基于香氣指紋圖譜和多元化學計量法對黃金茶2號等級的判別分析

巢 瑾，周令欣，銀飛燕，羅 茜，趙萌萌，袁 勇，吳浩人，李 跑，蔣立文,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.國家茶葉加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南省茶葉種植與加工工程技術(shù)研究中心，湖南省茶業(yè)集團股份有限公司，湖南 長沙 410126）

黃金茶原產(chǎn)于湖南湘西地區(qū)保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村，具有“四高四絕”的品質(zhì)特征，被譽為“中國最好的綠茶之一”[1]。明顯的熟板栗香高而持久，是黃金茶的品質(zhì)特征之一[2]?！跋嫖鼽S金茶”是湘西土家族苗族自治州所轄區(qū)域內(nèi)生產(chǎn)，以黃金茶系列品種鮮葉為原料，按照T/HNTI 010—2019《湘西黃金茶 綠茶加工技術(shù)規(guī)范》的要求加工而成，具有“翠、香、鮮、濃”品質(zhì)特征的地理標志綠茶。茶葉的香氣可能受到品種[3]、原料等級[4]、產(chǎn)地[5]和生產(chǎn)工藝條件[6-7]等多方面的影響。在GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中，香氣對茶葉感官品質(zhì)的貢獻率達25%～35%。而該方法對評審人的經(jīng)驗有較高要求，且容易受主觀因素的影響[8]，導致茶葉同等級間質(zhì)量差別較大，市場質(zhì)量參差不齊，嚴重影響了茶葉生產(chǎn)和消費[9]。

指紋圖譜指在固定的實驗條件下將待測物經(jīng)適當處理后得到能標識其化學特征的譜圖[10]，其數(shù)據(jù)需結(jié)合化學計量學通過統(tǒng)計分析獲得有效結(jié)論[11]，可以用于茶葉品牌[12]、產(chǎn)地[13]、等級等方面的判別。Li Zhanbin等[14]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用方法建立了貴州綠茶香氣成分的指紋圖譜。張玲玲等[15]建立不同品種茶葉的液相指紋圖譜，為其質(zhì)量控制和科學應用提供參考依據(jù)。王旭[16]采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法構(gòu)建不同品質(zhì)鐵觀音液相指紋圖譜能夠很好地鑒別優(yōu)良兩級品質(zhì)的鐵觀音。徐淑娟[17]將提取出的15 個共有物質(zhì)峰作為鑒別鐵觀音來源的必要條件。

此前利用香氣指紋圖譜對黃金茶進行等級判別的研究較少，因此本實驗采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對湘西黃金茶香氣組分進行高效提取和分離檢測，結(jié)合自動質(zhì)譜解卷積鑒定系統(tǒng)（automated mass-spectral deconvolution and identification system，AMDIS）解析共流出組分，利用NIST數(shù)據(jù)庫和保留指數(shù)（retention index，RI）定性，建立黃金茶一級和二級指紋圖譜，利用化學計量學方法對數(shù)據(jù)進行降維處理，篩選差異香氣組分，并建立等級判別函數(shù)，為湘西黃金茶的分級提供客觀數(shù)據(jù)支撐和輔助手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃金茶一級樣13 個批次，分別標記為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13；黃金茶二級樣10 個批次，分別標記為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10。由湖南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所和湖南省茶業(yè)集團股份有限公司提供。所有樣品經(jīng)粉碎后過40 目篩，裝入鋁箔袋中密封保存。

C7～C40正構(gòu)烷烴標準品購自美國Supelco公司，正己烷稀釋，配制成10 mg/L溶液；癸酸乙酯標準品購自北京百靈威科技有限公司，乙醇溶解，配制成10 mg/L溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；手動固相微萃取進樣器、65 μm CAR/PDMS萃取纖維美國Supelco公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件

準確稱取茶葉樣品0.5 g于20 mL頂空瓶內(nèi)，依次加入一顆磁轉(zhuǎn)子和100 ℃蒸餾水10 mL，迅速蓋緊頂空瓶蓋。準確量取20 μL癸酸乙酯內(nèi)標溶液注入瓶內(nèi)。將頂空瓶置于60 ℃磁力攪拌水浴鍋中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速20 r/min，平衡10 min。將250 ℃老化30 min的手動固相微萃取進樣器固定在頂空瓶上方，插入頂空瓶內(nèi)，推出萃取頭并開始計時，頂空吸附50 min。收回萃取頭，將固相微萃取進樣器立即插入氣相色譜儀進樣口，在240 ℃解吸附5 min，點擊開始運行收集數(shù)據(jù)。

1.3.2 色譜條件

進樣口溫度240 ℃，進樣模式為不分流進樣，分流出口5 min 打開；色譜柱為HP-5 ms 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（99.999%），柱流量1.5 mL/min；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min上升至170 ℃，再以5 ℃/min上升至220 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子化電壓70 eV；質(zhì)譜掃描范圍m/z35～500；傳輸線溫度280 ℃。

1.3.4 香氣成分的定性

用AMDIS對色譜圖進行自動解卷積，得到的峰質(zhì)譜圖與NIST 17數(shù)據(jù)庫進行比較，匹配因子設(shè)置為80；在相同實驗條件下測得正構(gòu)烷烴標準品的保留時間，以此計算各色譜峰的RI，并與NIST 17 RI庫進行比較，個別與文獻值比較，確定各個色譜峰對應的化合物。RI計算公式如下：

式中：RIunknown為未知組分的保留指數(shù)；n為未知組分前一正構(gòu)烷烴標準品的碳原子數(shù)；RTunknown為未知組分的保留時間；RTn為該組分前一正構(gòu)烷烴標準品的保留時間；RTn+1為該組分后一正構(gòu)烷烴標準品的保留時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

同一個樣品重復3 次。利用癸酸乙酯內(nèi)標質(zhì)量濃度和峰面積計算香氣組分的相對含量，計算3 次重復的平均值和標準偏差。將同一等級的黃金茶樣品的總離子流數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，生成對應等級的指紋圖譜；使用TBtools對共有香氣組分進行熱圖分析和聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）；以2 個等級黃金茶的共有香氣組分的平均含量為參數(shù)，采用夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、新模型負指數(shù)法、改進Nei系數(shù)法、改良程度相似度、新改良程度相似度6 種方法計算2 個等級黃金茶指紋圖譜的相似度[18]。使用SIMCA 14.1（Umetrics）對黃金茶共有香氣組分進行PCA和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）；并結(jié)合SPSS 23.0（IBM）進行t檢驗，以VIP≥1，P＜0.05為條件篩選特異香氣組分，再利用多層感知神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（multilayer perceptron，MLP）和線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA）對特異香氣組分的判別能力進行驗證和建立判別方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣組分的定性分析

利用A M D I S 對樣品色譜圖進行解卷積，共分離出495 個組分。通過與NIST 17數(shù)據(jù)庫比對（相似度≥80），結(jié)合RI驗證，共鑒別出81 種香氣組分（表1）。以內(nèi)標質(zhì)量濃度和峰面積計算各香氣組分的相對含量，并統(tǒng)計各類型香氣組分的總含量。

表1 2 個等級黃金茶香氣組分Table 1 Aroma components of two grades of Huangjincha tea

續(xù)表1

由圖1可以看出，2 個等級的黃金茶香氣組分的種類相似，但各類的總含量有差異，從大到小依次為醇類、烴類、烯類、酯類、醛類、酮類、苯類、雜環(huán)類。2 個等級黃金茶的烯類組分含量呈極顯著差異（P＜0.01），酮類組分含量呈顯著差異（P＜0.05），其他各類香氣含量及香氣組分總含量差異不顯著（P＞0.05）。這說明2 個等級黃金茶之間香氣組成的差異主要是由烯類和酮類化合物的含量差異引起。

圖1 2 個等級黃金茶不同類型香氣總含量比較Fig.1 Comparison of total content of aroma species between two grades of Huangjincha tea

81 種香氣組分中醇類14 種，以芳樟醇、香葉醇和橙花叔醇為主，其中芳樟醇和香葉醇質(zhì)量濃度在2 個等級的黃金茶中差異不顯著；黃金茶二級中橙花叔醇含量則是黃金茶一級的3 倍。研究結(jié)果與Wu Yuanshuang等[20]認為芳樟醇、苯甲醇、香葉醇、橙花叔醇是綠茶中的主要香氣化合物基本一致。張銘銘等[3]認為板栗香綠茶的芳樟醇含量高于嫩栗香綠茶。烷烴類13 種，以2,6,11-三甲基-十二烷和4,6-二甲基-十二烷為主。烯烴類共17 種，以反式-β-羅勒烯、反式-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯和β-杜松烯為主。反式-β-羅勒烯有著甜香和香草氣息，香氣閾值較低（0.034 μg/kg），其在黃金茶二級中的含量是黃金茶一級中的5 倍。酯類15 種，以順-3-己烯基-己酸酯和順-3-己烯基丁酸酯為主。較多研究文獻報道在栗香型綠茶中檢出順-3-己烯基丁酸酯，表明其可能與板栗香品質(zhì)的形成有關(guān)[21]。醛類7 種，以壬醛和癸醛為主，壬醛在2 個等級的黃金茶中差異不顯著，癸醛含量隨著等級的下降而升高。張銘銘等發(fā)現(xiàn)庚醛和壬醛在板栗香綠茶中含量較高，嫩栗香中較低[3]。酮類13 種，以順-茉莉酮為主，其是一種帶有茉莉花香的化合物。苯環(huán)類和雜環(huán)類在一級和二級中分別檢測到5 種和3 種。

2.2 香氣指紋圖譜的建立及相似度分析

將同一等級的黃金茶的總離子流數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，通過自動匹配，以平均數(shù)法分別生成2 個等級黃金茶的指紋圖譜（圖2、3）。本次2 個等級23 個批次的黃金茶中共檢測出41 種共有香氣組分，占總香氣濃度的85.7%～94.5%，具有一定的代表性，可以反映指紋圖譜的特征信息[8]。黃金茶一級各共有組分的保留時間相對標準偏差小于0.39%，黃金茶二級（HJC2）各共有組分的保留時間相對標準偏差小于0.47%，表明共有組分在GC-MS色譜圖中具有相對穩(wěn)定性[22]。黃金茶一級各樣本間的相似度在0.954～0.988之間，黃金茶二級各樣本間的相似度在0.924～0.975之間。據(jù)此分別建立了黃金茶一級和黃金茶二級的香氣指紋圖譜[9]。

圖2 黃金茶一級香氣指紋圖譜Fig.2 Aroma fingerprints of grade I of Huangjincha tea 2

圖3 黃金茶二級香氣指紋圖譜Fig.3 Aroma fingerprints of grade II of Huangjincha tea 2

相比于產(chǎn)地、種類上的差異，同種茶的不同等級之間的差異判別屬于小類水平上的區(qū)別。以黃金茶一級指紋圖譜為參照，分別用夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、改進的Nei系數(shù)法、新模型負指數(shù)法、改良程度相似度法、新改良程度相似度法衡量黃金茶一級和二級指紋圖譜間的相似程度（表2）。6 種相似度計算方法中，新改良程度相似度法能最大程度地反映黃金茶不同等級指紋圖譜之間的差異，這與王淑慧等[9]的研究一致，表明采用指紋圖譜相似度計算的方法可以作為黃金茶分級的參考方法。

表2 不同等級黃金茶香氣指紋圖譜相似度計算結(jié)果Table 2 Similarity calculation of aroma fingerprints between two grades of Huangjincha tea 2

2.3 共有香氣組分的差異分析

以23 個黃金茶樣本的共有香氣組分相對含量建立PCA模型，結(jié)果顯示5 個PC共提取到香氣成分79.8%的信息，其中＝0.798，Q2＝0.429。PC得分圖（圖4）顯示，部分不同等級的黃金茶樣本存在交叉。通過對23 個黃金茶樣本的共有組分制作熱圖（圖5），可以直觀看出各香氣組分之間的差異和樣品間的差異。所有黃金茶樣本中C33（芳樟醇）和C50（香葉醇）含量較高，是構(gòu)成黃金茶香氣的主要組分，C10（庚醛）、C23（檸檬烯）、C57（β-蓽澄茄油烯）、C64（bicyclosesquiphellandrene）、C71（十六烷）、C75（十七烷）、C77（棕櫚酸甲酯）的含量較低。HCA（圖5）可以看到相同等級的黃金茶沒有被完全聚類到一起，不同等級的黃金茶樣本出現(xiàn)了交叉聚合；這表明23 批次的黃金茶樣本具有相近的香氣組成結(jié)構(gòu)，不易區(qū)分等級。

圖4 2 個等級不同樣品黃金茶共有香氣PCA圖Fig.4 PCA plot of common aroma components between two grades of Huangjincha tea 2

圖5 2 個等級不同樣品黃金茶共有香氣組分熱圖Fig.5 Heatmap of common aroma components between two grades of Huangjincha tea 2

2.4 OPLS-DA

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，不僅能實現(xiàn)樣品差異的鑒別，還能獲得樣品差異的特征標記物[23]。以41 種共有香氣組分作為自變量，進行OPLS-DA，結(jié)果顯示模擬的自變量擬合指數(shù)R2x（cum）＝0.515，因變量擬合指數(shù)（cum）＝0.960，模型預測指數(shù)Q2（cum）＝0.919。通常，R2和Q2超過0.5表示模型擬合良好[5]。如圖6所示，經(jīng)過200 次置換檢驗，結(jié)果顯示，Q2的回歸線在縱坐標上的截距小于0，說明模型不存在過擬合。2 個等級黃金茶分別位于y軸的兩邊，黃金茶一級樣本分布較為集中，黃金茶二級樣本分布較為分散（圖7），說明41 種共有香氣組分可以作為OPLS-DA模型的變量，被用來區(qū)分黃金茶的等級。

圖6 OPLS-DA模型的置換檢驗圖Fig.6 Permutation test for validation of OPLS-DA model

圖7 不同等級黃金茶的OPLS-DA得分圖Fig.7 Score plot of OPLS-DA of two grades of Huangjincha tea 2

通過計算變量投影重要度（variable important in projection，VIP）衡量各組分的含量對分類判別的影響強度和解釋能力，VIP值越大，該組分對模型的貢獻率越大。如圖8 所示，以VIP ≥1 為界限，共篩選13 種香氣組分，其中相對含量差異顯著（P＜0.05）的組分有9 種，分別為C10（庚醛）、C23（檸檬烯）、C25（反式-β-羅勒烯）、C30（1-辛醇）、C37（反式-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯）、C68（反-橙花叔醇）、C72（1,10-diepicubenol）、C73（epicubenol）、C77（十六酸甲酯），即2 個等級黃金茶的差異香氣組分。

圖8 不同等級黃金茶OPLS-DA的VIP圖Fig.8 VIP of OPLS-DA of differential aroma components between two grades of Huangjincha tea 2

散點圖（圖9）顯示，C10（庚醛）、C30（1-辛醇）、C72（1,10-diepicubenol）、C73（epicubenol）位于y軸的左側(cè)，與黃金茶一級的相關(guān)性較好；C23（檸檬烯）、C25（反式-β-羅勒烯）、C37（反式-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯）、C68（反-橙花叔醇）、C77（十六酸甲酯）位于y軸的右側(cè)，與黃金茶二級的相關(guān)性較好。結(jié)合差異香氣組分的特征描述和閾值（表3）可以預測，2 個等級的黃金茶香氣總體相似，但黃金茶一級的氣味偏清香，而黃金茶二級的氣味偏甜香。實際茶樣的香氣感官評審結(jié)果顯示，黃金茶一級為嫩栗香，黃金茶二級為熟栗香。這與本實驗的預測結(jié)果較為接近。

圖9 不同等級黃金茶OPLS-DA的散點圖Fig.9 Biplot of OPLS-DA of two grades of Huangjincha tea 2

表3 差異香氣組分特征描述Table 3 Description of aroma characteristics of differential aroma components

2.5 基于差異香氣組分的等級判別

Peng Tianqin等[25]對嶗山綠茶采收季節(jié)的分類研究顯示，基于VIP選擇的3 個特征分量的PLS-DA模型具有與原模型相同的預測能力。采用MLP和判別因子分析[26]（discriminant factor analysis，DFA）驗證篩選的9 種差異香氣組分的判定能力。將23 個黃金茶樣本隨機分為訓練組（70%）、檢驗組（30%），以9 種差異香氣組分作為協(xié)變量，進行MLP判別。結(jié)果顯示訓練組和檢驗組的預測正確率均為100%，說明9 種差異香氣組分具有原41 種共有組分相同的預測能力。DFA顯示自身驗證和交叉驗證正確率均為100%，黃金茶一級的組質(zhì)心為5.436，黃金茶二級的組質(zhì)心為-7.067，得到分類函數(shù)系數(shù)表（表4），可以建立線性判別函數(shù)用于判定黃金茶的等級。

表4 Fisher線性判別函數(shù)系數(shù)Table 4 Coefficients of Fisher’s linear discriminant functions

3 討論與結(jié)論

以往對黃金茶的研究主要集中在育種栽培[27]、加工工藝[7]及深加工[28]等方面，而黃金茶香氣的研究較少。黃懷生等[2]用同時蒸餾萃取法富集香氣，并結(jié)合GC-MS聯(lián)用法分析了保靖黃金茶的香氣成分，發(fā)現(xiàn)相對含量最高的物質(zhì)依次為3-甲氧基-1,2-丙二醇、芳樟醇、3,7-二甲基-辛三烯-3-醇、T-杜松醇和α-杜松醇。這與本實驗的結(jié)果不完全一致，推測是由于香氣提取方法的不同導致。

有研究分別基于信陽毛尖的滋味成分指紋圖譜[18]和香氣成分指紋圖譜[8]建立了信陽毛尖分級標準樣品的研制方法[9]，這證明指紋圖譜結(jié)合化學計量學在茶葉分級工作方面有現(xiàn)實意義，可以為感官評審提供客觀依據(jù)。本實驗利用HS-SPME提取茶葉香氣組分，經(jīng)過GC-MS分離檢測，再利用AMDIS解卷積，共分離出495 種香氣組分；通過NIST譜庫和RI比對，鑒定出81 種香氣物質(zhì)；然后以41 種共有香氣組分分別建立一級和二級黃金茶的指紋圖譜；通過OPLS-DA和t檢驗篩選出9 種差異香氣組分。MLP和DFA證明9 種差異香氣組分具有與原模型相同的判定能力，達到了降維的目的，并以此建立了線性判別函數(shù)。該判別函數(shù)與指紋圖譜相似度法結(jié)合，可為黃金茶等級的判定提供客觀依據(jù)。

由于條件限制，本實驗的黃金茶樣本數(shù)較少，而且香氣只是鑒別茶葉品質(zhì)的一個參考因素，滋味成分[29]、湯色[30]、礦質(zhì)元素[31]等都代表著茶葉品質(zhì)的不同方面。所以建立更加全面的黃金茶數(shù)據(jù)庫，利用大數(shù)據(jù)預測未知樣品真?zhèn)蝃25]、產(chǎn)地[32-33]、等級[4,34]、年份[35-36]等質(zhì)量因素將會是未來的一個研究方向。