APS 的研究越來(lái)越深入，臨床對(duì)anti-β2-GP1檢測(cè)方法、檢測(cè)樣本的采集、抗原的使用、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、參考值的建立、結(jié)果的分析等提出了要求和建議[3]。本研究就anti-β2-GP1的檢測(cè)現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果差異化的原因進(jìn)行分析。

1 β2 糖蛋白1 作為aPL 靶抗原的發(fā)現(xiàn)

1986年Harris 等[4]統(tǒng)計(jì)了30個(gè)實(shí)驗(yàn)室反饋的檢測(cè)抗心磷脂抗體（anti-cardiolipin，aCL）的室間質(zhì)評(píng)結(jié)果后得出結(jié)論，所有的無(wú)效檢測(cè)方法均單獨(dú)使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）并添加牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）及明膠作為血清樣品及標(biāo)記抗體的稀釋液；有效檢測(cè)方法則使用血清/血漿作為稀釋液；此外，不同來(lái)源的抗原對(duì)檢測(cè)結(jié)果并無(wú)顯著影響。另有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，只有使用血清/血漿作為稀釋液才能使心磷脂（cardiolipin，cL）與aCL 結(jié)合，因此推測(cè)血清/血漿中含有一種輔助因子，并于1990年通過(guò)離子交換色譜分析法將該輔助因子分離純化[5]。研究證實(shí)，該輔助因子為β2糖蛋白1（beta2 glycoprotein 1，β2-GP1）[6]，此后β2-GP1作為aCL 的一種靶抗原開(kāi)始被熟知。

2 β2-GP1 簡(jiǎn)介

β2-GP1又被稱為載脂蛋白H（apolipoprotein H，APOH），在人類中由APOH 基因編碼，定位于染色體17q23-24。它是一種由肝細(xì)胞合成的糖蛋白，分子量為50 kD 左右，在血液循環(huán)中以游離形式存在，血漿含量約為150～300 μg/ml，進(jìn)化高度保守，幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物中，且同源性高達(dá)74%～83%（人、犬、小鼠、大鼠、牛）。β2-GP1是由326個(gè)氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，以脯氨酸（Pro）的含量最高，其次為半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）。其結(jié)構(gòu)可分為5個(gè)結(jié)構(gòu)域（Domain Ⅰ～Ⅴ），每個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)槎痰闹貜?fù)序列片段（short consensus repeat，SCR），符合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（complement control protein，CCP）的結(jié)構(gòu)模型，為保守的CCP 序列，由Cys-Pro 殘基進(jìn)行連接，其Cys 殘基在Cys1-3和Cys2-4之間形成二硫鍵。Domain V 額外含有一個(gè)二硫鍵和C 端殘基，其帶正電荷氨基酸序列（Lys282-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287）為與陰離子磷脂進(jìn)行結(jié)合的主要位點(diǎn)[7-12]。

3 β2-GP1 構(gòu)象變化的研究進(jìn)展

1994—1996年期間的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，使用表面被強(qiáng)輻照過(guò)的96孔聚苯乙烯透明微孔板（ELISA微孔板），可使aCL 在沒(méi)有cL 存在的情況下識(shí)別β2-GP1，并認(rèn)為cL 或者輻照過(guò)的微孔板可使β2-GP1的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[13-15]。相關(guān)共識(shí)也指出，推薦使用負(fù)電荷（高結(jié)合力或經(jīng)γ 射線照射后）微孔板檢 測(cè)anti-β2-GP1[3]。1998年，Koike 等[16]基 于 人類H 因子的結(jié)構(gòu)，通過(guò)核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）建立了β2-GP1的同源模型，即由5個(gè)圓柱體的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。1999年，Schwarzenbacher 等[17]由晶體結(jié)構(gòu)的分辨率推導(dǎo)出了β2-GP1的魚(yú)鉤狀構(gòu)象。2002年，Hammel 等[18]通過(guò)小角X 線散射法（small-angle X-ray scattering，SAXS）提出了β2-GP1為S 型結(jié)構(gòu)，且在Domain Ⅰ上存在碳水化合物側(cè)鏈，可能覆蓋表位甘氨酸40-精氨酸43（G40-R43）。2006年，De Laat 等[19]發(fā)現(xiàn)，將碳水化合物移除可提高β2-GP1與anti-β2-GP1的親合力，進(jìn)一步證實(shí)了Hammel 等[18]的理論。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)anti-β2-GP1可分為兩類：一類與血栓相關(guān)，在β2-GP1變構(gòu)的情況下可識(shí)別Domain Ⅰ的G40-R43表位；另一類與血栓相關(guān)性不大，可結(jié)合β2-GP1的其他結(jié)構(gòu)域，且不受構(gòu)像的影響。

2010年，Agar等[20]使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）將β2-GP1放 大 了20萬(wàn) 倍，通過(guò)肉眼觀察到了β2-GP1的構(gòu)象，并發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)pH 及鹽濃度可以使β2-GP1的構(gòu)象發(fā)生改變，該變構(gòu)為可逆過(guò)程。在正常人血漿中純化出來(lái)的β2-GP1為閉環(huán)狀態(tài)，在高鹽高pH（1.15 M NaCl，pH=11.5）的條件下，其由閉環(huán)狀態(tài)變?yōu)轸~(yú)鉤狀構(gòu)象；在低鹽低pH（150 mM NaCl，pH=3.4）條件下，其由魚(yú)鉤狀重新變回環(huán)狀構(gòu)象[21]。Agar 等[20]還同時(shí)驗(yàn)證了，APS 患者體內(nèi)的抗體不能直接與環(huán)狀β2-GP1結(jié)合，但重組鼠單克隆抗Domain Ⅳ抗體可直接與環(huán)狀β2-GP1結(jié)合。

綜上所述，在生理狀態(tài)下，β2-GP1的Domain Ⅰ和Domain Ⅴ結(jié)合，呈閉環(huán)狀態(tài)；在病理狀態(tài)下，β2-GP1帶正電荷的Domain Ⅴ與cL 等帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合，呈打開(kāi)狀態(tài)可識(shí)別aPL。在體外，高鹽高pH 條件下β2-GP1也可從閉環(huán)狀態(tài)到打開(kāi)狀態(tài)，呈現(xiàn)魚(yú)鉤狀，可與aPL 進(jìn)行結(jié)合；在低鹽低pH 條件下可重新恢復(fù)至閉環(huán)狀態(tài)，此時(shí)無(wú)法識(shí)別aPL。

4 anti-β2-GP1 檢測(cè)的研究進(jìn)展

大量研究表明，anti-β2-GP1 具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，針對(duì)各個(gè)結(jié)構(gòu)域均有相應(yīng)的抗體，且分為IgG、IgM、IgA 等不同亞型[22]。目前，APS 的分類標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際共識(shí)僅將anti-β2-GP1 的IgG 和IgM 亞型被列入標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測(cè)范圍[2-3]。但相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和共識(shí)并未對(duì)各個(gè)亞型的臨床意義得出一致性的結(jié)論。Li 等[23]研究認(rèn)為，anti-β2-GP1 的IgG 亞型與血栓形成關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)，而IgM亞型與不良妊娠相關(guān)。Swad ?ba等[24]的研究認(rèn)為，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）繼發(fā)抗磷脂綜合征患者中，anti-β2-GP1 的IgM 亞型與血栓形成沒(méi)有關(guān)聯(lián)。Danowski 等[25]的研究認(rèn)為，anti-β2-GP1 在臨床診斷SLE 患者靜脈和動(dòng)脈血栓形成的高風(fēng)險(xiǎn)方面具有一定作用，IgG 亞型與靜脈血栓形成相關(guān)，IgM亞型與動(dòng)脈血栓形成相關(guān)，IgA 亞型與APS 無(wú)關(guān)。Del Ross 等[26]首次報(bào)道了anti-β2-GP1 的IgM 亞型與視網(wǎng)膜血栓形成有一定關(guān)聯(lián)。Lee 等[27]的研究認(rèn)為，anti-β2-GP1 的IgA 亞型與SLE 患者的動(dòng)脈血栓形成更加相關(guān)。2021 年的一項(xiàng)中心實(shí)驗(yàn)室研究認(rèn)為，anti-β2-GP1 在SLE 患者中以IgA 亞型抗體為主[28]。此外，IgA 亞型anti-β2-GP1 還與中風(fēng)、靜脈血栓形成、血小板減少、網(wǎng)狀青斑、癲癇和瓣膜性心臟病等相關(guān)[29-31]。這些研究的差異可能與β2-GP1 的抗原表位有關(guān)。

目前針對(duì)β2-GP1抗原表位的研究是通過(guò)重組各個(gè)結(jié)構(gòu)域的突變體來(lái)進(jìn)行的。多數(shù)研究人員認(rèn)為，針對(duì)Domain Ⅰ的抗體的IgG 亞型與血栓形成更加相關(guān)，針對(duì)其他結(jié)構(gòu)域的抗體與血栓形成不相關(guān)[19,32-33]，但也有研究認(rèn)為，針對(duì)Domain Ⅳ的抗體也與血栓形成相關(guān)[34]。后續(xù)Iverson 等[35]的研究表明，在Domain Ⅳ上可能存在2個(gè)不連續(xù)的表位，有些抗體可結(jié)合單獨(dú)的Domain Ⅳ，而有些抗體必須在Domain Ⅴ存在的情況下才能結(jié)合Domain Ⅳ，且與動(dòng)脈粥樣硬化綜合征相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)針對(duì)Domain Ⅰ的抗體也有IgA 亞型的存在。國(guó)內(nèi)早期研究顯示，28例anti-β2-GP1陽(yáng)性APS 患者中，有27例血清anti-Domain Ⅴ呈陽(yáng)性，因此認(rèn)為抗體主要結(jié)合位點(diǎn)在Domain Ⅴ上[36]。在特應(yīng)性皮炎兒童的血清中檢測(cè)出的anti-β2-GP1的主要表位在Domain Ⅴ上的磷脂結(jié)合位點(diǎn)附近（以IgG1亞型為主），因此該類抗體無(wú)法結(jié)合β2-GP1和cL 復(fù)合物[35]。Blank 等[37]制備出不同序列的單克隆anti-β2-GP1，這些抗體可分別識(shí)別Domain Ⅱ、Ⅲ以及Ⅳ的相關(guān)肽段。Murthy 等[38]的研究顯示，198例anti-β2-GP1 IgA亞型陽(yáng)性的SLE 患者中，單一IgA 亞型陽(yáng)性有57例。針對(duì)Domain Ⅳ/Ⅴ的IgA 亞型在IgA 亞型中的占比為54%，其中77%的患者與APS 的臨床表現(xiàn)相關(guān)。Serrano等[39]的研究指出，在anti-β2-GP1 IgA 亞型單獨(dú)陽(yáng)性的血栓性APS 患者中，抗體似乎優(yōu)先與β2-GP1的Domain Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的3個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，而非Domain Ⅰ或Ⅳ/Ⅴ。

從上述研究可以發(fā)現(xiàn)，雖然多組研究人員進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的努力，但仍未能將β2-GP1不同抗原表位的抗體與相應(yīng)的臨床表征聯(lián)系起來(lái)。研究人員的結(jié)論相互矛盾，無(wú)法統(tǒng)一。其中最主要的原因可能是，抗原表位為線性和構(gòu)象表位共存。從哺乳動(dòng)物的β2-GP1晶體模型可以發(fā)現(xiàn)，5個(gè)結(jié)構(gòu)域之間會(huì)出現(xiàn)一定的糖基化，而糖基化會(huì)遮擋β2-GP1的抗原表位。昆蟲(chóng)來(lái)源的β2-GP1的分子量為43 kD，而人體內(nèi)的β2-GP1分子量為50 kD 左右，這可能是因?yàn)樘腔潭炔煌?，進(jìn)而導(dǎo)致不同研究人員得出相互矛盾的結(jié)論[40]。還有研究指出，體外實(shí)驗(yàn)使用的抗原片段為線性表位，而這些異質(zhì)性的抗體對(duì)抗原表位的識(shí)別也會(huì)受到空間構(gòu)象的影響[39-41]，不同的構(gòu)像會(huì)暴露或隱藏一些潛在的抗原表位，也會(huì)導(dǎo)致無(wú)法得出一致的結(jié)論。

總之，β2-GP1共有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，體外實(shí)驗(yàn)證明每個(gè)結(jié)構(gòu)域均存在能與相應(yīng)抗體結(jié)合的表位，同時(shí)anti-β2-GP1還分為IgG、IgM、IgA 3種抗體亞型，極大地增強(qiáng)了anti-β2-GP1的異質(zhì)性。此外anti-β2-GP1與β2-GP1的結(jié)合還依賴于β2-GP1的構(gòu)像改變。正常人體內(nèi)的β2-GP1呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其Domain Ⅴ與Domain Ⅰ相連，且各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間有一定的糖基化，遮擋了抗原表位。病理狀態(tài)下，Domain Ⅴ插入陰性磷脂表面，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表位暴露，可識(shí)別aPL。在體外極端環(huán)境下（如高鹽高pH 等），β2-GP1也可以發(fā)生變構(gòu)，然而β2-GP1的變構(gòu)過(guò)程具有一定的不確定性。目前通過(guò)電子顯微鏡肉眼可觀察到的為環(huán)狀閉合狀態(tài)（O 型）和打開(kāi)狀態(tài)（J 型），此外還有S 型結(jié)構(gòu)。近期有人提出了和J 型對(duì)稱的L 型結(jié)構(gòu)，J 型和L 型暴露的表位不同[39]。

5 anti-β2-GP1 的檢測(cè)差異化原因分析

目前，anti-β2-GP1的檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked Immunosorbent assay，ELISA）、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）、熒光酶免疫法（fluorescent immunoassay，F(xiàn)EIA）和多重微珠免疫法等。這些方法的檢測(cè)原理均為間接法檢測(cè)抗體，即固相化的β2-GP1抗原結(jié)合樣本中的anti-β2-GP1再連接標(biāo)記的動(dòng)物源抗人IgG/IgM/IgA 抗體（標(biāo)記二抗）。anti-β2-GP1的檢測(cè)主要受以下因素影響：抗原的來(lái)源、二抗的來(lái)源及固相化、標(biāo)記化相關(guān)的方法及條件等。

抗原的來(lái)源主要包括種屬（如人源、牛源）、制備方法（天然提純、重組抗原）等。雖然β2-GP1的同源性很強(qiáng)，但顯然使用人源抗原檢測(cè)人體內(nèi)自身抗體的特異度和靈敏度會(huì)更優(yōu)。Cavazzana 等[42]研究了抗原的純化方式，使用4種不同來(lái)源的人血漿和4種不同純化方式得到的抗原，盡管純度不同，但檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。有研究還對(duì)ELISA 實(shí)驗(yàn)的5個(gè)組分（包被緩沖液、微孔板標(biāo)記液、封閉緩沖液、稀釋緩沖液和酶標(biāo)二抗）進(jìn)行了差異化研究，發(fā)現(xiàn)中性和堿性包被緩沖液的檢測(cè)結(jié)果之間存在差異[43]。這些結(jié)論也證實(shí)了pH 會(huì)影響β2-GP1的變構(gòu)，導(dǎo)致結(jié)果偏差。不同品牌的微孔板之間、不同稀釋緩沖液之間存在差異，這些差異的本質(zhì)也是在不同環(huán)境下導(dǎo)致了β2-GP1的結(jié)構(gòu)差異。此外酶標(biāo)二抗也存在差異：如抗人IgG 按亞型可分為抗IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，按結(jié)構(gòu)可分為抗重鏈（H），輕鏈（L）以及抗恒定區(qū)（Fc）和可變區(qū)（Fab）抗體，IgG、IgM、IgA 均有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，抗輕鏈抗體還會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。因此不同的二抗選擇對(duì)靈敏度及特異度均會(huì)產(chǎn)生影響。想要明確anti-β2-GP1檢測(cè)的真正臨床意義，必須以檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性為前提，即特異性地檢測(cè)到靶物質(zhì)（正確性），且檢測(cè)結(jié)果可重現(xiàn)（可重復(fù)性）。最初檢測(cè)anti-β2-GP1的方法以ELISA 為主，但其易受人工因素影響，其定量結(jié)果在室內(nèi)和室間的可重復(fù)性極差，檢測(cè)結(jié)果的變異度可高達(dá)90%[44]；而全自動(dòng)檢測(cè)方法（如CLIA）可大大提升定量結(jié)果的可重復(fù)性。在檢測(cè)正確性方面，不同廠家試劑盒的制備工藝和方法學(xué)差異較大，尤其是β2-GP1抗原的處理會(huì)影響其空間構(gòu)象及位點(diǎn)的暴露，進(jìn)而影響與抗體的結(jié)合，造成結(jié)果的差異化。因此，檢測(cè)結(jié)果的正確性需要依靠針對(duì)β2-GP1各個(gè)位點(diǎn)的參考品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。