多效唑納米微球懸浮液的制備及性質(zhì)研究

石文慧，王曉艷，李世卿，侯福鼎，張小軍，李姝靜

(1.北京工商大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京 100048；2.福建諾德生物科技有限責(zé)任公司，福建 三明 365300; 3.中農(nóng)立華生物科技股份有限公司，北京 100052)

農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的作物生長(zhǎng)管理中發(fā)揮著重要作用［1］。然而，由于飄移、被雨水沖刷到環(huán)境中，傳統(tǒng)配方的農(nóng)藥有效利用率不到1%［2-3］。為了達(dá)到更好的防治效果，農(nóng)藥不得不超量使用，這對(duì)田間生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成了威脅。與傳統(tǒng)農(nóng)藥劑型相比，納米農(nóng)藥可以增強(qiáng)農(nóng)藥在作物葉片表面的附著力和鋪展性，提高利用率，同時(shí)降低環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)一種具有鋪展性的緩釋納米農(nóng)藥是提高農(nóng)藥利用率的一種很有前景的方法［4-5］。

玉米醇溶蛋白(zein)具有兩親性質(zhì)，生物相容性好，安全無(wú)毒［6］。由于擁有多肽結(jié)構(gòu)，還具有易降解的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)環(huán)境友好。此外，玉米醇溶蛋白在醇的水溶液中可以自組裝形成納米微球，包埋疏水性分子實(shí)現(xiàn)可控釋放，是傳遞物質(zhì)的理想載體［7］。但是玉米醇溶蛋白中疏水基團(tuán)較多，水溶性較差，難以提高負(fù)載分子的利用率。

殼聚糖(chitosan，CS)是地球上最常見的豐富的天然多糖，主要來(lái)源為甲殼類動(dòng)物的外部骨骼以及某些細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁中提取的幾丁質(zhì)脫乙?；a(chǎn)生［8］。殼聚糖具有優(yōu)異的生物官能性、生物相容性、無(wú)毒、抗菌性和生物降解性［9］，是食品、藥品、生化和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域合成控釋系統(tǒng)的首選材料。有研究表明，殼聚糖是玉米醇溶蛋白微球的一種優(yōu)良的穩(wěn)定劑，可提高微球的穩(wěn)定性［10］。

多效唑(paclobutrazol，PBZ)是一種高效低毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，屬于含氮雜環(huán)化合物中的三唑類化合物［11］。多效唑能夠延緩植物生長(zhǎng)，抑制莖的伸長(zhǎng)，延緩植物衰老等生理效應(yīng)［12］，但是多效唑微溶于水，實(shí)際使用率低，限制了其應(yīng)用。

由于具有清潔、高效和環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，靜電自組裝是制備納米材料的重要方法。Zein 與CS 之間存在氫鍵、靜電等相互作用力。靜電自組裝是將2 個(gè)帶有相反電荷的聚電解質(zhì)，通過靜電相互作用，以吸附的方式形成納米級(jí)微球，所形成的微球具有結(jié)合強(qiáng)度高、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。Zein 具有較高的負(fù)電荷密度，可以在自組裝過程中提供陰離子組分，而CS作為一種陽(yáng)離子聚電解質(zhì)，能夠通過靜電、氫鍵、疏水等作用力與zein 形成納米微球。在本研究中，zein 是PBZ 的載體，無(wú)水碳酸鈉為犧牲模板，當(dāng)zein-無(wú)水碳酸鈉乙醇溶液加入水中時(shí)，無(wú)水碳酸鈉擴(kuò)散，通過反溶劑沉淀形成zein 納米微球，PBZ 可以由無(wú)水碳酸鈉留下的通道進(jìn)入zein，CS 以靜電自組裝的方法與zein 結(jié)合，形成負(fù)載多效唑的納米微球。因此，本研究通過靜電自組裝制備了負(fù)載多效唑的殼聚糖/玉米醇溶蛋白納米微球(CS/zein-PBZ)后，考察了CS 與zein 質(zhì)量比對(duì)空白納米微球以及載多效唑納米微球的粒徑、多分散指數(shù)(PDI)和zeta 電位的影響，以及對(duì)比了不同殼聚糖和玉米醇溶蛋白質(zhì)量比和不同殼聚糖濃度下的載藥量，表征了多效唑納米微球的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和緩釋性能，以期揭示其釋放機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(摩爾質(zhì)量為1.15×106g/mol，脫乙酰度為81.63%，阿拉丁有限公司)；玉米醇溶蛋白(92%，上海源葉生物有限公司)；多效唑(摩爾質(zhì)量為291.78 g/mol，上海源葉生物有限公司)；15%多效唑可濕性粉劑(市售)；無(wú)水碳酸鈉(分析純，麥克林有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，GENERAL-REAGENT)；冰乙酸、甲醇、磷酸鹽緩沖液［分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司］。

1.2 設(shè)備與儀器

N-1100V-W(WD)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；C-MAG HS 7 磁力攪拌器(德國(guó)IKA 公司)；JSM 6700F 掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；Cary-50UV-vis 紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Varian 公司)；Zetasizer Nano ZS90 粒徑分析儀(英國(guó)Malvem 公司)；DSA-100 接觸角測(cè)試儀(德國(guó)KRUSS 公司)；UltiMate3000高效液相色譜(中國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 CS/zein 納米微球的制備

參照Khan 等［13］的方法制備了CS/zein 空白納米微球。稱取0.5 g 的玉米醇溶蛋白粉末溶于10 mL 70%的乙醇水溶液中，配制成質(zhì)量濃度為5% 的玉米醇溶蛋白溶液。稱取0.1 g 的無(wú)水碳酸鈉溶于10 mL的去離子水，配制成質(zhì)量濃度為1% 的無(wú)水碳酸鈉溶液。將1 mL 5%的玉米醇溶蛋白溶液加入到0.3 mL無(wú)水碳酸鈉與0.7 mL 無(wú)水乙醇的混合液中，再將玉米醇溶蛋白和無(wú)水碳酸鈉混合液逐滴加到8 mL 去離子水中，持續(xù)攪拌10 min 后，分別逐滴滴加到10 mL殼聚糖質(zhì)量濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1% 的1%乙酸溶液中，室溫下攪拌30 min，得到CS/zein 納米微球。

1.3.2 CS/zein-PBZ 納米微球的制備

分別稱取5、10、15、20 mg 的多效唑溶于1 mL 5%的玉米醇溶蛋白溶液，加入到0.3 mL 無(wú)水碳酸鈉溶液和0.7 mL 無(wú)水乙醇混合液中。然后逐滴滴加到8 mL 去離子水中，持續(xù)攪拌10 min 后，滴加到0.02%~0.1%的殼聚糖溶液中，室溫?cái)嚢?0 min，得到CS/zein-PBZ 納米微球懸浮液。

1.3.3 SEM 觀察

將試樣進(jìn)行稀釋，滴在處理好的硅片上，在室溫中干燥8 h，表面作噴金處理后，放入電鏡室以觀察試樣形貌，加速電壓是5.0 kV。用Nano Measurer 1.2 軟件標(biāo)注納米微球的直徑后，統(tǒng)計(jì)計(jì)算微球的直徑分布圖。

1.3.4 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)

用散射角為90°的Zetasizer Nano ZS90，在25 ℃下通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量微球大小、多分散指數(shù)和zeta 電位。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取適量多效唑，定容后在200~800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)試樣進(jìn)行紫外掃描，考察試樣的紫外吸收情況，以最大吸收波長(zhǎng)為多效唑的檢測(cè)波長(zhǎng)。色譜柱為Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷酸鹽緩沖液(pH=3，90∶10)。檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。將試樣分別稀釋至不同濃度，按照所述的色譜條件進(jìn)樣，記錄相應(yīng)的峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，PBZ 峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到PBZ 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 包埋率和載藥量

包埋率(encapsulation efficiency)是指多效唑納米微球中包裹多效唑的質(zhì)量與多效唑的投入量的比，載藥量(loading efficiency)是指多效唑占多效唑納米微球的比重。將制備好的試樣用離心機(jī)在6 000 r/min 下離心10 min，取上清液通過高效液相色譜法得到多效唑含量。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多效唑的濃度，根據(jù)公式⑴、⑵計(jì)算包埋率和載藥量。

2 結(jié)果與分析

1.3.7 接觸角

室溫下，用接觸角測(cè)試儀測(cè)定了多效唑可濕性粉劑懸浮液和多效唑納米微球懸浮液的潤(rùn)濕性能。將稀釋一定倍數(shù)的試樣滴在Parafilm 載玻片上。液滴形態(tài)的變化被數(shù)字化捕捉5 min，每個(gè)試樣測(cè)試3 次，使用五點(diǎn)擬合分析法計(jì)算了左右側(cè)接觸角的平均值。

1.3.8 緩釋性能研究

通過透析袋法［14］研究了納米微球中多效唑的緩釋性能，釋放介質(zhì)為乙醇/水(1∶1，體積比)。將具有相同有效含量的多效唑試樣連同釋放介質(zhì)一起轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO，500D)中，將透析袋放入裝有釋放介質(zhì)的燒杯中。在特定的時(shí)間間隔內(nèi)，收集3 mL試樣，并迅速用相同體積的新鮮釋放介質(zhì)代替，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量吸光度3 次。多效唑的累積釋放率通過公式⑶計(jì)算：

式中：Ct為在t時(shí)取出的試樣濃度，mg/mL；Vt-1(3 mL)為在t-1 時(shí)取出的試樣體積；V(100 mL)為初始溶液體積；w為透析袋中多效唑的質(zhì)量，mg。

2.1 DLS 和儲(chǔ)存穩(wěn)定性

如圖1 所示，當(dāng)溶液中玉米醇溶蛋白的含量不變時(shí)，殼聚糖的濃度增加，CS/zein 納米微球的粒徑也隨之增加，這可能是因?yàn)槟軌虬衩状既艿鞍椎臍ぞ厶堑牧吭黾?，從而?dǎo)致粒徑有所增加。PDI可以用來(lái)證明納米微球的均一性，其數(shù)值越小代表試樣的均一性越好。PDI 的數(shù)值均在0.3 以下，表明CS/zein 納米微球具有良好的分散性。當(dāng)zeta 電位的絕對(duì)值大于30 mV 時(shí)，可認(rèn)為納米微球的體系是具有一定穩(wěn)定性的，絕對(duì)值越大，體系的穩(wěn)定性越高。CS/zein 納米微球的zeta 電位均大于65 mV，表明體系具有較高的穩(wěn)定性。在熱貯(54 ℃)條件下儲(chǔ)存了14 d 后，微球粒徑?jīng)]有明顯變化，PDI 小于0.3，表明微球具有一定的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。隨著殼聚糖的加入量增加，體系依舊能夠保持良好的穩(wěn)定性，CS/zein納米微球的粒徑基本保持不變。這是由于CS 具有高電荷密度，當(dāng)CS 的加入量逐漸增加時(shí)，CS 能與帶負(fù)電荷的zein 緊密交聯(lián)。此外，納米微球由于CS的加入所帶有的正電荷與游離的CS 之間存在靜電排斥，靜電斥力的存在可以防止納米微球過度團(tuán)聚形成沉淀，對(duì)溶液的穩(wěn)定性有積極的影響。

圖1 殼聚糖的濃度對(duì)CS/zein 納米微球的粒徑(A)、PDI(B)和zeta 電位(C)的影響

如圖2 所示，CS/zein-PBZ 納米微球，在加入了不同質(zhì)量的多效唑后，平均粒徑也隨之變化，與CS/zein 納米微球相比，PDI 的值也有所增加，這說明多效唑的加入會(huì)影響納米微球的顆粒大小和體系的均一性，同樣具有較高的zeta 電位，說明加入多效唑以后，納米微球也具有很好的穩(wěn)定性。

圖2 殼聚糖的濃度對(duì)CS/zein-PBZ 納米微球的粒徑(A)、PDI(B)和zeta 電位(C)的影響

如圖3 所示，當(dāng)多效唑的投入量分別為5、10、15、20 mg 時(shí)，CS/zein-PBZ 納米微球的粒徑都隨著殼聚糖濃度的增加而增加，在熱貯(54 ℃)條件下經(jīng)過14 d 保存以后，其粒徑的變化不大，說明此方法制備的CS/zein-PBZ 納米微球具有良好的穩(wěn)定性。此外，都具有較低的多分散性，當(dāng)多效唑的投入量為20 mg 時(shí)，納米微球的PDI 都在0.3 以下，說明多效唑在此濃度下的納米微球均一性最好。

圖3 CS/zein-PBZ 納米微球的粒徑與PDI 隨殼聚糖濃度和儲(chǔ)存時(shí)間的變化

2.2 多效唑的包埋率和載藥量

如圖4 所示，當(dāng)投入多效唑的質(zhì)量為5 mg 時(shí)，包埋率隨殼聚糖的濃度總體上呈先減小后增大的趨勢(shì)，投入多效唑的質(zhì)量為10、15、20 mg 時(shí)，包埋率隨殼聚糖的濃度呈增大的趨勢(shì)。殼聚糖濃度為0.1%時(shí)，多效唑的包埋率均高于同等質(zhì)量多效唑其他殼聚糖濃度的，且在多效唑?yàn)?0 mg 時(shí)達(dá)到最高，為89.9%，說明此時(shí)對(duì)多效唑的包埋效果最好。多效唑的包埋率和載藥量均隨著多效唑濃度的增加而增加，與包埋率不同的是，隨著殼聚糖濃度的增加，載藥量整體呈下降的趨勢(shì)。

圖4 CS/zein-PBZ 納米微球的包埋率(A)和載藥量(B)隨殼聚糖濃度的變化

在多效唑?yàn)?0 mg 時(shí)CS/zein-PBZ 納米微球均具有較高的載藥量，殼聚糖濃度為0.1%時(shí)達(dá)到最大。考慮到納米微球的穩(wěn)定性和均一性，殼聚糖的濃度為0.1%，多效唑?yàn)?0 mg 時(shí)的CS/zein-PBZ 納米微球具有最優(yōu)的表現(xiàn)，包埋率和載藥量分別為89.9%和28.8%，因此選用此納米微球進(jìn)行后續(xù)的表征。

2.3 納米粒子的形態(tài)學(xué)觀察

如圖5 所示，CS/zein 納米微球和CS/zein-PBZ納米微球的掃描電子顯微鏡圖像呈球形，微球表面光滑，多效唑的加入并沒有改變CS/zein NPs 的形態(tài)。CS/zein 和CS/zein-PBZ 納米微球的平均粒徑分別是(186.94±46.16)、(175.69±33.22)nm，這一結(jié)果小于通過激光粒度儀所測(cè)得的平均粒徑。這可能是因?yàn)榧す饬６葍x是在溶液中測(cè)量微球的粒徑，這種情況下測(cè)得的是水合粒徑，而掃描電子顯微鏡的數(shù)據(jù)是在試樣被自然風(fēng)干以后得到的，因此小于激光粒度儀所測(cè)得的納米微球的粒徑。這一結(jié)果與李等［15］報(bào)道的負(fù)載姜黃素的玉米醇溶蛋白-殼聚糖納米微球的結(jié)果類似。

圖5 CS/zein 納米微球(A、B)和CS/zein-PBZ 納米微球(C、D)的掃描電子顯微鏡圖和粒徑分布圖

2.4 多效唑的鋪展性能研究

良好的鋪展性可以減少液滴的滑落，有效降低農(nóng)藥的損失。其鋪展性能可以由液滴的靜態(tài)接觸角大小來(lái)反映。如圖6 所示，多效唑可濕性粉劑和CS/zein-PBZ 納米微球懸浮液的接觸角分別為68.3°±2.36°和60.2°±2.22°。在多效唑有效含量相同的情況下，與多效唑可濕性粉劑直接分散到水中相比，經(jīng)過玉米醇溶蛋白和殼聚糖包裹的多效唑納米微球懸浮液具有更好的鋪展性，證明了所制備的CS/zein-PBZ 納米微球可以提高多效唑的潤(rùn)濕性。

圖6 PBZ WP 和CS/zein-PBZ 納米微球的接觸角

2.5 多效唑的釋放性能研究

具有緩釋性的農(nóng)藥可以減少農(nóng)藥用量，提高施用效率，解決農(nóng)藥的過度使用問題，減少環(huán)境污染。因此，探究了CS/zein-PBZ 納米微球的釋放性能，選用殼聚糖濃度為0.1%，多效唑?yàn)?0 mg 時(shí)的CS/zein-PBZ 納米微球試樣，該試樣的包埋率和載藥量分別為89.9%和28.8%。多效唑可濕性粉劑和CS/zein-PBZ 納米微球的釋放如圖7 所示，游離的多效唑在前4 h 保持較高的釋放速率，在12 h 釋放完成。而CS/zein-PBZ 納米微球在前12 h 處于快速釋放階段，這可能是由于藥物溶解并從聚合物的孔隙中擴(kuò)散所致。12 h 后的延遲釋放階段可能是由于聚合物的降解。與游離多效唑相比，CS/zein-PBZ 具有明顯的緩釋特性。對(duì)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Higuchi 動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行了模擬，得到了相應(yīng)的擬合系數(shù)。很明顯，多效唑釋放曲線與一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程相吻合，R2值大于0.99(R12、R22分別代表PBZ和CS/zein-PBZ的釋放動(dòng)力學(xué)方程中回歸平方和與總離差平方和的比值，比例越接近1，回歸擬合效果越好)，表明藥物濃度隨時(shí)間的增加而增加。

圖7 PBZ WP 和CS/zein-PBZ 納米微球的累積釋放曲線和動(dòng)力學(xué)方程

3 結(jié) 論

基于殼聚糖與玉米醇溶蛋白靜電相互作用包裹多效唑構(gòu)建了復(fù)合納米微球CS/zein-PBZ NPs 懸浮液，平均粒徑為(187±46)nm，具有較好的尺寸分布，以及較高的zeta 正電位(65 mV)。殼聚糖的濃度為0.1%，多效唑?yàn)?0 mg 時(shí)，CS/zein-PBZ 納米微球的包埋率和載藥量達(dá)到最高，分別為89.9%和28.8%。在鋪展性方面，其靜態(tài)接觸角為60.2°±2.22°，小于多效唑可濕性粉劑的接觸角(68.3°±7.33°)，在釋放性能研究中，多效唑的釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，且R2值大于0.99。這些都證實(shí)了所制備的CS/zein-PBZ納米微球具有優(yōu)良的理化性質(zhì)，鋪展性以及緩釋性能。