超聲波輔助pH偏移處理對豬肝蛋白結(jié)構(gòu)及乳化特性的影響

陸今明，彭松林，楊凱麟，耿宏慶，尚永彪，2*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶 400715）

豬肉是全球消費最多的肉類產(chǎn)品，與此同時豬肝、豬肺等副產(chǎn)品產(chǎn)量也隨之增加。豬肝中蛋白質(zhì)含量高達20%且富含必需氨基酸，營養(yǎng)價值高。但因豬肝具有特殊的腥味且嘌呤和膽固醇含量較高，因此，在實際工業(yè)生產(chǎn)中豬肝通常會被加工成飼料，在食品工業(yè)中也僅有少量被加工成豬肝糜和豬肝香腸等產(chǎn)品，這影響了豬肝的開發(fā)利用，其價值難以得到充分的體現(xiàn)。豬肝蛋白（porcine liver protein，PLP）是豬肝的主要成分，豬肝蛋白資源的有效利用是豬肝資源開發(fā)的關(guān)鍵。然而，有研究報道從肝臟中分離的蛋白功能特性較差[1]，蛋白質(zhì)的加工過程通常需要熱力干燥，因此會進一步降低其功能特性，阻礙了其在食品中的應(yīng)用。

為擴大天然食品中蛋白質(zhì)的應(yīng)用，通常會采用物理、化學(xué)和生物方法改善蛋白功能特性。其中，超聲波被認為是改變液體介質(zhì)中食品成分性質(zhì)的一種非熱處理加工技術(shù)，超聲過程中產(chǎn)生的空化作用會改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，空化和湍流的結(jié)合能減小蛋白的粒徑，且與傳統(tǒng)的熱處理相比，超聲對加工食品的營養(yǎng)和感官影響更小。丁景[2]研究超聲波對水溶性豬肝蛋白乳化特性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著超聲波功率升高和時間延長，水溶性豬肝蛋白的乳化活性及其穩(wěn)定性均表現(xiàn)先增加后減小趨勢。除物理處理外，pH偏移處理也能改變蛋白的結(jié)構(gòu)及功能特性。pH偏移處理是將蛋白質(zhì)暴露在堿性或酸性條件下一段時間使蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，然后調(diào)節(jié)pH值至中性，使蛋白質(zhì)發(fā)生重折疊，重新折疊的蛋白質(zhì)往往不能恢復(fù)到原本構(gòu)象，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的變化。pH偏移處理是一種通過改變電荷的方式來調(diào)控蛋白分子間及分子內(nèi)靜電排斥作用力，從而使蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的化學(xué)修飾方法。pH偏移技術(shù)對蛋白的營養(yǎng)價值破壞較小，過程操作簡單，參數(shù)易于控制。目前pH偏移處理技術(shù)的研究多用于植物蛋白改性領(lǐng)域[3]，在動物內(nèi)臟蛋白質(zhì)改性中的應(yīng)用研究相對較少。Lu等[4]研究肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）在 pH11-7、pH11.5-7和 pH12-7堿性 pH 偏移條件的界面流變性能，結(jié)果表明與未處理MP相比，重折疊MP的分子變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)向O/W界面的吸附速度加快，被吸附的蛋白分子間相互作用增強，界面膜的彈性提高，表明堿性pH偏移調(diào)控界面行為可能是一種適用于食品工業(yè)中肉蛋白乳劑的開發(fā)方法。Lu等[1]研究不同pH值條件下琥珀?；u肝蛋白（chicken liver protein，CLP）結(jié)構(gòu)與乳化特性之間的關(guān)系，結(jié)果表明隨著pH值的升高，CLP的溶解度和吸油能力增加，有利于其乳化性能的改善。

本研究將超聲波改性處理與pH偏移改性處理相結(jié)合，測定改性PLP的溶解度、表面疏水性、乳化特性、巰基含量、粒徑、Zeta電位、一級和三級結(jié)構(gòu)等指標及其變化情況，為豬肝資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮豬肝：市售；透析袋（分子截留量8 000 Da～14 000 Da）：北京怡美妙科技有限公司；一級玉米油：山東三星玉米科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 試劑

無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、5，5'-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）、考馬斯亮藍R-250：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、甲醇、無水乙醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸、酒石酸鉀鈉、冰醋酸：寧波大川精細化工有限公司；五水硫酸銅：廣東光華科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨：上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、牛血清蛋白：德國Biofroxx公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；JS39D-250多功能食品加工機：浙江蘇泊爾股份有限公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機、SCIENTZ-1500F超聲波分散儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；EMS-20磁力攪拌水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；PowerPacTM Basic小型垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司；LGJ-10真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；PHS-4C+酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；F-2500熒光分光光度計：日本日立公司；BX53熒光正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬肝蛋白的提取

參照Steen等[5]的方法并稍作修改。用絞肉機將豬肝打成豬肝泥，隨后加入3倍體積的由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配制而成的緩沖溶液（0.05 mol/L、pH7.4），用勻漿機以10 000 r/min勻漿1.5 min；將勻漿物離心20 min（9 000 r/min、4℃）后過 4層紗布收集濾液，所得沉淀用絞肉機攪碎后繼續(xù)加入緩沖溶液，重復(fù)上述操作2次，將3次所得的濾液合并后用透析袋透析脫鹽48 h（4 h換水1次），冷凍干燥60 h即為豬肝蛋白，通過凱氏定氮法測定蛋白含量（N以6.25計算）為（87.67±0.80）g/100 g，用密封袋將PLP封好后置于-18℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 豬肝蛋白濃度的測定

參考Cui等[6]的試驗方法，使用雙縮脲試劑測定PLP溶液蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 樣品處理

用超純水配制10 mg/mL PLP溶液，冰水浴磁力攪拌30 min使其充分溶解。

pH偏移處理：用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH分別將PLP溶液的pH值調(diào)節(jié)至3和9，在冰水浴磁力攪拌下處理30 min，然后用相應(yīng)的堿或酸將pH3和pH9的蛋白溶液pH值調(diào)至7，冰水浴磁力攪拌下平衡15 min，將處理樣品記為pH3-7和pH9-7。

超聲波處理：將蛋白溶液進行超聲波處理，超聲波頻率為20 kHz，變幅桿直徑15 mm，超聲功率300 W，超聲程序為工作3 s，停止3 s，處理總時長5 min。超聲波處理過程中對樣品進行冰浴降溫處理，處理完畢后蛋白樣品溫度均在30℃以下，記為U。

超聲波輔助pH偏移處理：將蛋白溶液pH值調(diào)整為3和9后進行超聲波處理，隨后用相應(yīng)的堿或酸將溶液pH值調(diào)至7。冰水浴磁力攪拌下平衡15 min，記為pH3U-7和pH9U-7。

對照：蛋白溶液pH值調(diào)整為7后，在冰水浴磁力攪拌30 min。

所有處理完畢的蛋白樣品用塑封膜封口，置于4℃冰箱保存，72 h內(nèi)使用。

1.3.4 蛋白溶解度的測定

參考Agyare等[7]的方法。將處理過的PLP溶液用超純水稀釋成2.5 mg/mL，冷凍離心15 min（5 500 r/min、4℃），取上清液，用雙縮脲法測定PLP溶解度。將離心前溶液中蛋白的濃度和離心后上清液蛋白的濃度（mg/mL）分別命名為C0和C1，蛋白溶解度計算公式如下。

1.3.5 表面疏水性的測定

參考 Yu 等[8]方法，采用 8-苯氨-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法測定PLP的表面疏水性并稍作修改。將PLP溶液濃度調(diào)至0.25 mg/mL，于4.0 mL蛋白溶液中加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液，避光振蕩均勻15 min后，用熒光光度計測定其熒光強度。設(shè)定激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長400 nm～600 nm，兩種狹縫寬度均為5 nm，電壓為400 mV。

1.3.6 乳化活性指數(shù)的測定

參考Pearce等[9]和Agyare等[7]的方法并稍作修改。配制2.5 mg/mL蛋白溶液，取2.0 mL大豆油和6.0 mL蛋白溶液于塑料離心管中，10 000 r/min勻漿30 s后立即從離心管底部吸取50 μL乳液，加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，混合均勻后用紫外可見分光光度計在500 nm處測定其吸光度，記作A0。以50 μL超純水加入5 mL 0.1%SDS溶液作為空白對照。PLP乳化活性指數(shù)（emulsifying activity，EAI）計算公式如下。

式中：ρ為油相體積分數(shù)（油的體積/乳化體系的體積）；φ為蛋白質(zhì)濃度，0.0025g/mL；A0為乳化液在0 min時的吸光度；稀釋倍數(shù)為101。

1.3.7 乳液穩(wěn)定性的測定

參考Lu等[1]的方法并稍作修改，使用紫外分光光度計于500 nm處測定30 min乳液的濁度（A500）值，以此來表示乳液的乳化穩(wěn)定性。

1.3.8 乳液光學(xué)顯微鏡觀測

從均質(zhì)好的乳液底部立即取出10 μL乳液置于熒光正置顯微鏡下，在10倍目鏡、10倍物鏡的視野條件下觀察并拍照。

1.3.9 活性巰基的測定

參考Beveridge等[10]與Gao等[11]的方法測定PLP中的游離巰基含量，并稍作修改。將PLP用緩沖液[0.086 mol/L三羥甲基氨基甲烷、0.09 mol/L甘氨酸和4 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），pH8]稀釋為濃度 1 mg/mL 的蛋白溶液。將3 mL蛋白溶液與0.03 mL 4 mg/mL 5，5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸[5，5'-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DNTB]溶液振蕩混勻，于30℃避光水浴30 min，使用紫外分光光度計于412 nm測定吸光度，以緩沖液和蛋白溶液為空白，活性巰基含量計算按公式如下。

式中：A412為蛋白溶液在412 nm處的吸光度；D為稀釋因子；C為蛋白質(zhì)濃度，1 mg/mL；73.53由 106/1.36×104計算，其中 1.36×104為摩爾吸收率。

1.3.10 粒徑分布及Zeta電位的測定

參考吳佳[12]的方法并稍作修改。將所有樣品用超純水分別配制成1 mg/mL PLP溶液，用粒度分析儀測定，記錄其粒徑分布。Zeta電位測定：將所有樣品稀釋成1 mg/mL PLP水溶液，用粒度分析儀測定其電位。

1.3.11 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的測定

參考Li等[13]的方法并適當(dāng)修改。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒制作濃度分別為12%、5%的分離膠與濃縮膠。將蛋白樣品（2.5 mg/mL）與上樣緩沖液按體積比4∶1混合密封后，于100℃煮沸5 min后待其自然冷卻。取20 μL注入濃縮膠泳道中，濃縮電壓為60 mV，分離電壓為80 mV。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色，然后脫色并使用照相機拍照。

1.3.12 紫外可見分光光譜的測定

參考王立等[14]的方法并稍作修改。配制0.25mg/mL PLP溶液，在室溫25℃條件對PLP溶液進行紫外可見光譜掃描，以超純水的光譜作為空白光譜。紫外條件：掃描范圍200 nm～500 nm，掃描速度300 nm/min，步長1 nm。

1.3.13 熒光光譜的測定

參考Gao等[11]的方法并稍作修改。用超純水配制0.25 mg/mL PLP溶液，用熒光分光光度計對PLP溶液三級結(jié)構(gòu)進行分析。熒光條件：光程為1 cm的石英比色皿，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射光譜范圍為300 nm～460 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，電壓為400 mV，掃描速度為300 nm/min。

1.3.14 數(shù)據(jù)處理

每個處理組進行3次平行試驗，結(jié)果以平均值±標準差表示。Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理，Origin 2018 pro軟件進行繪圖，SPSS Statistics 25.0進行顯著性分析，P＜0.05表明結(jié)果具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助pH偏移處理對PLP溶解度的影響

蛋白質(zhì)溶解度與蛋白質(zhì)乳化性等功能特性密切相關(guān)，溶解度是蛋白其他功能性質(zhì)的基礎(chǔ)。不同處理對PLP溶液溶解度的影響試驗結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波輔助pH偏移處理對PLP溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on solubility of PLP

由圖1可知，不同pH偏移處理對PLP的溶解度有不同的影響，與對照組溶解度（41.76%）相比，pH9-7組溶解度顯著增加至53.60%（P＜0.05），其原因可能是堿性條件下破壞了蛋白的疏水相互作用，從而提升了蛋白溶解度；而pH3-7組使PLP溶解度顯著降低（P＜0.05），原因可能是酸性環(huán)境下，蛋白分子為適應(yīng)環(huán)境發(fā)生了去折疊現(xiàn)象，在pH值調(diào)回中性的重折疊過程中，經(jīng)過等電點時，蛋白顆粒間相互碰撞、聚集沉淀，形成較大顆粒，繼續(xù)調(diào)回中性時的電荷作用不足以使沉淀的蛋白再次溶解，從而降低了PLP的溶解度[15]。中性條件下進行超聲處理，PLP溶解度顯著提升至72.89%（P＜0.05）；經(jīng)過酸性pH偏移處理的2個處理組中，超聲處理組與未超聲處理組相比，PLP溶解度有所提高但無顯著差異（P＞0.05）；經(jīng)過堿性pH偏移處理的2個處理組中，超聲處理組與未超聲處理組相比，PLP溶解度得到顯著提升（P＜0.05），且與對照組相比PLP的蛋白質(zhì)溶解度提高了近1倍，其原因可能是由于空化作用產(chǎn)生機械沖擊導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，使疏水和靜電相互作用以及氫鍵等非共價相互作用遭到破壞，并且增強蛋白質(zhì)和水分子之間相互作用[16]。以上結(jié)果表明，堿性pH偏移過程中結(jié)合超聲波處理，在提升蛋白溶解度方面具有協(xié)同作用。此試驗結(jié)果與Silventoinen等[17]研究pH偏移和超聲處理對大麥分離蛋白溶解度的影響中得到的結(jié)果類似。

2.2 超聲波輔助pH偏移對PLP表面疏水性的影響

表面疏水性的大小與蛋白質(zhì)乳化特性密切相關(guān)，可以利用蛋白質(zhì)暴露的疏水氨基酸殘基含量來表征蛋白質(zhì)的疏水性[18]。超聲波輔助pH偏移對PLP表面疏水性的影響如圖2所示。

圖2 超聲波輔助pH偏移處理對PLP表面疏水性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on surface hydrophobicity of PLP

由圖2可知，相較于對照組，經(jīng)過處理后PLP表面疏水性提升明顯。在僅pH偏移處理中，pH3-7組的表面疏水性較pH9-7組顯著增加（P＜0.05），表明PLP可能在酸性偏移過程中變性程度更大，重折疊程度更小，從而使表面疏水基團更多的暴露于蛋白質(zhì)分子表面；pH9-7組表面疏水性較對照組差異顯著（P＜0.05），但增幅不及pH3-7組，可能是因為堿性環(huán)境下PLP未嚴重變性，使PLP具有較高的重折疊程度。唐小丹[19]在研究酸或堿處理對羅非魚水溶性蛋白表面疏水性的影響時也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，酸堿處理后羅非魚蛋白表面疏水性均有提高。pH3U-7組與pH3-7組表面疏水性未表現(xiàn)出明顯差異，酸性條件下的超聲，使PLP更能適應(yīng)酸性環(huán)境，但在pH值調(diào)回中性的重折疊過程中，依然會產(chǎn)生聚集沉淀。單獨超聲處理（U）、堿性pH偏移條件下超聲（pH9U-7）明顯提高了PLP表面疏水性，超聲處理的加入使原本的蛋白聚集體分散，暴露出更多的疏水氨基酸，而堿性pH偏移條件下使PLP遠離等電點而具有較高的靜電互斥作用，超聲處理使PLP表面疏水性進一步增加。類似的研究結(jié)果也出現(xiàn)在超聲處理豌豆蛋白[20]中。

2.3 超聲波輔助pH偏移對PLP乳化活性的影響

乳化活性（EAI）的大小表示蛋白質(zhì)在界面上吸附能力的強弱，是蛋白重要的功能指標。超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳化活性的影響如圖3所示。

圖3 超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳化活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on emulsifying activity of PLP

如圖3所示，相較于對照組，堿性pH偏移蛋白（pH9-7）的EAI顯著提高（P＜0.05），而酸性pH 偏移蛋白（pH3-7）的 EAI顯著降低（P＜0.05），其原因可能是pH3-7組降低了蛋白的溶解度，使其不能更好地包裹油脂[11]；堿性pH偏移條件下的PLP有更高的溶解度，有利于蛋白質(zhì)在油水界面中更均勻、有效地展開和分散，從而提高蛋白的乳化活性[8]。對照組超聲處理的加入，使PLP的乳化活性顯著提高（P＜0.05），而在pH3U-7組條件下，乳化活性相較于pH3-7組有一定程度提高，但無顯著性差異（P＞0.05），pH9U-7組的乳化活性在pH9-7組的基礎(chǔ)上進一步提高。研究表明，超聲波改善蛋白質(zhì)的乳化活性，是因為超聲能提高溶解度，使蛋白粒徑朝著更小的方向移動[11]。

2.4 超聲波輔助pH偏移對PLP乳液穩(wěn)定性的影響

超聲波輔助pH偏移處理后PLP乳液穩(wěn)定性如圖4所示。

圖4 超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳液穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on the stability of PLP emulsion

如圖4所示，與對照組的乳液穩(wěn)定性相比，pH3-7組顯著降低了乳液穩(wěn)定性（P＜0.05），pH9-7組顯著提高了乳液穩(wěn)定性（P＜0.05）；在pH偏移條件下，超聲處理顯著提高了乳液穩(wěn)定性（P＜0.05），且pH3U-7組的乳液穩(wěn)定性低于pH9U-7組乳液穩(wěn)定性。超聲處理能提高蛋白質(zhì)乳液穩(wěn)定性，原因可能是超聲波破壞了使蛋白聚集的非共價鍵作用力，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出較多的疏水基團，有利于其在油-水界面中的重排、相互作用以及在油-水界面中形成更穩(wěn)定的膜[11]。以上結(jié)果說明堿性pH偏移聯(lián)合超聲可以提高PLP乳液穩(wěn)定性，而酸性pH偏移處理不利于PLP乳液的形成與穩(wěn)定。

2.5 超聲波輔助pH偏移對PLP乳液顯微結(jié)構(gòu)的影響

通過顯微鏡觀察乳液液滴能直觀了解乳液粒徑的大小及分布情況，可以用來表征乳液的穩(wěn)定性。超聲波輔助pH偏移處理后PLP乳液狀態(tài)如圖5所示。

圖5 超聲波輔助pH偏移處理對PLP乳液顯微結(jié)構(gòu)的影響（200 μm）Fig.5 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on microstructure of PLP emulsion（200 μm）

如圖5所示，對照組乳液液滴明顯大于超聲、pH9-7組和pH9U-7組，而pH3-7組形成的液滴較對照組大而零散分布，在超聲的作用下液滴粒徑有所減小，但零散分布的狀態(tài)沒有改變。與僅堿性pH偏移處理（pH9-7）蛋白乳液相比，堿性pH偏移-超聲復(fù)合處理（pH9U-7）的蛋白乳液液滴密度大，分布均勻，粒徑范圍變窄。通常情況下制成乳液的蛋白粒徑越小，其在乳液的界面覆蓋速度越快，吸附速率越高。此結(jié)果也證明了堿性pH偏移-超聲復(fù)合處理有更好的乳液穩(wěn)定性。

2.6 超聲波輔助pH偏移對PLP活性巰基的影響

超聲波輔助pH偏移處理對PLP活性巰基的影響如圖6所示。

圖6 超聲波輔助pH偏移處理對PLP活性巰基的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on active sulfhydryl group of PLP

如圖6所示，pH偏移和超聲波處理均影響PLP中活性巰基（R-SH）的含量。與對照組相比，酸、堿性pH偏移均使活性巰基含量顯著下降（P＜0.05），酸、堿性條件下R-SH含量較低可能是由于二硫鍵的產(chǎn)生。在酸、堿性條件下，硫代基團更容易與巰基離子發(fā)生反應(yīng)，加速氧化過程。在pH偏移條件下，超聲處理后PLP中R-SH含量均有一定程度降低，但無顯著差異（P＞0.05），這可能與超聲功率、處理時間有關(guān)[20]。僅超聲處理會使活性巰基顯著下降（P＜0.05），原因可能是超聲處理能誘導(dǎo)二硫鍵形成，同時超聲可以使水分子產(chǎn)生自由基[21]，進而可以氧化敏感官能團，如將R-SH氧化成亞磺酸[22]。Pezeshk等[20]在研究pH偏移處理結(jié)合超聲波處理對虹鱒魚副產(chǎn)物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響時，發(fā)現(xiàn)超聲波使虹鱒魚副產(chǎn)物蛋白中R-SH含量出現(xiàn)不同程度下降。Figueroa-gonzález等[23]在研究超聲輔助pH偏移處理莧菜蛋白時，也發(fā)現(xiàn)酸堿性pH偏移均使活性巰基顯著降低，超聲處理進一步降低活性巰基含量，與本試驗結(jié)果一致。

2.7 超聲波輔助pH偏移對PLP粒徑分布和Zeta電位的影響

超聲波輔助pH偏移對PLP粒徑分布和Zeta電位的影響如圖7所示。

圖7 超聲波輔助pH偏移處理對PLP粒徑分布和Zeta電位的影響Fig.7 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on particle size distribution and Zeta potential of PLP

蛋白質(zhì)粒徑的大小會影響蛋白質(zhì)的溶解度和乳化性等功能特性。如圖7A所示，對照組粒徑主要集中在100 nm～1 000 nm和1 000 nm～10 000 nm，pH3-7處理組粒徑分布范圍明顯向右移動，其原因可能是PLP在酸性環(huán)境下，為適應(yīng)環(huán)境蛋白分子發(fā)生去折疊，在pH值調(diào)回中性的重折疊過程中，經(jīng)過等電點時，為疏水基團聚集創(chuàng)造了條件使其聚集沉淀，形成較大顆粒，繼續(xù)調(diào)回中性的過程中作用力不足以使沉淀的蛋白再次溶解；也有可能是PLP內(nèi)部疏水基團暴露并通過疏水相互作用等作用力形成較大聚集體。而在pH9-7組及pH9U-7組中，蛋白的粒徑分布較對照組均明顯向左移動，其原因可能是在遠離等電點的堿性pH9條件下，蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生了更強的靜電斥力，阻礙了蛋白質(zhì)聚集物的形成，并且超聲過程中產(chǎn)生的空化作用力及剪切力會使得蛋白質(zhì)聚集體中的非共價鍵斷裂，導(dǎo)致蛋白粒徑減小。研究結(jié)果與Fang等[24]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白在pH12堿性條件和超聲處理5 min的條件下蛋白粒徑減小的結(jié)論一致。

Zeta電位可以反映溶液蛋白的表面電荷大小，通常Zeta電位絕對值較高的體系，分子間的互斥效應(yīng)明顯，不易發(fā)生聚集。如圖7B所示，觀察電位絕對值發(fā)現(xiàn)，與對照組（20.1 mV）相比，pH3-7組電位絕對值顯著下降至17.2 mV（P＜0.05），其原因可能是PLP粒徑增大，包埋了部分帶電氨基酸；而pH9-7組電位絕對值顯著增加到22.9 mV（P＜0.05），可能是由于堿性偏移條件下蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)展開，使更多的帶電基團暴露。超聲后的PLP電位絕對值均比未超聲時有所增加，可能是由于超聲處理后破壞PLP非共價鍵作用，將更多帶電氨基酸暴露在蛋白分子表面。研究結(jié)果與Li等[13]在研究超聲-pH偏移處理菜籽蛋白時電荷變化趨勢基本一致。

2.8 超聲波輔助pH偏移對PLP SDS-PAGE的影響

SDS-PAGE能表示蛋白的種類及分子量分布情況。超聲波輔助pH偏移處理后PLP SDS-PAGE結(jié)果如圖8所示。

圖8 超聲波輔助pH偏移處理對PLP SDS-PAGE的影響Fig.8 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on SDS-PAGE of PLP

如圖8所示，觀察對照組發(fā)現(xiàn)，PLP分子量主要集中在 10 kDa～15 kDa與 25 kDa～200 kDa，在高于 40 kDa范圍內(nèi)有較深的條帶，說明PLP有較高的分子量。與對照組相比，堿性pH偏移處理（pH9-7）同對照組相比無明顯差異，而pH3-7組蛋白電泳條帶變得模糊，濃縮膠頂部有更深的條帶，推測其原因可能是酸性pH偏移處理（pH3-7）形成的二硫鍵造成了蛋白質(zhì)聚集，有研究報道酸性pH偏移-超聲處理莧菜蛋白也有類似高分子量蛋白質(zhì)聚集體的形成[23]。pH3-7組、pH9-7組在超聲處理后，蛋白電泳條帶沒有明顯變化，說明超聲波輔助pH偏移處理并沒有改變蛋白一級結(jié)構(gòu)。在研究超聲波處理紫貽貝蛋白[25]及烏賊蛋白[26]時也發(fā)現(xiàn)了超聲波處理并未導(dǎo)致蛋白一級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.9 超聲波輔助pH偏移對PLP三級結(jié)構(gòu)的影響

超聲波輔助pH偏移處理PLP紫外光譜和內(nèi)源熒光光譜如圖9所示。

圖9 超聲波輔助pH偏移處理對PLP三級結(jié)構(gòu)的影響Fig.9 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on the tertiary structure of PLP

紫外光譜和蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜的變化反映了PLP三級結(jié)構(gòu)的變化情況。如圖9A所示，對照組與處理組在290 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，經(jīng)超聲波輔助pH偏移處理后該特征吸收峰面積發(fā)生明顯改變，峰面積大小依次為pH3-7組、pH3U-7組、對照組、U組、pH9-7組和pH9U-7組，這可能是由于PLP經(jīng)過超聲輔助pH偏移處理后PLP側(cè)鏈氨基酸結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致PLP三級結(jié)構(gòu)改變，從而造成了紫外光譜的變化。如圖9B所示，對照組有最大的熒光強度，pH偏移處理的蛋白熒光強度均有所下降，且pH3-7組與pH3U-7組有更低的熒光強度，其原因可能是由于酸性pH偏移較堿性pH偏移的蛋白構(gòu)象變化更大[27]；也可能是由于堿性pH偏移處理的蛋白未經(jīng)過等電點的沉淀，具有更高的重折疊能力，因此內(nèi)源熒光強度下降較小。所有pH偏移處理條件下，超聲處理均使PLP內(nèi)源熒光強度進一步降低，說明蛋白質(zhì)原先的聚集狀態(tài)被進一步改變，使通常包埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的色氨酸殘基等疏水基團暴露在周圍的親水環(huán)境中，進而發(fā)生“熒光淬滅”現(xiàn)象，導(dǎo)致其熒光強度下降。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)pH偏移-超聲波聯(lián)合處理會使虹鱒魚副產(chǎn)物蛋白熒光強度降低[20]。

3 結(jié)論

本試驗主要探究超聲波輔助pH偏移處理對豬肝蛋白（PLP）結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響，以期為豬肝蛋白作為乳化劑在食品中的應(yīng)用提供參考。由試驗結(jié)果可知，相較于對照組，堿性pH偏移處理提高了PLP的乳化活性及乳液穩(wěn)定性，處理后的PLP粒徑減小，溶解度及Zeta電位絕對值增大，在加入超聲復(fù)合處理后PLP結(jié)構(gòu)及乳化特性的這一變化更為明顯；而酸性pH偏移及超聲波輔助酸性pH偏移處理均使PLP乳化活性與乳液穩(wěn)定性降低，并且導(dǎo)致蛋白粒徑增大，溶解度與Zeta電位絕對值下降。酸堿pH偏移及超聲復(fù)合處理均使PLP的熒光強度及活性巰基的含量降低。綜上所述，超聲波輔助堿性pH偏移處理可以改善豬肝蛋白的乳化特性，改性后的豬肝蛋白有著作為乳化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中的良好前景。