線粒體功能障礙在腎結(jié)石成石中作用的研究進(jìn)展

何綦琪，吳 晃,2，李昱卓，包軍勝*

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科醫(yī)學(xué)中心 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科研究所 甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730030； 2.蘭州大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030

線粒體是機(jī)體產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器，其在不同組織細(xì)胞類(lèi)型中的形狀、大小和數(shù)量各不相同。線粒體是唯一具備雙層膜結(jié)構(gòu)及自身基因組的細(xì)胞器，主要功能是為細(xì)胞供能。除供能外，線粒體還參與細(xì)胞氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡和衰老的調(diào)節(jié)[1]。線粒體的功能障礙貫穿并影響各種代謝性疾病的發(fā)展，如糖尿病[2]、肥胖[3]、癌[4]、老化[5]、線粒體肌病[6]和神經(jīng)退行性疾病[7]等。

近年來(lái)，有較多臨床研究已明確了腎結(jié)石的發(fā)生與代謝綜合征(metabolic syndromes，MS)、肥胖等代謝性疾病具有顯著相關(guān)性，在糖脂代謝異常的條件下，結(jié)石成石更易發(fā)生且成石率更高，這可能與線粒體功能障礙直接或間接相關(guān)[8]。本文總結(jié)線粒體功能障礙與腎結(jié)石發(fā)生機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)，尋找通過(guò)改善線粒體功能來(lái)預(yù)防腎結(jié)石發(fā)生的潛在證據(jù)，以期對(duì)后續(xù)腎結(jié)石的基礎(chǔ)研究及預(yù)防性藥物設(shè)計(jì)提供新思路。

1 線粒體在人體腎細(xì)胞中的功能簡(jiǎn)述

在人體內(nèi)，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的線粒體數(shù)量?jī)H次于心肌細(xì)胞。大量線粒體細(xì)胞器可提供足夠的能量來(lái)維持體內(nèi)酸堿及電解質(zhì)平衡、血液過(guò)濾、營(yíng)養(yǎng)再吸收和血壓調(diào)控[9]。尤其在近端腎小管上皮細(xì)胞，其線粒體密度遠(yuǎn)高于腎內(nèi)其他細(xì)胞，集合管內(nèi)的暗細(xì)胞也是富含線粒體的細(xì)胞，在酸堿平衡和鈉、氯、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

1.1 供能作用

線粒體主要是通過(guò)生產(chǎn)腺苷三磷酸 (adenosine triphosphate，ATP)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞供能的，ATP分子的產(chǎn)生一方面源于氧化磷酸化過(guò)程中電子呼吸鏈及線粒體內(nèi)膜間的電子轉(zhuǎn)移，另一方面，三羧酸循環(huán)也起著關(guān)鍵作用。在腎臟中，腎小管細(xì)胞需要較多的能量來(lái)介導(dǎo)皮質(zhì)內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而腎小球細(xì)胞只需要少量能量維持過(guò)濾和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[10]，因此腎小管中存在較高密度的線粒體，腎結(jié)石的產(chǎn)生源于腎小管，其結(jié)石成分中也存在線粒體蛋白。

1.2 氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)

大量證據(jù)表明腎結(jié)石的產(chǎn)生與組織氧化應(yīng)激相關(guān)。氧化應(yīng)激主要是由于過(guò)多自由基(free radical)的產(chǎn)生和線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)過(guò)量釋放引起的，其中復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程會(huì)生成過(guò)量的ROS。在正常生理?xiàng)l件下，線粒體本身具有高效的抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathi-one, GSH)等；一旦ROS的產(chǎn)生遠(yuǎn)超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)范圍，線粒體則難以清除過(guò)多產(chǎn)生的ROS，進(jìn)而會(huì)損傷線粒體，造成線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)損傷及線粒體蛋白的氧化修飾[11]。因此，線粒體的抗氧化系統(tǒng)對(duì)于維持供能和保護(hù)線粒體功能具有重要作用。尤其是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)，該機(jī)制對(duì)細(xì)胞內(nèi)急性產(chǎn)生的ROS起到關(guān)鍵的緩沖作用，是防止氧化應(yīng)激損傷和保護(hù)線粒體功能的最主要環(huán)節(jié)。此外，核轉(zhuǎn)錄因子2(nuclear transcription factor 2, NRF2)在氧化應(yīng)激條件下也能夠上調(diào)抗氧化物酶基因表達(dá)，從而對(duì)抗過(guò)多的ROS產(chǎn)生，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及線粒體功能保護(hù)具有重要作用[9]。目前已明確在腎結(jié)石生成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較多的ROS且結(jié)石石核中含有較多的破碎的線粒體蛋白，提示線粒體可能直接參與結(jié)石的生成。改善線粒體抗氧化應(yīng)激功能可能對(duì)于腎結(jié)石發(fā)生具有重要意義。

1.3 凋亡的調(diào)控

線粒體同時(shí)參與細(xì)胞程序性凋亡或死亡調(diào)控[12]。凋亡細(xì)胞死亡機(jī)制主要有兩條途徑，即線粒體參與的內(nèi)在途徑和程序性死亡相關(guān)受體參與的外在途徑。半胱天冬蛋白酶(caspases)的激活是兩種途徑進(jìn)行的共同最終環(huán)節(jié)。在內(nèi)在途徑中，線粒體細(xì)胞色素C被釋放至胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1, APAF-1)和ATP結(jié)合，促使procaspase-9形成凋亡小體，將procaspase-3轉(zhuǎn)化為效應(yīng)caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而在外在途徑中，細(xì)胞外配體與程序性死亡相關(guān)受體結(jié)合，誘導(dǎo)程序性死亡信號(hào)復(fù)合體的形成，caspase-8可以直接刺激效應(yīng)caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體功能障礙會(huì)致細(xì)胞凋亡過(guò)程中組織炎性反應(yīng)加劇，其主要通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子κB(NFκB)等炎性通路損傷組織。在腎結(jié)石的產(chǎn)生過(guò)程中，組織炎性反應(yīng)也是腎結(jié)石石核形成的重要原因之一。

2 腎結(jié)石疾病中線粒體功能作用的相關(guān)研究

較多的基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)了氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)是參與腎結(jié)石形成的重要因素[13-14]。氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)下游的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，尤其是組織炎性反應(yīng)和炎性損傷的產(chǎn)生，從而趨化組織中的黏附因子，增加成石晶體尤其是草酸鈣結(jié)晶(CaOx)在腎小管或腎間質(zhì)內(nèi)的滯留。在腎結(jié)石病早期，腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS誘發(fā)細(xì)胞損傷，與此同時(shí)，線粒體激活抗氧化物系統(tǒng)應(yīng)對(duì)這種氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞組織損傷，并抑制腎結(jié)石的形成[15-16]。因此，線粒體直接參與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，其功能穩(wěn)定性對(duì)腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。

鈣離子是尿液中最常見(jiàn)的離子之一，易與其他陰離子特別是草酸鹽和磷酸鹽結(jié)合以晶體形式沉淀。在所有不同類(lèi)型的腎結(jié)晶成分分析中，草酸鈣結(jié)晶(calcium oxalate crystal, CaOx)為最常見(jiàn)的一種。在正常生理?xiàng)l件下，CaOx晶體產(chǎn)生后黏附在腎小管細(xì)胞的表面，然后通過(guò)胞吞作用內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)，隨后在胞內(nèi)通過(guò)降解或溶解進(jìn)行排泄，其最終產(chǎn)物是游離鈣離子和草酸鹽離子。如果出現(xiàn)長(zhǎng)期的鈣超載，會(huì)導(dǎo)致線粒體的功能障礙，進(jìn)而ROS過(guò)量產(chǎn)生，黏附因子趨化及胞吞作用能力減弱，使得胞內(nèi)相關(guān)降解排泄過(guò)程減弱。此外，過(guò)量的ROS還會(huì)導(dǎo)致mtDNA損傷，繼而引起線粒體裂變和融合過(guò)程的改變、細(xì)胞損傷、凋亡、炎性反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步導(dǎo)致疾病進(jìn)展。經(jīng)電鏡觀察，腎結(jié)石患者的腎小管細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，線粒體內(nèi)存在鈣致密沉積；也有其他一些研究表明線粒體能夠與草酸鹽和CaOx晶體結(jié)合，其結(jié)合機(jī)制主要是通過(guò)線粒體蛋白和脂質(zhì)過(guò)氧化作用介導(dǎo)，從而進(jìn)一步促進(jìn)了CaOx晶體的形成和聚集[17]。有研究在結(jié)石基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了線粒體蛋白，在腎遠(yuǎn)端管腔結(jié)石晶體中也發(fā)現(xiàn)了線粒體碎片，證明了線粒體可能參與腎結(jié)石早期形成。

雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)線粒體與草酸離子和CaOx晶體的形成與消除具有直接作用，但既往的研究只集中于它們?cè)谡{(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和組織損傷方面的作用，也有幾項(xiàng)關(guān)于腎結(jié)石的線粒體損傷、ROS過(guò)度產(chǎn)生、線粒體膜電位喪失和線粒體腫脹的疾病機(jī)制[9,18]。對(duì)于線粒體功能檢測(cè)及其調(diào)控的對(duì)照研究相對(duì)較少；MS大鼠模型較正常大鼠更易產(chǎn)生腎結(jié)晶，經(jīng)動(dòng)態(tài)研究觀察發(fā)現(xiàn)MS大鼠抗氧化水平低，更易出現(xiàn)高草酸尿，而尿鈣水平卻較正常組降低；是否存在線粒體碎片黏附游離鈣或鈣致密沉積導(dǎo)致尿鈣減少還有待進(jìn)一步明確；此外，線粒體谷胱甘肽(mitochondrial glutathione, mGSH)可以保護(hù)線粒體功能，減少高草酸尿狀態(tài)下的草酸沉積[19]。相反條件下，mGSH減少則可能會(huì)引起線粒體功能的損失，并可能導(dǎo)致CaOx腎結(jié)石的發(fā)生，但目前仍缺乏有效證據(jù)。線粒體功能障礙不僅與腎小管損傷有關(guān)，而且可以通過(guò)降低CaOx結(jié)石部位單核細(xì)胞的線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞的晶體清除能力下降，從而進(jìn)一步加劇組織炎性反應(yīng)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)和組織受損，刺激誘發(fā)Randall斑塊的形成，最終導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生。目前沒(méi)有線粒體功能調(diào)控腎結(jié)石相關(guān)的直接臨床證據(jù)，僅有部分動(dòng)物研究針對(duì)已受損的免疫反應(yīng)和組織炎性反應(yīng)、間質(zhì)斑塊的形成使用各種抗氧化劑或自由基清除劑及多糖化合物，可以有效預(yù)防腎結(jié)石形成[20-21]。

3 線粒體功能障礙參與腎結(jié)石病的病理生理機(jī)制

草酸和鈣均可改變線粒體的結(jié)構(gòu)，促使線粒體穩(wěn)態(tài)改變，導(dǎo)致線粒體能量生產(chǎn)、ROS調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)功能不同程度的受損。目前的基礎(chǔ)研究大致通過(guò)3個(gè)潛在機(jī)制來(lái)體現(xiàn)線粒體功能障礙的病理生理與腎結(jié)石成石機(jī)制的相關(guān)性。

1)胞內(nèi)晶體黏附[21]：過(guò)量的草酸及游離鈣離子早期會(huì)誘發(fā)腎細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，清除大量的ROS會(huì)促使線粒體功能下降、供能減弱，導(dǎo)致線粒體ROS清除能力的進(jìn)一步下降，抗氧化酶產(chǎn)出減少。此外，過(guò)量的ROS、細(xì)胞色素C、游離鈣離子和其他促炎相關(guān)因子進(jìn)一步釋放到胞質(zhì)中，進(jìn)而通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷細(xì)胞膜，促進(jìn)腎細(xì)胞頂端的晶體沉積。再者，細(xì)胞色素C激活的凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)腎小管細(xì)胞損傷，誘發(fā)黏附因子表達(dá)，導(dǎo)致胞膜頂端的晶體穿破胞膜并不斷擴(kuò)大聚集，最終脫落隨尿液流動(dòng)至腎乳頭開(kāi)口處泌出，形成腎結(jié)石石核。

2)胞外聚集成石[22]：線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞碎片釋放聚集形成結(jié)石核心；細(xì)胞色素C的釋放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨后，凋亡小體、細(xì)胞碎片和破碎的亞細(xì)胞器被釋放到管腔中，然后與草酸鹽和CaOx晶體結(jié)合再進(jìn)行遷移。這些線粒體及亞細(xì)胞器成分、膜碎片等細(xì)胞碎片可直接作為遠(yuǎn)端腎段結(jié)石病灶形成的原料，進(jìn)一步促進(jìn)晶體相互黏附、生長(zhǎng)、聚集。大的聚集物可能阻塞管腔或遷移(通過(guò)腎小管液體流動(dòng))到腎盞內(nèi)形成結(jié)石。

3)間質(zhì)成石機(jī)制[23]：線粒體功能障礙引發(fā)Randall斑形成；在氧化應(yīng)激條件下，線粒體損傷可導(dǎo)致線粒體膜完整性的破壞，隨后向細(xì)胞質(zhì)釋放ROS、mtDNA、ATP和線粒體碎片。這些碎片成分可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的分泌并觸發(fā)炎性因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)也可招募各種免疫細(xì)胞，包括組織巨噬細(xì)胞等趨化至此間質(zhì)區(qū)域。這些免疫細(xì)胞的遷移可誘發(fā)組織炎性反應(yīng)。腎間質(zhì)通常情況下處于富磷酸鈣過(guò)飽和狀態(tài)。伴隨組織炎性反應(yīng)及相關(guān)因子的不斷趨化作用下，富含磷酸鈣的Randall斑形成。其中一些斑塊增長(zhǎng)后侵入腎盞乳頭或腎盂(大部分位于腎乳頭內(nèi)外側(cè))，促進(jìn)腎結(jié)石的進(jìn)一步發(fā)展。

就上述3種研究潛在機(jī)制而言，ROS的大量釋放均為導(dǎo)致腎細(xì)胞線粒體功能喪失的原因，其線粒體抗氧化能力下降導(dǎo)致組織炎性改變，兩者共同作用導(dǎo)致草酸及鈣調(diào)紊亂誘發(fā)石核產(chǎn)生。

4 問(wèn)題與展望

線粒體在腎結(jié)石病理生理過(guò)程中起重要作用，其作用機(jī)制主要通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)腎組織損傷和炎性反應(yīng)，促進(jìn)結(jié)石晶體形成、生長(zhǎng)、聚集和沉積。值得注意的是，線粒體功能障礙本身并不足以誘發(fā)腎結(jié)石的形成，例如mtDNA突變或有缺陷的編碼線粒體蛋白會(huì)導(dǎo)致幾種線粒體功能不全相關(guān)疾?。喝绨柎暮Ｄ?、癲癇、線粒體肌病、腦病、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(MELAS綜合征)等。然而，目前尚未有相關(guān)證據(jù)表明這些線粒體疾病和腎結(jié)石疾病之間存在關(guān)聯(lián)。腎結(jié)石的形成則涉及多種腎內(nèi)微環(huán)境改變[24-25]，如CaOx或磷酸鹽的過(guò)飽和、ROS過(guò)量釋放、腎小管細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)及串聯(lián)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)、尿量減少等諸多因素；其中鈣超載及CaOx/磷酸鹽的過(guò)飽和應(yīng)為其始動(dòng)因素，線粒體相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)為其中間途徑，石核形成后聚集釋放則為疾病發(fā)展的最終結(jié)果。在明確了上述致病機(jī)制后，通過(guò)抗氧化劑調(diào)節(jié)線粒體功能可能是預(yù)防新發(fā)或復(fù)發(fā)性腎結(jié)石形成的有效途徑。

抗氧化藥物可用于保護(hù)線粒體活性并拮抗各種疾病中ROS的過(guò)量產(chǎn)生，但其臨床療效和不良反應(yīng)仍不明確。有基礎(chǔ)研究表明只有CaOx結(jié)晶才會(huì)導(dǎo)致線粒體功能受損，而單純草酸鹽則不會(huì)[24]。此外，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體在多種代謝性疾病中被認(rèn)為是銜接ROS與炎性反應(yīng)的中間靶點(diǎn)，其表達(dá)下調(diào)后也可以逆轉(zhuǎn)潛在的線粒體損傷，減少胞內(nèi)ROS的過(guò)量釋放及腎小管細(xì)胞損傷；調(diào)控親環(huán)素(cyclophilin D, Cyp D) 和B細(xì)胞淋巴瘤-2 相互作用蛋白3 (BNIP3) 能通過(guò)修復(fù)線粒體功能來(lái)減少機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷[9]。目前尚未見(jiàn)腎結(jié)石治療中的相關(guān)線粒體保護(hù)/修復(fù)劑療效的臨床報(bào)道，還有待進(jìn)一步探索研究。

迄今，關(guān)于線粒體功能障礙、胞內(nèi)或線粒體內(nèi)鈣分布與結(jié)石發(fā)病機(jī)制之間的研究仍少見(jiàn)。從結(jié)石形成機(jī)制的相關(guān)性而言，此領(lǐng)域相關(guān)研究必將開(kāi)啟腎結(jié)石形成機(jī)制的新認(rèn)知、新視角，并在未來(lái)為腎結(jié)石預(yù)防策略提供新理念。