一株產(chǎn)黃色素細(xì)菌的篩選鑒定及其產(chǎn)黃色素培養(yǎng)條件優(yōu)化

尤田，嚴(yán)佳佳，彭亞彬，何灣灣，王德培，高強(qiáng)

（教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，生物工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

色素在日常生活與工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的作用[1]。天然黃色素多來源于動物、植物、礦物質(zhì)和微生物[2]；微生物黃色素則多產(chǎn)于細(xì)菌、酵母、絲狀真菌和微藻，在來源可控、性質(zhì)穩(wěn)定和易于下游加工等方面優(yōu)于植物和動物色素[1-3]。近年來已報道多種產(chǎn)黃色素的真菌、細(xì)菌（如紅曲霉菌），已發(fā)現(xiàn)的其產(chǎn)黃色素種類有44種，其中Takahashi等[4]研究的紅曲黃色素黃單胞菌素A和黃單胞菌素B混合物，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；粒毛盤菌產(chǎn)胞外脂溶性四環(huán)三萜類衍生物黃色素對多數(shù)食品添加劑的穩(wěn)定性良好[5]；海膽共生菌鞘氨醇單胞菌產(chǎn)黃色素易溶于不同極性的常見有機(jī)溶劑中，對光穩(wěn)定性好[6]；藤黃微球菌產(chǎn)黃色素具有抗氧化、抗菌、抗輻射作用[7]等。可見天然微生物來源黃色素具有生理活性與保健功能，如抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗糖尿病、抗肥胖、抗炎等作用[8]，并廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、制藥等行業(yè)中[1，9]，在國內(nèi)外市場上有著廣泛的應(yīng)用前景[10]。然而，除少數(shù)天然、半天然紅曲黃色素可大規(guī)模生產(chǎn)、銷售外，天然黃色素市場上多為植物提取類黃色素，未見其他種類微生物天然黃色素產(chǎn)品[11]。因此，篩選新的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃色素菌株以及開發(fā)、生產(chǎn)安全、廉價、優(yōu)質(zhì)的天然微生物黃色素具有廣闊的應(yīng)用前景與經(jīng)濟(jì)潛力。

本研究從蘆葦根部土壤中分離到一株產(chǎn)黃色素細(xì)菌，對細(xì)菌種屬進(jìn)行鑒定，并對其所產(chǎn)黃色素的性質(zhì)及其合成色素的培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用此菌株生產(chǎn)黃色素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母浸出粉、胰蛋白胨：英國Oxoid公司；葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖：天津北方天醫(yī)試劑公司；氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、甘油、可溶性淀粉：天津市化學(xué)試劑一廠；大豆蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白粉、豆粕粉、黃豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、尿素：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DNA聚合酶：武漢金開瑞生物工程有限公司。除特殊標(biāo)注外，其它試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基：5 g/L酵母浸出粉、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA320型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；TCL-12型臺式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司；NU-T5型紫外分光光度計(jì)：天津市華偉科技有限公司；DL-820D型超聲波振蕩器：宏富信精密科技（北京）有限公司；BX-43型光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；伯樂T100型PCR基因擴(kuò)增儀：上海皓莊儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)黃色素細(xì)菌的篩選

取1g蘆葦根部土壤加入到50 mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；取1 mL菌懸液富集培養(yǎng)，將富集菌液稀釋106倍，取100 μL稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基上[12]，培養(yǎng)一段時間后出現(xiàn)亮黃色菌落，挑取菌落分離純化3次。挑取單菌落至LB固體斜面培養(yǎng)基上，編號BX-1菌株，置于4℃冰箱備用。

1.3.2 菌株的鑒定

從斜面上挑取BX-1單菌落至滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 12 h，取 10 μL 菌液進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

取菌液稀釋并置于基因擴(kuò)增儀中98℃裂解10min，以裂解菌液為模板，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株16S rRNA基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增[13]。PCR 體系：模板1 μL、上游引物27F和下游引物1492R各1 μL、DNA 聚合酶 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性 5 min、95℃變性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸45 s并循環(huán)30次、72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物取2 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將產(chǎn)物送至金唯智公司測序。測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性對比分析以明確菌株的種屬關(guān)系，選取同源性高的16S rRNA基因，并通過MEGA7軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.3.3 黃色素提取與光譜特性分析

刮取LB固體培養(yǎng)基上的BX-1菌落0.1 g，加入甲醇溶液2 mL，在40℃水浴條件下超聲裂解15 min，8 000 r/min離心5 min，獲得黃色素提取液[15]。以甲醇為空白對照，用紫外分光光度計(jì)對甲醇黃色素提取液進(jìn)行全波段掃描。

1.3.4 固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 不同培養(yǎng)溫度對BX-1菌株產(chǎn)黃色素的影響

取2 μL BX-1活化菌液點(diǎn)種于LB固態(tài)培養(yǎng)基上，并分別放置于 37、30、28、20 ℃溫度下培養(yǎng) 240 h。因胞內(nèi)色素產(chǎn)量與其菌體量呈正相關(guān)，故以菌落直徑、菌落顏色變化和初步提取胞內(nèi)色素OD438nm值作為試驗(yàn)分析依據(jù)。每隔48 h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.4.2 不同光照條件對BX-1菌株產(chǎn)黃色素的影響

取2 μL BX-1活化菌液點(diǎn)種于LB固態(tài)培養(yǎng)基上，并分別放置于白熾燈光與黑暗無光條件下培養(yǎng)240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5 固態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.5.1 不同碳源對BX-1菌株產(chǎn)黃色素的影響

在LB固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加1%葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、甘油、可溶性淀粉，共10種不同的碳源。取2 μL BX-1活化菌液點(diǎn)種于添加不同碳源的固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5.2 不同氮源對BX-1菌株產(chǎn)黃色素的影響

在LB固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加1%酵母浸出粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、蛋白粉、豆粕粉、黃豆餅粉、花生餅粉、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、尿素，共13種不同的氮源。取2μLBX-1活化菌液點(diǎn)種于添加不同氮源的固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)240 h，每隔48h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5.3 不同初始pH值對BX-1菌株產(chǎn)黃色素的影響

用4 mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。取 2 μL BX-1 活化菌液點(diǎn)種于不同初始pH值的固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。

1.3.5.4 最適碳、氮源種類與磷元素濃度正交試驗(yàn)

根據(jù)碳、氮源單因素試驗(yàn)分別選取3種對BX-1菌株產(chǎn)黃色素影響效果最好的碳、氮源，碳源：1%可溶性淀粉、1%谷氨酸鈉、1%葡萄糖。氮源：1%酵母浸出粉、1%豆粕粉、1%牛肉膏。查閱文獻(xiàn)[16]可知磷酸二氫鉀與硫酸鎂對細(xì)菌產(chǎn)黃色素有明顯的促進(jìn)效果。故選取0.10%、0.15%、0.20%磷酸二氫鉀與3種碳源、3種氮源，使用Minitab 18正交設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，以確定最佳碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度。分別在固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，L9（33）正交試驗(yàn)分組見表2。

表1 L9（33）碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 L9（33）Orthogonal experimental design of carbon and nitrogen source types and potassium dihydrogen phosphate concentration

表2 L9（33）碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度正交試驗(yàn)分組Table 2 L9（33）Orthogonal test grouping table of carbon and nitrogen source types and potassium dihydrogen phosphate concentration

續(xù)表2 L9（33）碳、氮源種類與磷酸二氫鉀濃度正交試驗(yàn)分組Continue table 2 L9（33）Orthogonal test grouping table of carbon and nitrogen source types and potassium dihydrogen phosphate concentration

1.3.5.5 最適碳、氮源、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗(yàn)

根據(jù)1.3.5.3與1.3.5.4的試驗(yàn)結(jié)果，選取不同濃度的谷氨酸鈉、豆粕粉和硫酸鎂，與不同初始pH值，使用Minitab 18正交設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以確定最適谷氨酸鈉、豆粕粉和硫酸鎂濃度與初始pH值。分別在固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)240 h，每隔48 h觀察記錄菌落形態(tài)、大小與顏色變化，每組3個平行。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3，L9（34）正交試驗(yàn)分組見表4。

表3 L9（34）谷氨酸鈉、豆粕粉、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 L9（34）Orthogonal test grouping table of concentrations of sodium glutamate，soybean meal powder，magnesium sulfate，and initial pH value

表4 L9（34）谷氨酸鈉、豆粕粉、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗(yàn)分組Table 4 L9（34）Orthogonal experimental design of concentrations of sodium glutamate，soybean meal powder，magnesium sulfate，and initial pH value

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)置3組平行，結(jié)果取平均值，并使用Origin 9.0版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)黃色素菌株的篩選結(jié)果

對從土壤中分離獲得的亮黃色菌株以三區(qū)劃線法分離轉(zhuǎn)接純化3次，在LB培養(yǎng)基上篩選出分離純化后的亮黃色菌株，結(jié)果見圖1。

圖1 BX-1菌株Fig.1 BX-1 strain

由圖1可知，菌株編號為BX-1。在LB培養(yǎng)基上，BX-1菌落呈圓形凸起、表明光滑、邊緣整齊。BX-1菌株所產(chǎn)黃色素為胞內(nèi)色素，無向培養(yǎng)基滲透現(xiàn)象。

2.2 BX-1菌株的鑒定結(jié)果

對BX-1菌株進(jìn)行革蘭氏染色，BX-1菌株革蘭氏染色鏡檢顯微放大圖見圖2。

圖2 BX-1菌株革蘭氏染色鏡檢顯微放大圖Fig.2 Microscopic magnification of Gram staining of BX-1 strain

由圖2可知，在1 000倍顯微鏡下觀察，BX-1菌株呈短桿狀、密集堆疊排列、無芽孢，為革蘭氏陽性細(xì)菌。

對BX-1菌株16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。

圖3 BX-1菌株16S rRNA基因PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis of 16S rRNA gene of BX-1 strain

由圖3可知，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶于1 500 bp處明亮清晰。將PCR擴(kuò)增序列送至金唯智公司測序。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，選取同源性較高的16S rRNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于16S rRNA序列BX-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of BX-1 strain based on 16S rRNA sequence

由圖4可知，BX-1菌株與鹽生谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola）的親緣關(guān)系最近[17]，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分枝，確定BX-1菌株為G.halophytocola，即鹽生谷氨酸桿菌。

2.3 黃色素提取與光譜分析結(jié)果

BX-1菌體經(jīng)超聲波破碎，甲醇提取胞內(nèi)黃色素，全波段掃描提取液結(jié)果見圖5。

圖5 BX-1菌株胞內(nèi)黃色素紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of intracellular yellow pigment of BX-1 strain

由圖5可知，BX-1菌株胞內(nèi)黃色素共有3個吸收峰，分別處于411、438、467 nm，其中438 nm處吸收峰最高。

葉黃素標(biāo)品的紫外吸收光譜見圖6。

圖6 葉黃素標(biāo)品紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of lutein standard

紫外吸收光譜有助于確定色素的結(jié)構(gòu)[18]，由圖6可知，葉黃素標(biāo)品的紫外吸收光譜與BX-1菌株胞內(nèi)黃色素的光譜特性相似。推測BX-1菌株產(chǎn)胞內(nèi)黃色素可能為接近葉黃素的類胡蘿卜色素。

2.4 BX-1菌株產(chǎn)黃色素最適固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 不同培養(yǎng)溫度對BX-1產(chǎn)黃色素的影響

按1.3.4.1中的方法在不同溫度下培養(yǎng)BX-1菌株，菌落直徑測量結(jié)果見圖7。

圖7 BX-1菌株在不同培養(yǎng)溫度下的菌落直徑與產(chǎn)黃色素OD值Fig.7 Colony diameter of BX-1 strain at different culture temperatures and OD value of yellow pigment

由圖7可知，在20℃與37℃培養(yǎng)條件下，菌株生長均較為緩慢；在30℃與28℃培養(yǎng)條件下生長較快、菌苔厚實(shí)。肉眼觀察菌落顏色，可知培養(yǎng)至240 h時，只有20℃培養(yǎng)條件下菌落呈現(xiàn)亮黃色。其它溫度下，菌體生長呈現(xiàn)出部分淺黃色或乳白色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見20℃條件下培養(yǎng)的BX-1菌株產(chǎn)黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于其它溫度條件。故推測，BX-1菌株為溫敏型黃色素產(chǎn)生菌[19]，可能存在黃色素合成溫度調(diào)控元件，低溫環(huán)境時啟動相關(guān)基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄[20]。考慮試驗(yàn)條件與資源能耗的合理利用，選擇20℃作為BX-1菌株產(chǎn)黃色素的培養(yǎng)溫度。

2.4.2 不同光照條件對BX-1產(chǎn)黃色素的影響

BX-1菌株經(jīng)不同光照條件培養(yǎng)的菌落直徑與產(chǎn)黃色素OD值見圖8。

圖8 BX-1菌株經(jīng)不同光照條件培養(yǎng)的菌落直徑與產(chǎn)黃色素OD值Fig.8 Moss diameter of BX-1 strain cultured under different light conditions and OD value of yellow pigment

由圖8可知，白熾燈光與黑暗無光條件下BX-1菌株培養(yǎng)至240 h均可快速生長，白熾燈光照培養(yǎng)生長較快，黑暗條件生長較慢。肉眼觀察菌落顏色，可見白熾燈光照條件下，BX-1菌株培養(yǎng)至48 h即產(chǎn)生黃色素，至240 h菌落呈亮黃色且菌苔厚實(shí)；黑暗條件下培養(yǎng)至144 h時菌落才呈現(xiàn)黃色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，白熾燈光照培養(yǎng)的BX-1菌株產(chǎn)黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于黑暗組。

由圖8可知，光照的刺激會誘導(dǎo)BX-1菌株大量合成黃色素。光是自然界的能量來源，也是調(diào)節(jié)生命活動的重要信號，光能影響細(xì)菌的生長發(fā)育、生理周期及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[21]。Mohana等[22]研究表明生存在高輻射環(huán)境下的藤黃微球菌所產(chǎn)黃色素可吸收紫外線來保護(hù)自身。故BX-1菌株受可見光光照刺激時，合成黃色素相關(guān)代謝途徑可能會更加活躍，產(chǎn)生大量黃色素以對抗外部環(huán)境變化。

根據(jù)培養(yǎng)BX-1菌株時的菌落形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，菌株培養(yǎng)超過240 h后，菌落呈現(xiàn)老化現(xiàn)象，故統(tǒng)一培養(yǎng)觀察至240 h，以保證試驗(yàn)的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。綜上，BX-1菌株產(chǎn)黃色素最適固態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為BX-1菌株放置于20℃光照培養(yǎng)240 h。

2.5 BX-1菌株產(chǎn)黃色素最適固態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 碳源對BX-1產(chǎn)黃色素的影響

不同碳源培養(yǎng)240 h的BX-1菌株的菌落直徑測量結(jié)果見圖9。

圖9 BX-1菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑Fig.9 Bacterial moss photos of BX-1 strain cultured on different carbon sources

由圖9可知，BX-1菌株具有多種碳源適應(yīng)性，培養(yǎng)至240 h均可快速生長。其中，以可溶性淀粉作為碳源的BX-1菌株生長最快，菌落直徑最大；其次為蔗糖、葡萄糖、果糖、谷氨酸鈉；以檸檬酸鈉、乙酸鈉為碳源的BX-1菌株生長緩慢。肉眼觀察菌落顏色，可見培養(yǎng)至240h，在谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、可溶性淀粉作為碳源的培養(yǎng)基上BX-1菌落均呈現(xiàn)亮黃色且菌苔厚實(shí)；BX-1在其他7類碳源上菌落顏色較淺，呈白色或淺黃色。

因此，BX-1菌株最適產(chǎn)黃色素碳源為可溶性淀粉。BX-1菌株可產(chǎn)生淀粉酶來分解利用可溶性淀粉以促使菌落快速生長，同時在分解淀粉的代謝過程中可促使菌株積累次生代謝產(chǎn)物黃色素[23]。

2.5.2 不同氮源對BX-1產(chǎn)黃色素的影響

不同氮源培養(yǎng)的BX-1菌株，菌落直徑測量結(jié)果見圖10。

圖10 BX-1菌株在不同氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑Fig.10 BX-1 bacterial moss diameter on different nitrogen source medium

由圖10可知，BX-1菌株對多種有機(jī)氮源均可很好利用，其中以大豆蛋白胨為氮源時，BX-1菌株長勢最快，菌落直徑最大；豆粕粉、黃豆餅粉、花生餅粉等有機(jī)氮源也可促使菌株快速生長；BX-1菌株在無機(jī)氮源尿素、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨中生長最緩慢。肉眼觀察菌落顏色，可見培養(yǎng)至240 h時，以牛肉膏、酵母浸出粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨、豆粕粉、黃豆餅粉為氮源時，BX-1菌落呈現(xiàn)亮黃色且菌苔厚實(shí)；在其他氮源上，BX-1菌落則呈現(xiàn)白色、乳白色或淺黃色。

BX-1菌株利用天然有機(jī)蛋白質(zhì)作為氮源可積累大量黃色素，能夠利用無機(jī)氮源生長但產(chǎn)黃色素量較低。可見其黃色素積累可能受天然有機(jī)蛋白質(zhì)中某些氨基酸分子或小肽的誘導(dǎo)，促使胞內(nèi)黃色素的快速代謝合成[24]。大豆蛋白胨可以促使菌株快速生長但不誘導(dǎo)菌株產(chǎn)黃色素，所以初步選擇豆粕粉作為氮源。

2.5.3 初始pH值對BX-1產(chǎn)黃色素的影響

不同初始pH值培養(yǎng)基上培養(yǎng)的BX-1菌落直徑測量結(jié)果見圖11。

圖11 BX-1菌株在不同初始pH值培養(yǎng)條件下的菌落直徑Fig.11 BX-1 bacterial moss diameter under different initial pH conditions

由圖11可知，BX-1菌株在pH6.0～11.0范圍內(nèi)均可快速生長。在初始pH值為6.0時，BX-1菌株生長最快，菌落直徑最大；在初始pH值為6.5～8.5時，菌落直徑相近無明顯差異。在初始pH值大于10.0或小于6.0時，BX-1菌株生長緩慢，菌落直徑較小。肉眼觀察菌落顏色，可見培養(yǎng)至240 h時，在不同初始pH值下BX-1菌落均呈現(xiàn)不同程度的黃色。初始pH值為6.0～8.5與10.0時菌落呈亮黃色，其他初始pH值下菌落顏色較淺。

由此可知，BX-1菌株在pH6.0～10.0范圍內(nèi)均可產(chǎn)黃色素。說明BX-1菌株有著極廣泛的酸堿適應(yīng)性，在偏酸環(huán)境下更有利于菌株的生長，但在中性偏堿環(huán)境下更有利于菌株合成積累黃色素。綜合菌株生長與產(chǎn)黃色素兩個因素，初步選擇pH6.0作為最適初始pH值。

2.5.4 最適碳、氮源種類與磷元素濃度正交試驗(yàn)結(jié)果

為研究不同碳、氮源交互作用對BX-1菌株產(chǎn)黃色素的影響，分別選擇對BX-1菌株產(chǎn)黃色素較好的3種不同碳源、氮源，并與不同濃度磷酸二氫鉀進(jìn)行正交試驗(yàn)。BX-1菌落直徑測量結(jié)果見圖12。

圖12 BX-1菌株L9（33）正交試驗(yàn)菌落直徑Fig.12 Colony diameter of BX-1 strain L9（33）in orthogonal experiment

由圖12可知，9組正交試驗(yàn)BX-1菌株菌落直徑均高于對照組（0組，LB培養(yǎng)基），說明正交試驗(yàn)添加的碳、氮源與磷酸二氫鉀可以有效促使BX-1菌株積累黃色素。其中，以第5組最佳，即1%谷氨酸鈉、1%豆粕粉、0.2%磷酸二氫鉀，菌落直徑明顯高于其他組。肉眼觀察菌落顏色，可見培養(yǎng)至240 h，1～6組試驗(yàn)組與對照組BX-1菌落均呈亮黃色，菌苔厚實(shí)致密。7、8、9組中BX-1菌落則呈現(xiàn)部分淺黃色。

正交試驗(yàn)分析結(jié)果見圖13。

圖13 BX-1菌株L9（33）正交試驗(yàn)分析結(jié)果Fig.13 Results of orthogonal experiment of BX-1 strain L9（33）

由圖13可知，均值主效應(yīng)圖中縱坐標(biāo)均值的均值數(shù)據(jù)分析顯示，B氮源最高點(diǎn)B2與最低點(diǎn)B3差值最大，C磷酸二氫鉀最高點(diǎn)C3與最低點(diǎn)C1差值最小，所以氮源對BX-1菌株的生長影響最為明顯，碳源次之，磷酸二氫鉀影響最小；圖13分析預(yù)測可促使BX-1菌株生長產(chǎn)黃色素的最佳點(diǎn)分別是A2谷氨酸鈉、B2豆粕粉、C30.20%磷酸二氫鉀，所以正交試驗(yàn)結(jié)果分析的最適組合為碳源谷氨酸鈉、氮源豆粕粉、0.20%磷酸二氫鉀，與正交試驗(yàn)組中的最佳組合（第5組）一致。由圖13可知，磷酸二氫鉀濃度增加對BX-1菌株產(chǎn)黃色素呈正向促進(jìn)作用，且圖中沒有出現(xiàn)拐點(diǎn)，需增設(shè)磷酸二氫鉀濃度單因素試驗(yàn)以找出最適值。

增設(shè)磷酸二氫鉀0.20%～0.35%濃度，觀察其對BX-1菌株生長和產(chǎn)黃色素的影響，結(jié)果見圖14。

圖14 BX-1菌株在不同磷酸二氫鉀濃度下培養(yǎng)的菌落直徑與產(chǎn)黃色素量OD值Fig.14 Moss diameter of BX-1 strain cultured under different potassium dihydrogen phosphate concentrations and OD values of yellow pigment

由圖14可知，磷酸二氫鉀濃度為0.25%～0.30%時，BX-1菌落直徑大小相近，均大于另外2組。肉眼觀察菌落顏色，可見0.20%～0.35%濃度的磷酸二氫鉀培養(yǎng)至240 h的BX-1菌落均厚實(shí)且呈亮黃色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見0.25%磷酸二氫鉀濃度組的BX-1菌株所產(chǎn)黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于其他組。

由此得出，BX-1菌株最適培養(yǎng)基組成為1%谷氨酸鈉、1%豆粕粉、0.25%磷酸二氫鉀。相比于可溶性淀粉與葡萄糖，谷氨酸鈉可以直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)，更有利于被BX-1菌株吸收利用，為菌株生長與合成黃色素提供能量；豆粕粉來源廣泛、價格便宜且富含各類營養(yǎng)物質(zhì)，尤其含有多種氨基酸與小分子多肽類物質(zhì)，易于吸收利用，可以使菌株快速合成并積累黃色素；磷是輔酶、輔基、腺嘌呤核苷三磷酸等物質(zhì)的組成成分，能調(diào)節(jié)代謝流向與次級代謝產(chǎn)物的合成，在合適的濃度下能促使BX-1菌株高產(chǎn)黃色素[25]。

2.5.5 最適碳、氮源、硫酸鎂濃度與初始pH值正交試驗(yàn)結(jié)果

在不同谷氨酸鈉、豆粕粉、硫酸鎂濃度和不同初始pH值正交組合下培養(yǎng)的BX-1菌落直徑測量結(jié)果見圖15。

圖15 BX-1菌株L9（34）正交試驗(yàn)菌落直徑Fig.15 Coat diameter of BX-1 strain L9（34）in orthogonal experiments

由圖15可知，第4組a2b1c2d3組合，即谷氨酸鈉3%、豆粕粉3%、硫酸鎂0.05%、初始pH值6.0條件下所培養(yǎng)的BX-1菌落直徑最大，明顯高于其他組合。肉眼觀察菌落顏色，可見9組BX-1菌株培養(yǎng)至240 h均呈現(xiàn)亮黃色。

正交試驗(yàn)分析結(jié)果見圖16。

圖16 BX-1菌株L9（34）正交試驗(yàn)分析結(jié)果Fig.16 BX-1 strain L9（34）orthogonal experimental analysis results

由圖16可知，均值主效應(yīng)圖中縱坐標(biāo)均值的均值數(shù)據(jù)分析顯示，a谷氨酸鈉濃度最高點(diǎn)a2與最低點(diǎn)a1差值最大，c硫酸鎂濃度最高點(diǎn)c1與最低點(diǎn)c3差值最小，所以谷氨酸鈉濃度對BX-1菌株的生長影響最大，豆粕粉濃度與初始pH值次之，硫酸鎂濃度對BX-1菌株生長影響程度最??；圖16分析預(yù)測可促使BX-1菌株生長產(chǎn)黃色素最佳點(diǎn)分別是a2谷氨酸鈉3%、b1豆粕粉3%、c1硫酸鎂0.1%、d2初始pH值7.0，所以正交試驗(yàn)分析結(jié)果最佳組合為3%谷氨酸鈉、3%豆粕粉、0.1%硫酸鎂、初始pH7.0，即a2b1c1d2組合。與正交試驗(yàn)中的最佳組第4組a2b1c2d3組合存在差異，需試驗(yàn)驗(yàn)證以篩選最優(yōu)組合。均值主效應(yīng)圖中未出現(xiàn)豆粕粉濃度的拐點(diǎn)，無法確定最適豆粕粉濃度，需補(bǔ)做試驗(yàn)加以確定。

BX-1菌株L9（34）正交驗(yàn)證試驗(yàn)菌落直徑與產(chǎn)黃色素量OD值見圖17。

圖17 BX-1菌株L9（34）正交驗(yàn)證試驗(yàn)菌落直徑與產(chǎn)黃色素量OD值Fig.17 BX-1 strain L9（34）orthogonal validation test moss diameter and OD value of yellow pigment

由圖17可知，不同組合驗(yàn)證試驗(yàn)所培養(yǎng)的BX-1菌落直徑相近。肉眼觀察菌落顏色無差別，兩組菌株培養(yǎng)至240 h均呈現(xiàn)亮黃色。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見正交試驗(yàn)分析所得a2b1c1d2組合產(chǎn)黃色素在438 nm處OD值明顯高于正交試驗(yàn)組中的第4組a2b1c2d3組合。a2b1c1d2組合相較于a2b1c2d3組合硫酸鎂濃度更高，初始pH值7.0為中性。研究表明中性偏堿環(huán)境更適于多數(shù)細(xì)菌的生長代謝，偏酸環(huán)境會對細(xì)菌生長有抑制作用；鎂離子能調(diào)控信號傳遞、參與蛋白質(zhì)的合成，是細(xì)菌新陳代謝過程中必不可少的微量元素[17]。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1%硫酸鎂與中性初始pH值組合更能促使BX-1菌株大量合成黃色素。

BX-1菌株在不同豆粕粉濃度下培養(yǎng)的菌落直徑與菌株產(chǎn)黃色素量OD值見圖18。

圖18 BX-1菌株在不同豆粕粉濃度下培養(yǎng)的菌落直徑與菌株產(chǎn)黃色素量OD值Fig.18 Moss diameter of BX-1 strain cultured in different soybean meal concentrations and OD value of yellow pigment

由圖18可知，在1%～3%濃度范圍內(nèi)，豆粕粉濃度增加對BX-1菌株產(chǎn)黃色素呈正向促進(jìn)作用，推測最適豆粕粉濃度應(yīng)大于等于3%，故分別以2%、3%、4%、5%濃度豆粕粉培養(yǎng)BX-1菌株。如圖18所示，當(dāng)豆粕粉濃度為3%時，BX-1菌落直徑最大，明顯高于其它組。肉眼觀察菌落顏色，菌苔均呈現(xiàn)亮黃色無明顯差別。在相同條件下提取不同菌落的黃色素，可見3%豆粕粉濃度的BX-1菌株所產(chǎn)黃色素在438 nm處OD值最高，明顯高于其它濃度。

由此可見，最適碳氮、源、硫酸鎂濃度與最適初始pH值正交試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果為3%谷氨酸鈉、3%豆粕粉、0.1%硫酸鎂、最適初始pH7.0。

3 結(jié)論

本研究以一株從蘆葦根部鹽堿地土壤中分離篩選出的產(chǎn)黃色素菌株BX-1為研究對象，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)優(yōu)化培養(yǎng)基，通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)BX-1菌落呈圓形凸起、表明光滑、邊緣整齊、亮黃色、產(chǎn)胞內(nèi)黃色素。經(jīng)由革蘭氏染色鏡檢與分子生物學(xué)方法鑒定出BX-1菌株為不產(chǎn)芽孢的短桿狀革蘭氏陽性細(xì)菌，鹽生谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola）。對BX-1菌株胞內(nèi)黃色素進(jìn)行提取，可知該黃色素易溶于甲醇，為脂溶性色素，紫外光譜掃描顯示其在411、438、467 nm 3處有吸收峰，438 nm處吸收峰最高，與葉黃素光譜特性相似，推測BX-1黃色素可能為接近葉黃素的類胡蘿卜素，其提取純化產(chǎn)物及分子結(jié)構(gòu)還需大量試驗(yàn)分析驗(yàn)證。培養(yǎng)溫度與光照條件的單因素試驗(yàn)表明，BX-1菌株最適生長溫度為30℃，合適產(chǎn)黃色素溫度為20℃，即BX-1菌株為溫敏型黃色素產(chǎn)生菌，產(chǎn)黃色素需低溫誘導(dǎo)以開啟相關(guān)調(diào)控元件，同時也需要外部光照刺激菌株大量合成黃色素，故BX-1菌株最適固態(tài)培養(yǎng)條件為20℃光照培養(yǎng)240 h。設(shè)計(jì)碳、氮源、初始pH值、無機(jī)鹽的單因素與正交試驗(yàn)，通過記錄分析菌株在不同條件下的菌落生長直徑、肉眼觀察菌落顏色變化以及測量比較不同條件生長BX-1菌株產(chǎn)黃色素在438 nm處OD值，得出最適BX-1菌株生長與合成黃色素的固態(tài)培養(yǎng)基組成為3%谷氨酸鈉、3%豆粕粉、0.5%酵母浸出粉、1%氯化鈉、0.25%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂、初始pH7.0。上述研究結(jié)果鑒定了BX-1菌株的種屬，初步確定了促使BX-1菌株產(chǎn)黃色素的培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基組成以及BX-1黃色素的部分性質(zhì)，為BX-1菌株產(chǎn)黃色素的進(jìn)一步開發(fā)利用以及BX-1黃色素結(jié)構(gòu)的研究分析提供參考。