基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化黑木耳紅棗發(fā)酵乳及其抗氧化分析

張劍林，張亮亮，姜露熙，裴龍英，王寒博，孫博，梁睿武，房丹丹

（新疆理工學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿克蘇 843100）

發(fā)酵乳是以鮮牛乳或乳制品為主要發(fā)酵原料，經(jīng)一定時間及溫度發(fā)酵而成的乳產(chǎn)品，其風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富[1]。發(fā)酵乳中含有大量益生菌，能夠有效地阻止有害細菌的繁殖，以此降低人體腸道內(nèi)有害細菌及有毒物質(zhì)含量，起到調(diào)節(jié)人體腸道菌群及增強人體自身免疫力的作用[2]。黑木耳作為食用菌，將其作為調(diào)味品加入乳品、飲料中等，可提升產(chǎn)品營養(yǎng)價值與抗氧化特性，并伴有更多的味覺感受[3-5]。紅棗作為鼠李科棗屬植物，富含有機酸、多糖、環(huán)磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）等活性物質(zhì)，具有補氣血、健脾益胃的功效[6-8]。黑木耳與紅棗相結(jié)合，能促進總抗氧化能力系數(shù)的提高[9]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在發(fā)酵乳研究中未見報道。因此，黑木耳紅棗發(fā)酵乳通過乳酸菌發(fā)酵，結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化能夠簡單且快速地獲得模型最佳值，以此制成一款新型高附加值且獨特風(fēng)味的發(fā)酵乳飲料[10-11]。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通過調(diào)整輸入層、輸出層、隱含層中有關(guān)聯(lián)的相關(guān)神經(jīng)元所對應(yīng)的閾值，反映相互之間的非線性關(guān)系[12-15]。由于發(fā)酵乳產(chǎn)品成分及工藝的多元性，且發(fā)酵工藝參數(shù)與產(chǎn)品各屬性指標(biāo)間的關(guān)系大多是非線性的，因而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠較好適用于發(fā)酵乳產(chǎn)品屬性的模擬。因此，本研究以酸度為衡量指標(biāo)，研究多因素條件作用下的黑木耳紅棗發(fā)酵乳工藝條件，應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立并擬合發(fā)酵乳工藝，通過模型建立篩選、驗證最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，以期為發(fā)酵乳的高附加利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗：新疆阿克蘇市溫宿縣；鮮牛乳：新疆天潤生物科技股份有限公司；黑木耳、M30乳桿菌：新疆理工學(xué)院實驗3號樓502實驗室；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）試劑：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：北京化工廠；硫酸亞鐵：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；過氧化氫：開原化學(xué)試劑一廠；水楊酸：天津市華東試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BPH-9402精密恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV759紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；LDZM-80L立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；JMS-50膠體磨：廊坊市冠通機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

紅棗汁、黑木耳粉、牛乳→復(fù)配→黑木耳紅棗乳→膠體磨處理→巴氏殺菌→接菌發(fā)酵→黑木耳紅棗發(fā)酵乳

1.3.2 黑木耳紅棗汁的制備

選擇新鮮、無機械損傷及蟲蛀、色澤光亮的當(dāng)年季灰棗。將紅棗于溫水中加一定量蔗糖洗去表面灰塵，再用水清洗1遍，瀝干后去核，切成小碎塊[16]。添加3倍水煮沸30 min后過濾備用，將粉碎過80目篩的黑木耳粉加4倍紅棗汁過濾后制成黑木耳紅棗汁。

1.3.3 發(fā)酵

將M30乳桿菌固體培養(yǎng)基從冰箱取出，在MRS肉湯培養(yǎng)基中接入挑取的單菌落，37℃培養(yǎng)48 h，經(jīng)過多次活化使總活菌數(shù)為2.7×107CFU/mL，留作接種液備用。黑木耳紅棗乳殺菌后，接入M30乳桿菌，設(shè)定不同恒溫溫度后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間，測定發(fā)酵液酸度及相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.4 單因素試驗

以酸度、活菌數(shù)、蛋白質(zhì)含量作為評價指標(biāo)，分別考察接種量（2.5%、4.5%、6.5%、8.5%、10.5%）、發(fā)酵時間（24、30、36、42、48h）、發(fā)酵溫度（30、33、36、39、42℃）、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比（3∶1、2∶1、3 ∶2、1∶1、1∶2）對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響。

1.3.5 黑木耳紅棗發(fā)酵乳工藝參數(shù)優(yōu)化

選用酸度作為黑木耳紅棗發(fā)酵乳的考察指標(biāo)，選擇接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比作為黑木耳紅棗發(fā)酵乳工藝影響因素進行優(yōu)化試驗，各參數(shù)水平如表1所示。

表1 黑木耳紅棗發(fā)酵乳因素與水平Table 1 Coding table of factors and levels of the fermented milk of black fungus and red jujube

1.3.6 遺傳算法尋優(yōu)設(shè)計

通過遺傳算子，選擇、交叉、變異，采取MATLAB遺傳算法工具箱進行遺傳算法以進行全局多點尋優(yōu)[17]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬運算對黑木耳紅棗發(fā)酵乳過程中的4個因素（接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比）在各自加入量范圍內(nèi)采取人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬運算，以此模型的輸出值構(gòu)建個體適應(yīng)度函數(shù)進行整體尋優(yōu)。酸度值的浮動變化對個體適應(yīng)度值的影響較大。通過實際情況進行初始種群數(shù)、變異概率、交叉概率和進化代數(shù)的選取，相關(guān)參數(shù)的設(shè)定根據(jù)實際而定[18-19]。黑木耳紅棗發(fā)酵乳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型示意圖見圖1。

圖1 黑木耳紅棗發(fā)酵乳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of neural network model of the fermented milk of black fungus and red jujube

1.3.7 抗氧化能力測定

參照文獻[20-21]的方法對DPPH·清除率、羥基自由基清除率進行測定。

1.3.8 活菌數(shù)和酸度的測定

參考文獻[22-23]對活菌數(shù)和酸度進行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Origin 2018對單因素圖表進行繪制，通過Design-Expert 8.0設(shè)計27組試驗，且每一組做3次平行試驗，采用Matlab 2017b進行模型構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素條件對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響

接種量對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響見圖2。

圖2 接種量對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖2可知，當(dāng)其它條件不變時，從總體上看酸度變化趨勢呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，活菌數(shù)無明顯變化，蛋白質(zhì)含量略有起伏，其現(xiàn)象原因可能是M30乳桿菌接種量的多少與反應(yīng)環(huán)境中菌體生長相關(guān)性較大，當(dāng)發(fā)酵乳的接種量大于6.5%時，發(fā)酵乳所能利用的活菌數(shù)是有限的，致使酸度幾乎無明顯增長。因此，選擇最適接種量為6.5%。

發(fā)酵時間對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，酸度變化呈先上升后趨于平緩的趨勢，可能是由于M30乳桿菌的接入使菌體大量生長繁殖促使酸度增大，當(dāng)發(fā)酵至36 h時，M30乳桿菌的生長消耗了大量的碳源使乳酸菌的生長受到阻礙，導(dǎo)致活菌數(shù)變化減少。因此，選擇最適發(fā)酵時間為36 h。

發(fā)酵溫度對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度高于39℃時，酸度浮動變化減緩，原因可能是M30乳桿菌的生長對較高溫度的耐受性較低，不利于其生長，從而會影響產(chǎn)酸特性。故選擇最適發(fā)酵溫度為39℃。

黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響見圖5。

圖5 黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比對黑木耳紅棗發(fā)酵乳的影響Fig.5 Effect of the ratio of black fungus and red jujube juice to fresh milk on the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖5可知，黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比對酸度影響較為明顯，當(dāng)黑木耳紅棗汁的占比減少時，酸度呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，而活菌數(shù)總體呈小幅上升的趨勢，可能是牛乳中的營養(yǎng)物質(zhì)更有利于M30乳桿菌的生長。因此，選擇最適黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比為3∶2。

2.2 酸度試驗結(jié)果

各參數(shù)下黑木耳紅棗發(fā)酵乳酸度如表2所示。共計29組試驗，每組做3組平行，用于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建。

表2 不同參數(shù)下黑木耳紅棗發(fā)酵乳的酸度Table 2 Acidity of the fermented milk of black fungus and red jujube under different parameters

2.3 誤差反傳（error back proragation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

2.3.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型參數(shù)

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練及構(gòu)建使用Matlab 2017b軟件完成。通過工具箱對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的每一過程的迭代次數(shù)中訓(xùn)練數(shù)據(jù)集采取70%、15%、15%隨機歸類為訓(xùn)練部分、驗證部分和測試部分進行迭代訓(xùn)練[24-25]。通過建模選擇隱藏神經(jīng)元個數(shù)為10，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建較好。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和期望值之間的誤差采用均方誤差（mean-square error，MSE）函數(shù)表示，公式如下。

黑木耳紅棗發(fā)酵乳的研究中，通過每組試驗的實際值及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出的預(yù)測值，來評價酸度在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測中準(zhǔn)確度，若模型預(yù)測性能越好，則期望值和預(yù)測值越接近。

2.3.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建的均方誤差評估

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建的準(zhǔn)確性建立在MSE評估的基礎(chǔ)上。MSE值越小，所建立的模型越成功，試驗數(shù)據(jù)所表現(xiàn)出的精確度越高[26-27]。黑木耳紅棗發(fā)酵乳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的MSE值見圖6。

圖6 黑木耳紅棗發(fā)酵乳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的MSE值Fig.6 MSE value of the fermented milk of black fungus and red jujube with neural network model

式中：n為參與評價的樣本個數(shù)；yi為第i個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值為該輸出值對應(yīng)的期望值。

如圖6所示，隨著訓(xùn)練步數(shù)的增加，MSE誤差逐漸趨近于最佳值，對應(yīng)誤差為0.041 569，同時驗證誤差也趨于最佳值，當(dāng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型迭代至第7次時，訓(xùn)練結(jié)果趨于平穩(wěn)，說明該模型達到擬合要求[28-29]，可用于黑木耳紅棗發(fā)酵乳工藝擬合研究。

2.3.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)系數(shù)的評估

黑木耳紅棗發(fā)酵乳模型構(gòu)建的相關(guān)系數(shù)指標(biāo)見圖7。

圖7 黑木耳紅棗發(fā)酵乳模型構(gòu)建的相關(guān)系數(shù)指標(biāo)Fig.7 Correlation coefficient index for model construction of the fermented milk of black fungus and red jujube

如圖7所示，通過統(tǒng)計訓(xùn)練、驗證、測試及所有數(shù)據(jù)的目標(biāo)值和輸出值，并計算出相關(guān)系數(shù)[30-31]。各組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)R、目標(biāo)值及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的輸出值呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，進一步確定了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建的成功。

2.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型性能測試

通過對所構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型選擇收集的9組試驗數(shù)據(jù)進行預(yù)測值與實際值隨機驗證[32-33]。以試驗測得的實際酸度與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的值進行比較，結(jié)果見圖8。

圖8 構(gòu)建黑木耳紅棗發(fā)酵乳模型性能的驗證Fig.8 Validation of the model of the fermented milk of black fungus and red jujube

由圖8可知，試驗測定獲取的酸度與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測值具有變化一致的趨勢。因此，進一步說明通過此方式構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所輸出的預(yù)測值具有較高可行性。

2.5 遺傳算法尋優(yōu)

黑木耳紅棗發(fā)酵乳遺傳算法的尋優(yōu)結(jié)果見圖9。

圖9 黑木耳紅棗發(fā)酵乳遺傳算法的尋優(yōu)結(jié)果Fig.9 Optimal results of genetic algorithm for the fermented milk with black fungus and red jujube

由圖9所示，通過采用Matlab 2017b軟件對黑木耳紅棗發(fā)酵乳進行工藝尋優(yōu)，當(dāng)遺傳運算迭代至127次時，模型所對應(yīng)的酸度預(yù)測值與實際值擬合度最佳，此時試驗因素（黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量）編碼分別為1.428、38.800、36.600、0.067，所對應(yīng)黑木耳紅棗發(fā)酵乳酸度理論值為75.12°T，與實際所測值無明顯差異，該模型工藝優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確。

2.6 抗氧化結(jié)果分析

不同濃度黑木耳紅棗發(fā)酵乳與未發(fā)酵組抗氧化性能的對比見圖10。

圖10 不同濃度黑木耳紅棗發(fā)酵乳與未發(fā)酵組抗氧化性能的對比Fig.10 Comparison of antioxidant properties of the fermented milk of black fungus and red jujube and unfermented milk with different concentrations

如圖10所示，黑木耳紅棗發(fā)酵乳未發(fā)酵組、發(fā)酵組的DPPH自由基、羥基自由基清除率隨樣液體積濃度的變化均呈先增長后趨于平穩(wěn)的趨勢。對于黑木耳紅棗發(fā)酵乳發(fā)酵組而言，經(jīng)過不同梯度的處理后，當(dāng)樣液體積濃度分別為0.6、0.8 mL/mL時，黑木耳紅棗發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率分別為81.30%、73.42%，均達到較高的清除效果，較發(fā)酵前分別提高了12.04%、13.52%，其發(fā)酵前后差異明顯，在發(fā)酵過程中，抗氧化性有所增強，其可能原因是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中使游離態(tài)酚類物質(zhì)的占比增加[34]，進一步增強黑木耳紅棗發(fā)酵乳抗氧化性。

3 結(jié)論

本試驗以黑木耳粉、紅棗汁、鮮牛乳為原料，通過乳酸菌發(fā)酵制成黑木耳紅棗發(fā)酵乳，采用DPPH自由基、羥基自由基清除率評價發(fā)酵制品的抗氧化能力。根據(jù)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比、接種量4個影響因子為單因素試驗，結(jié)合Box-Behnken試驗的因素水平和響應(yīng)值，將黑木耳紅棗發(fā)酵乳的4個因素及對應(yīng)酸度通過Matlab 2017b軟件構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合其之間的非線性關(guān)系，模型預(yù)測性和準(zhǔn)確性較高，能夠反映發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比、接種量與酸度之間的關(guān)系，通過與遺傳尋優(yōu)相結(jié)合，確定黑木耳紅棗發(fā)酵乳的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度38.8℃、發(fā)酵時間36.6 h、接種量6.70%、黑木耳紅棗汁與鮮牛乳體積比為3∶2.1，對應(yīng)最佳酸度為75.12°T。在此條件下，黑木耳紅棗發(fā)酵乳DPPH自由基、羥基自由基清除率分別為81.30%、73.42%，較發(fā)酵前分別提高了12.04%、13.52%，試驗結(jié)果為黑木耳紅棗發(fā)酵乳的綜合開發(fā)利用提供參考。