一種新的廣適性大白菜雜交種純度分子鑒定方法的研究

魏小春，原玉香，趙艷艷，王志勇，楊雙娟，蘇賀楠，董曉冰，李 林，姚春玲，張曉偉

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所 鄭州 450002； 2.鄢陵縣甘羅養(yǎng)生養(yǎng)老有限公司 河南鄢陵 461200）

種子純度是種子主要的質(zhì)量指標，純度降低會導致減產(chǎn)甚至有可能抵消一個新品種的增產(chǎn)潛力[1]。在種子生產(chǎn)和銷售過程中，由于不夠重視鑒定種子的品種真實性和品種純度，因此往往會給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。目前雜交種純度的鑒定一般是采用田間形態(tài)學鑒定法（幼苗形態(tài)鑒定）、蛋白質(zhì)電泳鑒定法和DNA 分子標記鑒定法[1]。田間形態(tài)學鑒定法檢測需要完成一個營養(yǎng)生長期，所需時間長，生產(chǎn)的雜交種要等到下一個季節(jié)或者異地鑒定后才能夠得到結(jié)果，而且鑒定結(jié)果容易受到當?shù)馗鞣N環(huán)境因素的影響，其準確性難以把握[1]。鑒于形態(tài)學方法的弊端，采用一種快捷、準確度高、實用性強的室內(nèi)檢測方法來代替田間形態(tài)學鑒定法是必然的。

隨著分子生物技術(shù)的不斷進步，分子標記技術(shù)已經(jīng)成為檢測作物雜交種純度真實且可靠的方法。DNA 分子標記技術(shù)不需要考慮組織的特異性，也不受外界環(huán)境的影響，鑒定準確、穩(wěn)定，重復性好，已成為更有前景的方法[3]。鐘開勤等[2]利用SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴增多態(tài)性）標記技術(shù)，建立福春1 號大白菜的DNA 指紋圖譜，分子標記鑒定結(jié)果與常規(guī)田間形態(tài)學鑒定結(jié)果吻合，用于大白菜純度鑒定快速且準確。宋順華等[4]采用AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）技術(shù)，從20 對引物組合中篩選出組合E-ACA/M-CTG，能將供試的90 個大白菜品種全部區(qū)分開來；同時用該引物組合檢測2 個大白菜商品種（北京新2 號，京夏王）的純度，除1 個單株外，其AFLP 標記是非常一致的。對比田間性狀調(diào)查結(jié)果，認為AFLP 技術(shù)對雜交種純度鑒定的結(jié)果可靠。楊曉云等[5]利用SSR（simple sequence repeats，簡單序列重復）共顯性分子標記P3鑒定青研早9 號、青研桔15 和青研春白一號3 個大白菜雜交種的純度，與田間性狀調(diào)查結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，該標記鑒定的結(jié)果可靠。趙新等[6]應用SSR 分子標記及高分辨率溶解曲線技術(shù)（high-resolution melting，HRM）篩選出用于大白菜雜交純度鑒定的復合SSR 位點，復合EST-SSR 標記對秋綠75、津秋78 和秋綠60 等10 份大白菜雜交種進行純度鑒定，能夠很好地進行雜交種純度鑒定，且通過一次PCR 反應能夠同時檢測到3 個不同的多態(tài)性位點。張庶等[7]利用3 對EST-SSR 引物（BRE28、BRE121 和BRE131）對13 個大白菜品種（夏白1 號、夏白45 等）進行純度鑒定，其擴增產(chǎn)物都表現(xiàn)出雙親互補帶型，而且?guī)烷g的大小差異明顯，能夠很好地區(qū)分雜交種和親本，可以快速、準確地鑒別大白菜雜交種純度。薛銀鴿等[8]利用InDel標記（insertion and deletion，插入/缺失）引物組合BrID90107 和BrID10667 可以將豫新四號與其親本完全區(qū)分開來，可以有效鑒別大白菜雜交種純度。

自交不親和性（self-incompatibility）普遍存在于被子植物中，是防止植物近親繁殖、保持遺傳變異的一種重要的遺傳機制[9]。蕓薹屬植物屬于典型的孢子體型自交不親和類型，其在遺傳上由一個具有復等位基因的高度多態(tài)性的S 位點控制[10-11]，每一個S 位點被稱為一個S 單元型（S haplotype），根據(jù)S 位點基因序列的相似性，可將蕓薹屬自交不親和等位基因分為兩大類：I 類和II 類[12]。在花粉中，I類S 單元型對II 類S 單元型均表現(xiàn)為顯性[13]。I 類S 單元型具有較強的自交不親和性，而II 類S 單元型的具有一定的自交親和性。大白菜（Brassica rapassp.pekinensis）是十字花科蕓薹屬異花授粉作物，充分利用雜種優(yōu)勢主要途徑之一是自交不親和系制種。目前大白菜雜交種主要采用自交不親和性制種，雜種率達不到100%，且其為異花授粉作物，由于自交不親和性也受到溫度等環(huán)境因素影響，時常會出現(xiàn)親本有極少量自交結(jié)實現(xiàn)象，因此對大白雜交種進行純度鑒定是非常必要的[14]。

對大白菜雜交種純度鑒定的方法，以往的經(jīng)驗就是將所生產(chǎn)的雜交種，加上2 個親本，按照一定的數(shù)量進行穴盤基質(zhì)育苗，進行表型觀察。而進行分子標記純度鑒定時，首先需要基于親本開發(fā)相應的分子標記，有基因型依賴。利用大白菜自交不親和系制種的親本可以分為3 種情況，2 個親本分別為I 類和II 類自交不親和系，同時為I 類自交不親和系或同時為II 類自交不親和系。有鑒于此，筆者的研究目標是提供一種廣適性的大白菜雜交種純度鑒定的方法，將PCR 擴增和酶切篩選結(jié)合，精確度高、用時短。利用自交不親和S 等位基因的保守性設(shè)計PCR 擴增引物，進行商品雜交種的S 單元型區(qū)分；同時，對鑒定結(jié)果為同一類型的S 單元型利用不同的限制性內(nèi)切酶進行區(qū)分，進而快速準確進行純度鑒定，整個周期只需2～3 d，快速精準。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019 年12 月至2020 年11 月在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地開展，豫新9 號（母本Y358-10 為I 類S 單元型S9，父本Y177-28 為II 類S 單元型S40）、豫新58（母本Y195-93 為I 類S 單元型S45，父本Y66-9 為I 類S 單元型S46）及優(yōu)選組合Y663-8×G90E16（母本Y663-8 為II 類S 單元型S60，父本G90E16 為II 類S 單元型S40）為河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所葉類蔬菜研究室自育品種，按照株行距50 cm×60 cm 定植到田間，每個材料288 株。27 份大白菜材料由河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所葉類蔬菜研究室收集保存，利用穴盤基質(zhì)育苗方式進行育苗，每個材料96 株。后期試驗驗證時，將生產(chǎn)的大白菜雜交種利用培養(yǎng)皿進行催芽。用改良后的CTAB 法整株提取萌發(fā)種子DNA[15]。

1.2 自交不親和復等位基因多序列比對

根據(jù)NCBI 上自交不親和基因（S locus）的序列，進行核苷酸水平比對分析。I 類S 單元型 包 括：S61（AB298887.1）、S55（AB298885.1）、S35（AB298877.1）、S32（AB298876.1）、S54（AB219162.1）、S46（AB013718.2）、S12（D38564.2）、S22（AB054061.1）、S8（D38563.1）、S52（AB298883.1）、S38（AB298879.1）、S21（AB270775.1）、S45（AB012106.1）、SRK- f2（AB190354.1）、S53（AB298884.1）、S9（D30049.1）、S47（AB180899.1）。II 類S 單 元 型 包 括：S40（AB211197.1）、S60（AB097116.1） 、 S44 （AB211198.1） 、 S29（AB008191.1）[16]。

1.3 聚合酶鏈式反應（PCR）

根據(jù)I 類和II 類S 單元型序列設(shè)計引物I 類S單元型引物，上游引物BrCIF：5’-GATGARTTTATGAATGAGGTGA-3’，下 游 引 物BrCIR：5’-CTGAGCAGGTGTACTKGTTCACCG-3’；II 類S 單元型引物，上游引物BrCIIF：5’-GGAAGGTTAGTTGACGGGCAAG-3’，下游引物BrCIIR：5’-GACGCTCGGTAATATGATAGTC-3’。PCR 反應體系總體 積 為20.0 μ L，含 有PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0）10.0 μ L，上 下 游 引 物 各0.5 μ L（10 μmol?L-1），2.0 μL DNA 模板（40 ng?μL-1），7.0 μL的滅菌水，試劑購自Takara 公司。PCR 擴增程序包括：94 ℃變性2 min；35 個循環(huán)，每循環(huán)94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離（Bioweste Agarose 瓊脂糖，北京）PCR 擴增產(chǎn)物。

1.4 限制性內(nèi)切酶反應

根據(jù)PCR 擴增結(jié)果，對雜交種的純合親本為同一類S 單元型時，分別用限制性內(nèi)切酶Hinf I（I 類S 單元型）和AluI（II 類S 單元型）進行消化[17-19]。酶切反應體系為20.0 μL，含有10.0 μL 的滅菌水，2.0 μL 的10×內(nèi)切酶緩沖液，1.0 μL 的HinfI 或AluI酶（10 U）及10.0 μL 的PCR 產(chǎn)物，試劑購自Takara 公司。反應體系于37 ℃條件下消化16 h，3.0%瓊脂糖凝膠電泳分離（購自Lonza，美國）。

1.5 大白菜商品雜交種純度鑒定

通過各類型的鑒定方法進行純度鑒定，根據(jù)所鑒定出的純合體數(shù)量，計算各組合/商品種的雜合體比例，即純度，計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜S等位基因多樣性及酶切位點分析

由圖1～2 可知，I 類S 單元型中，Hinf I 為多態(tài)性酶切位點；II 類S 單元型中，AluI 為多態(tài)性酶切位點。

圖1 大白菜I 類S 單元型保守性及酶切位點分析

圖1（續(xù)）

圖2 大白菜II 類S 單元型保守性及酶切位點分析

2.2 雜交種純度S等位基因分子鑒定結(jié)果

以大白菜雜交種基因組DNA 為模板，分別以引物BrCI、BrCII 進行PCR 擴增獲得擴增產(chǎn)物；在筆者的試驗中，大白菜商品雜交種中的純合親本的擴增產(chǎn)物的電泳表現(xiàn)為：以BrCI 引物對擴增有條帶，大小為1075 bp 左右；以BrCII 引物擴增有條帶，大小為1190 bp 左右。

將其PCR 產(chǎn)物進行電泳，當分別以引物BrCI和BrCII 進行PCR 擴增均有目標條帶時，則該大白菜商品雜交種中的純合材料分別為I 類和II 類S單元型；當以引物BrCI 進行PCR 擴增有目標條帶，并且以引物BrCII 進行PCR 擴增無條帶時，則該大白菜商品雜交種中的純合材料同時為I 類S 單元型；當以引物BrCI 進行PCR 擴增無條帶，并且以引物BrCII 進行PCR 擴增有目標條帶時，則該大白菜商品雜交種中的純合材料同時為II 類S 單元型。當大白菜商品雜交種中的純合材料分別為I 類S 單元和II 類S 單元型時，篩選以引物BrCI 和BrCII 分別擴增后產(chǎn)物中具有一個目標條帶的材料（圖3）。

圖3 大白菜商品雜交組合（CI×CII）PCR 擴增情況

當供試大白菜商品雜交種的純合親本為I 類S單元型時，用限制性內(nèi)切酶Hinf I 進行酶切消化獲得酶切產(chǎn)物，將其酶切產(chǎn)物進行電泳，篩選酶切產(chǎn)物電泳條帶的帶型不同的材料為純合材料（圖4）。

圖4 大白菜商品雜交種（CI×CI）PCR 產(chǎn)物酶切后電泳情況

當供試大白菜商品雜交種的親本為II 類S 單元型時，用限制性內(nèi)切酶AluI 進行酶切消化獲得酶切產(chǎn)物，將其酶切產(chǎn)物進行電泳，篩選酶切產(chǎn)物中電泳條帶的帶型顯著不一致的材料為純合材料（圖5）。

圖5 大白菜商品雜交種（CII×CII）PCR 產(chǎn)物酶切后電泳情況

2.3 分子標記檢測與田間表型鑒定純度結(jié)果對比

基于上述分析結(jié)果，筆者的試驗采用自育商品種豫新9 號（母本Y358-10 為I 類S 單元型S9，父本Y177-28 為II 類S 單元型S40），豫新58（母本Y195-93 為I 類S 單元型S45，父本Y66-9 為I 類S單元型S46）及優(yōu)選組合Y663-8×G90E16（母本Y663-8 為II 類S 單元型S60，父本G90E16 為II 類S 單元型S40）進行驗證。

分別將大白菜雜交種材料進行穴盤基質(zhì)育苗，通過田間植株表型觀察，因純合個體材料相對于雜交種不具有雜種優(yōu)勢，所以植株長勢、葉色、葉片數(shù)量等形態(tài)特征上有明顯差異。豫新9 號雜交種植株的田間表型為高樁合抱，母本植株的田間表型為葉面光滑、合抱、高樁直筒形；父本植株的田間表型為葉片亮綠、有毛、合抱、卵圓形。通過對田間288株大白菜植株的抱合類型、葉片光毛等性狀進行鑒定，有10 株因長勢較弱、葉面少毛、株幅小等特點被鑒定為母本或異花粉雜株，測得純度為96.53%。通過BrCI 與BrCII 引物分子檢測對其開展純度檢測，測得純度為97.22%。分子標記檢測和田間檢測吻合度為99.29%。豫新58 雜交種植株的田間表型為矮樁疊抱；母本植株的田間表型為疊抱、矮樁，中熟；父本植株的田間表型為疊抱、矮樁、早熟、葉面無毛。通過對田間288 株大白菜的抱合類型、葉片光毛等性狀進行鑒定，有9 株因長勢較弱、葉色深綠、株幅小等特點被鑒定為母本或異花粉雜株，測得純度為96.88%。通過BrCI 與BrCII 引物分子檢測對其開展純度鑒定，測得純度為97.57%。分子標記檢測和田間檢測吻合度為99.29%，可用于大白菜雜交種純度快速檢測。優(yōu)選組合Y663-8×G90E16雜交種植株的田間表型為矮樁疊抱；母本植株的田間表型為葉面有毛、葉色淺、疊抱、矮樁、中熟；父本植株的田間表型為葉面蠟粉無毛、葉色深、疊抱、矮樁、早熟。通過對田間大白菜植株的長勢、葉色和株幅等性狀進行鑒定，有39 株因長勢較弱、葉色淺、株幅小等特點被鑒定為母本或異花粉雜株，測得純度為86.46%。通過BrCI 與BrCII 引物分子檢測對其開展純度鑒定，測得純度為87.85%。分子標記檢測和田間檢測吻合度為98.42%。由此可知，筆者的試驗能把商品雜交種中純合個體與雜合體區(qū)分開來，從而驗證大白菜商品雜交種的純度（表1）。

表1 自交不親和S 單元型標記與田間表型觀察鑒定純度結(jié)果對比

2.4 在商品雜交種純度檢測中的應用

對于未知父、母本類型的商品雜交種而言，利用引物BrCI、BrCII 也可以分別對27 種商品種進行純度鑒定。對其純合體進行統(tǒng)計，然后計算獲得各商品種的中純合體數(shù)量，進而得出各商品種的純度（表2）。經(jīng)純度鑒定可知，中獅菊紅心、CR 春美609 及高產(chǎn)狀元商品種雙親均為I 類S單元型；商品種火鳳凰的親本為II 類S 單元型；其余商品種純合材料分別為I 類S 單元和II 類S單元。

表2 各商品種的純度鑒定結(jié)果表

3 討論與結(jié)論

種子純度鑒定能夠保障種子優(yōu)良遺傳特性被充分利用，是防止良種混雜退化、提高種子質(zhì)量和產(chǎn)品品質(zhì)的手段。在生產(chǎn)實踐中，能給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失的主觀原因往往是不重視種子品種純度和真實性檢驗。若大白菜的授粉過程中出現(xiàn)氣溫過低等情況就可能出現(xiàn)親本自交親和的現(xiàn)象，從而導致大白菜商品雜交種的純度降低，造成一定的經(jīng)濟虧損。

大白菜是十字花科蕓薹屬自花授粉植物，雜種優(yōu)勢明顯，一方面大白菜優(yōu)良品種大部分是利用自交不親和系來進行雜交種生產(chǎn)的，而在此過程中雜交種的純度鑒定是必不可少的，可以明確商品雜交種攜帶的基因型，從而配制不同的雜交種組合，獲得雜交優(yōu)勢品種，這對加速育種進程和雜種優(yōu)勢育種有重要的指導意義；另一方面種子的純度鑒定可以確保白菜的產(chǎn)量和品種品質(zhì)，以達到相應的經(jīng)濟效益。

對于種子的純度鑒定，白菜雜交種純度鑒定的傳統(tǒng)方法是田間形態(tài)學鑒定，但是這一方法不僅費時占地，還易受環(huán)境的影響，而且鑒定結(jié)果準確性低，且承擔的經(jīng)濟風險較大。同工酶電泳技術(shù)也被用于雜交種鑒定，但該方法的局限性在于未能檢測到近緣系的多態(tài)性[20]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標記技術(shù)也被充分應用于大白菜雜交種的純度鑒定，已經(jīng)應用AFLP、SRAP、RAPD、SSR 和In-Del 等分子標記鑒定各種白菜品種和親本的純度，且認為分子標記的種子檢驗對雜交種純度鑒定結(jié)果可靠。Zhang 等[21]利用隨機在大白菜10 條染色體上均勻分布的36 個SSR 標記，選取其中的1～2個SSR 標記對其大白菜雜交種進行純度鑒定，并結(jié)合田間形態(tài)學表現(xiàn)驗證了結(jié)果的可靠性。DNA 分子標記技術(shù)的優(yōu)點在于它具有共顯性、多態(tài)性高、信息量高、操作簡單、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，且不受外界環(huán)境的影響，結(jié)果穩(wěn)定。因此，基于DNA 分子標記技術(shù)能更加有效地鑒別不同的甚至近親的基因型，該技術(shù)在雜交種純度鑒定等方面具有廣闊前景。

雖然分子標記是鑒定種子純度簡便、快速且精確高的方法，但目前存在一定的局限性，它具有基因依賴性，只能根據(jù)現(xiàn)有遺傳信息和有限的參考基因組，去針對特定的樣品或品種開發(fā)分子標記，所以這種方法適用范圍較小，不適用于同一作物的廣適性的純度鑒定[22]。對于利用SRAP 技術(shù)鑒定大白菜雜交種純度而言，不同基因型大白菜需要的引物組合不同，嚴慧玲等[23]篩選出引物組合M4+E3 對進行多抗3-31 等商品種純度鑒定，其父、母本能夠?qū)U增的穩(wěn)定譜明顯表現(xiàn)出來，且?guī)途哂谢パa性，能夠清楚地鑒別品種純度；鐘開勤等[2]篩選出的引物組合M2+E4 對福田1 號進行純度鑒定，其結(jié)果也能夠清楚的鑒別出所測試品種的純度[1，23]。說明對于不同基因型大白菜親本，進行雜種一代純度鑒定時需要不同的引物組合。因此鑒定一個新的品種純度時，必須重新篩選出與該品種所匹配的引物組合，而這個過程即費時又費力。

筆者利用大白菜自交不親和性的S 等位基因的保守性設(shè)計引物，用于大白菜雜交種純度的廣適性鑒定。由于自交不親和性是十字花科植物包括大白菜所共有的繁殖特性，且自交不親和性等位基因具有保守性，相對于其他分子標記來說穩(wěn)定性較高，使得它不僅適用于白菜品種的純度鑒定，還能夠以其為模型套用在大部分十字花科植物，避免了設(shè)計各個品種所特有的引物，大大簡化了試驗的過程，提高了試驗效率，并且S 單元型的類型可以通過測序的方式得以驗證，操作簡單，結(jié)果可靠。筆者通過對自交不親和性S 復等位基因的保守性設(shè)計引物BrCI 和BrCII，根據(jù)擴增產(chǎn)物中目標條帶的有無，來判定雜交種純度；當親本材料同屬同類S單元型時，可分別用Hinf I 和AluI 進行酶切，依據(jù)酶切結(jié)果來判定雜交種純度。通過自育已知親本類型商品種的純度鑒定，結(jié)果符合商品雜交種純合材料出現(xiàn)的3 種情況，并能夠有效進行純度鑒定。另外對27 個未知親本類型的商品種進行純度鑒定，結(jié)果表明該方法具有廣適性。

筆者研究的目的在于提供一種廣適性的大白菜雜交種純度鑒定的方法，將PCR 擴增篩選和酶切篩選結(jié)合，精確度高，用時短。利用自交不親和的S等位基因的保守性設(shè)計PCR 擴增引物，進行商品雜交種的S 單元型區(qū)分；同時，對鑒定結(jié)果為同一類型的S 單元型，利用不同的限制性內(nèi)切酶進行區(qū)分，進而快速準確進行純度鑒定；整個周期只需要2～3 d，快速精準。