miR-143-3p 通過(guò)靶向integrin β1 抑制肝癌進(jìn)展

李麗坤，邸雅南，陳帝，張晶

（北京航天總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100076）

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌是發(fā)病率排名前四的癌（每年約748 300 名新增病例），也是世界各地因癌致死排名前三的癌（每年約695 900 名死亡病例）。我國(guó)肝癌高發(fā)，其患病人數(shù)占世界50%以上[1‐2]。目前的研究顯示肝癌的發(fā)病與乙型肝炎、丙型肝炎、飲酒以及黃曲霉素污染等因素有關(guān)[3‐4]，但對(duì)腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制仍了解甚少。因此迫切需要對(duì)肝癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究。

據(jù)報(bào)道，miRNAs 在癌的發(fā)生、進(jìn)展與預(yù)后的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著舉重輕重的作用[5]。迄今為止，在各種癌癥中已鑒定出數(shù)以千計(jì)的發(fā)生表達(dá)變化的miR‐NAs，這些miRNAs 中就有很多參與調(diào)節(jié)癌的進(jìn)展與預(yù)后[5‐6]。miR‐143‐3p 已被發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌、肺癌和胃癌等癌中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[7‐9]。在肝癌中，miR‐143‐3p 也發(fā)現(xiàn)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后相關(guān)，但其對(duì)肝癌的具有作用以及潛在的機(jī)制仍不完全清楚[10‐11]。近來(lái)研究表明，整合素β1（integrin β1）不僅可促進(jìn)肝癌細(xì)胞與基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)以及宿主細(xì)胞間的黏附，并且其與配體結(jié)合進(jìn)而激活的下游信號(hào)進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[12,13]。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR‐143‐3p 與integrin β1 存在潛在的結(jié)合序列。因此，本研究旨在調(diào)查miR‐143‐3p 在肝癌進(jìn)展中的作用，以及其與integrin β1 的內(nèi)在聯(lián)系。

材料和方法

1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

TRNzol Universal總RNA提取試劑、FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；miR‐143‐3p 和U6 引物、miR‐143‐3p擬 似 物（miR‐143‐3p mimics；5’‐UGAGAUGAAG‐CACUGUAGCUC‐3’）及其陰性對(duì)照（miR‐NC）、pcDNA‐integrin β1 及其陰性對(duì)照（pcDNA‐NC）（生工生物工程(上海)股份有限公司）；Lipofectamine 3000（美國(guó)Invitrogen 公司）；XTT 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Trevigen 公司）；EdU 檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（上海碧云天生物科技有限公司）；integrin β1 和GAPDH 兔源抗體、HRP‐羊抗兔二抗（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；SP 兔免疫組織化學(xué)染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）。

2 臨床樣本收集

收集自2019 年6 月—2022 年6 月在我院行根治性肝葉切除術(shù)的25 例肝癌患者（男21 例，女4例；42 ～69 歲，平均年齡（54.7±6.7）歲； T1 期4例、T2 期9 例、T3 期8 例、T4 期4 例；病理分型為肝細(xì)胞型），收集肝癌和癌旁組織?；颊邽槭状未_診，未進(jìn)行過(guò)治療。研究方案通過(guò)了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且獲得了所有患者簽寫(xiě)的知情同意書(shū)。

3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

肝癌細(xì)胞株（HepG2、SMMC‐7721、Huh7 和Hep3B）購(gòu)自北京普非生物科技有限公司，人正常肝細(xì)胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司。上述細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。取生長(zhǎng)良好的HepG2 和Huh7 細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)用Lipofectamine 3000 分 別 將miR‐NC、miR‐143‐3p mimics、miR‐143‐3p mimics+pcDNA‐NC 和miR‐143‐3p mimics+cDNA‐integrin β1 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后經(jīng)過(guò)鑒定的細(xì)胞分別命名為miR‐NC 組、Mimics組、Mimics+Vec組和Mimics+integrin β1 組。

4 XTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

將各組細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度再次接種于96孔板中，分別常規(guī)培養(yǎng)1、2、3 和4 d，按照說(shuō)明書(shū)，每孔加入50 μL XTT 試劑，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處光密度值（A），并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5 EdU 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將各組細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度再次接種于96孔板中，按照說(shuō)明書(shū)，每孔加入終濃度為10 μmol/L EdU 溶液，37 ℃孵育2 h，用4%多聚甲醛固定后，再用0.5% Trizol X‐100 通透細(xì)胞5 min，加入100 μL按照說(shuō)明書(shū)配置的熒光標(biāo)記檢測(cè)反應(yīng)液室溫孵育20 min，用DAPI 染核，用熒光顯微鏡對(duì)每視野下EdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

6 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲

將各組細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度（無(wú)血清培養(yǎng)基配置的細(xì)胞懸液，100 μL）再次接種于Transwell 嵌套小室（包被基質(zhì)膠的濾膜用于侵襲測(cè)定，僅濾膜用于遷移測(cè)定），下室孔加600 μL 正常培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定嵌套小室濾膜，并用0.2%結(jié)晶紫染細(xì)胞10 min，顯微鏡下任選5 個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)遷至濾膜下表面的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

7 RT-qPCR 檢測(cè)miR-143-3p 表達(dá)

按照試劑盒說(shuō)明，用TRNzol Universal 總RNA提取試劑提取臨床組織樣本以及培養(yǎng)的細(xì)胞的總RNA。將提取的各樣本總RNA 模板連同目的基因的引物用FastKing 一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 試劑盒在AFD4800 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（杭州安杰思生物科技有限公司）反應(yīng)。設(shè)置程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，40 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s）。引物序列：miR‐143‐3p 正向5’‐GT‐GAGATGAAGCACTGTAGC‐3’，反向5’‐GTGCAGG‐GTCCGAGGT‐3’；U6正向5’‐CTCGCTTCGGCAGCA‐CA‐3’，反向5’‐AACGCTTCACGAATTTGCGT‐3’。以U6 作為內(nèi)部對(duì)照，用2‐ΔΔCt法計(jì)算miR‐143‐3p 的相對(duì)表達(dá)量。

8 熒光素酶活性分析檢測(cè)miR-143-3p 與integrin β1 靶向關(guān)系

將Targetscan 軟件預(yù)測(cè)的miR‐143‐3p 與integrin β1（基因名為ITGB1PB1）在其3′‐UTR 區(qū)的假定結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行堿基突變，并分別將野生型integrin β1 3’UTR 序列片段和突變型序列片段克隆至pGL3‐熒光素酶報(bào)告基因的下游。將此倆種熒光素酶活性報(bào)告基因載體質(zhì)粒分別與miR‐143‐3p mimics 或miR‐NC 共轉(zhuǎn)入細(xì)胞。48 h 后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光熒光儀檢測(cè)的熒光素酶活性分析二者的靶向關(guān)系。

9 Western blot 檢測(cè)integrin β1 表達(dá)

常規(guī)法提取臨床組織樣本和培養(yǎng)的細(xì)胞樣本中的蛋白。定量樣本中的蛋白濃度后，取等量的蛋白進(jìn)行常規(guī)的Western blot 實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)印。封閉膜面上非特異性蛋白后，4 ℃孵育integrin β1（1 ∶2000）和GAPDH（1 ∶8000）抗體過(guò)夜；洗膜后，室溫孵育HRP‐羊抗兔IgG（1 ∶2000）1 h；洗膜后，ECL 孵育、化學(xué)發(fā)光成像儀成像并量化各條帶光密度值，然后以GAPDH 為內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行歸一化處理。

10 integrin β1 免疫組織化學(xué)染色

將臨床組織樣本用4%多聚甲醛固定后，按照常規(guī)程序用石蠟包埋，然后將其切為連續(xù)的切片（6 μm厚）。切片依次脫蠟、水化和阻斷過(guò)氧化氫酶后，按照SP 兔免疫組織化學(xué)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，行integrin β1 免疫組織化學(xué)染色，在顯微鏡獲取染色圖像。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肝癌中miR-143-3p 低表達(dá)integrin β1 高表達(dá)

qRT‐PCR 檢測(cè)顯示，肝癌組織中miR‐143‐3p 的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織（圖1A、B），且隨肝癌T 分期增加而逐漸降低（圖1B）；Western blot 和免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明，integrin β1 的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（圖1C、D），并隨肝癌T 分期增加而逐漸增高（圖1D）。Pearson 相關(guān)性分析顯示，miR‐143‐3p 與integrin β1 的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)（圖1E）。

圖1 miR‐143‐3p 和integrin β1 在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平檢測(cè)。A，肝癌組織與癌旁正常組織中miR‐143‐3p 表達(dá)水平的RT‐qPCR 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B，各T 分期肝癌組織中miR‐143‐3p 表達(dá)水平的RT‐qPCR 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，肝癌組織與癌旁正常組織中integrin β1 表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D，各T 分期肝癌組織中integrin β1 表達(dá)的代表性免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果；E，肝癌中miR‐143‐3p 與integrin β1 表達(dá)水平相關(guān)性的Pearson 分析；F，正常肝細(xì)胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）與肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、Huh7 和SMMC‐7721）中miR‐143‐3p 表達(dá)水平的RT‐qPCR 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；G，正常肝細(xì)胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）與肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、Huh7 和SMMC‐7721）中integrin β1 表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；H 和I，HepG2（H）和Huh7（I）細(xì)胞中miR‐143‐3p mimics 轉(zhuǎn)染效果的RT‐qPCR 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；J 和K，轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 的HepG2（J）和Huh7（K）細(xì)胞中integrin β1 表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P＜0.05 vs 癌旁正常組織（n=25）或正常肝細(xì)胞株（n=4）或?qū)φ战M（n=4）Fig. 1 Detection of expression levels of miR‐143‐3p and integrin β1 in the tissues and cell lines of liver cancer. A, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p expression levels in liver cancer tissue and adjacent normal tissue; B, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p expression levels in liver cancer tissues of different T stages; C, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression levels in liver cancer tissue and adjacent normal tissue; D, immunohistochemical examination of integrin β1 expression in liver cancer tissues of different T stages;E, Pearson correlation analysis of miR‐143‐3p and integrin β1 expression levels in liver cancer; F, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p expression levels in normal liver cell lines (HL‐5, HL‐7702, QSG‐7701) and liver cancer cell lines (HepG2, Hep3B, Huh7 and SMMC‐7721);G, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression levels in normal liver cell lines (HL‐5, HL‐7702, QSG‐7701) and liver cancer cell lines (HepG2, Hep3B, Huh7 and SMMC‐7721); H and I, RT‐qPCR detection and statistical analysis of miR‐143‐3p mimics transfection effect in HepG2 (H) and Huh7 (I) cells; J and K, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression in HepG2 (J) and Huh7 (K) cells after transfection with miR‐143‐3p mimics.*P＜0.001 vs adjacent normal tissue (n=25), normal liver cells (n=4), or control group (n=4)

在培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、Huh7和SMMC‐7721）中，miR‐143‐3p 水平均明顯低于正常肝細(xì)胞株（HHL‐5、HL‐7702、QSG‐7701）（圖1F， RT‐qPCR 法），integrin β1 的 表達(dá) 水平 明顯高于正常肝細(xì)胞株（圖1G， Western blot 法）。用miR‐143‐3p mimics 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2（圖1H）和Huh7（圖1I）以過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p，Western blot檢測(cè)integrin β1 表達(dá)，與miR‐NC 組比較，過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 的肝癌細(xì)胞HepG2（圖1J）和Huh7（圖1K）中，integrin β1 表達(dá)均顯著下調(diào)。

2 miR-143-3p 抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

分別應(yīng)用XTT、EdU 染色和Transwell 法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響顯示，與miR‐NC 組比較，過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2（圖2A）和Huh7（圖2B）的增殖活性、EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（圖3C‐3F）、遷移（圖3A、3B、3D、3E）和侵襲（圖3A、3C、3D、3F）。

圖2 過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 抑制肝癌細(xì)胞增殖。A 和B，轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 的HepG2（A）和Huh7（B）細(xì)胞增殖活性的XTT 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C 和D，轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 的HepG2 細(xì)胞的EdU 代表性染色圖像（C）與EdU 陽(yáng)性細(xì)胞比例（D）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；E 和F，轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 的Huh7 細(xì)胞的EdU 代表性染色圖像（E）與EdU 陽(yáng)性細(xì)胞比例（F）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比例尺，50 μm；*P＜0.05 vsmiR‐NC 組，n=4Fig. 2 Over‐expression of miR‐143‐3p inhibited the proliferation of liver cancer cells. A and B, XTT assay and statistical analysis of cell viability of HepG2 (A) and Huh7 (B) cells transfected with miR‐143‐3p mimics; C and D, representative EdU staining images (C) and statistical analysis of the EdU‐positive cells proportion (D) in HepG2 cells overexpressing miR‐143‐3p mimics; E and F, representative EdU staining images (E) and statistical analysis of the EdU‐positive cells proportion (F) in Huh7 cells overexpressing miR‐143‐3p mimics. Scale bar, 50 μm; *P＜0.05 vs miR‐NC group; n=4

圖3 過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 抑制肝癌細(xì)胞遷移與侵襲。A—C，過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p mimics 對(duì)HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲影響的Transwell 法檢測(cè)（A）和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（B 和C）；D—F，過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p mimics 對(duì)Huh7 細(xì)胞遷移和侵襲影響的Transwell 法檢測(cè)（D）和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（E和F）。比例尺，100 μm；*P＜0.05 vsmiR‐NC 組；n=4。Fig 3. Over‐expression of miR‐143‐3p inhibited the migration and invasion in liver cancer cells. A to C, representative Transwell assay (A) and statistical analysis (B and C) for the effect of overexpression of miR‐143‐3p mimics on migration and invasion of HepG2 cells; D to F, representative Transwell assay (D) and statistical analysis (E and F) for the effect of overexpression of miR‐143‐3p mimics on migration and invasion of Huh7 cells. Scale bar,100μm; *P＜0.05 vs miR‐NC group; n=4

3 miR-143-3p 靶向integrin β1

TargetScan 軟 件 預(yù) 測(cè) 的miR‐143‐3p 與integrin β1（基因名為ITGB1PB1） 3’‐UTR 區(qū)的假定結(jié)合位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)序列（圖4A），以及突變體的堿基序列。雙熒光素酶活性分析顯示，在與野生型（WT）integrin β1 3’UTR 熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)體系中，miR‐mimics 組熒光活性顯著低于miR‐NC組；在與突變型（Mut）integrin β1 3’UTR 熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)體系中，miR‐mimics 組熒光活性與miR‐NC 組無(wú)明顯差異（圖4B）。

圖4 Integrin β1 為miR‐143‐3p 的靶點(diǎn)。A，TargetScan 軟件預(yù)測(cè)的miR‐143‐3p 與integrin β1 ITGB1PB13’‐UTR 區(qū)的假定結(jié)合位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)序列；B，miR‐143‐3p 與integrin β1 靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P＜0.05 vsmiR‐NC 組；n=3Fig. 4 Integrin β1 was a target for miR‐143‐3p. A, the base complementary sequences of putative binding sites of miR‐143‐3p and integrin β1 gene ITGB1PB1 3’‐UTR region predicted by TargetScan software; B, detection and statistical analysis of dual luciferase reporter activity in the targeting relationship between miR‐143‐3p and integrin β1. *P＜0.05 vsmiR‐NC group; n=3

4 上調(diào)integrin β1 逆轉(zhuǎn)miR-143-3p 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

Western blot 檢測(cè)Mimics+Vec 組和Mimics+inte‐grin β1組肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7中integrin β1表達(dá)顯示：Mimics+integrin β1組中integrin β1表達(dá)明顯高于Mimics+Vec 組（圖5A）。XTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，Mimics+integrin β1組肝癌細(xì)胞HepG2（圖5B）和Huh7（圖5C）的增殖活性較Mimics+Vec 組明顯升高。EdU 染色顯示，Mimics+integrin β1 組肝癌細(xì)胞HepG2（圖5D、5E）和Huh7（圖5F、5G）的EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)同樣明顯增多。Transwell 法檢測(cè)2 組細(xì)胞遷移和侵襲顯示，Mimics+integrin β1 組肝癌細(xì)胞HepG2（圖6A—6C）和Huh7（圖6D—6F）的遷移和侵襲均較Mimics+Vec 組明顯升高。

圖5 過(guò)表達(dá)integrin β1 對(duì)miR‐143‐3p 抑制肝癌細(xì)胞增殖作用的影響。A，共轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的HepG2 和Huh7細(xì)胞中integrin β1 表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B 和C，共轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的HepG2（B）和Huh7（C）細(xì)胞增殖活性的XTT 檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D 和E，共轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的HepG2 細(xì)胞的EdU 代表性染色圖像（D）與EdU 陽(yáng)性細(xì)胞比例（E）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；F 和G，共轉(zhuǎn)染miR‐143‐3p mimics 和pcDNA‐integrin β1 的Huh7 細(xì)胞的EdU 代表性染色圖像（F）與EdU 陽(yáng)性細(xì)胞比例（G）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比例尺，50 μm；*P＜0.05 vsmiR‐mimics+NC 組；n=3。Fig. 5 Over‐expression of integrin β1 reversed the inhibitory effects of miR‐143‐3p on proliferation of liver cancer cells. A, Western blot detection and statistical analysis of integrin β1 expression in HepG2 and Huh7 cells after co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1; B and C,XTT assay and statistical analysis of cell viability of HepG2 (B) and Huh7 (C) cells with co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1;D and E, representative EdU staining images (D) and statistical analysis of the EdU‐positive cells proportion (E) in HepG2 cells with co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1; F and G, representative EdU staining images (F) and statistical analysis of the EdU‐positive cells propor‐tion (G) in Huh7 cells with co‐transfection of miR‐143‐3p mimics and pcDNA‐integrin β1. Scale bar, 50 μm; *P＜0.05 vs miR‐mimics+NC group; n=3

討 論

肝癌是一種致命的疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈較高的增長(zhǎng)率[1,2]，但目前對(duì)肝癌的治療效果并不能令人滿(mǎn)意。因此，需要對(duì)肝癌的發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

已有大量數(shù)據(jù)表明miRNAs 是癌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其可參與調(diào)控癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后[5,6,14]。面對(duì)龐大的miRNAs 家族成員，人們目前對(duì)miRNAs調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的分子機(jī)制仍所知甚少。miR‐143‐3p 作為重要的抑癌基因調(diào)節(jié)因子，其可抑制如結(jié)直腸癌、肺癌和胃癌等癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[7‐9]。但miR‐143‐3p 在肝癌中的具有作用以及相關(guān)機(jī)制并不清楚。我們的研究結(jié)果表明miR‐143‐3p 在肝癌中表達(dá)下調(diào)，且伴隨T 分期而降低表達(dá)，由此初步提示miR‐143‐3p 可能在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。為證明這一觀點(diǎn)，本研究首先對(duì)比了正常肝細(xì)胞株和肝癌細(xì)胞株中的miR‐143‐3p 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中miR‐143‐3p 表達(dá)下調(diào)；進(jìn)一步通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方式證明過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。結(jié)果表明miR‐143‐3p 在肝癌中可作為抑癌因子發(fā)揮作用。

我們進(jìn)一步對(duì)miR‐143‐3p 在肝癌中的抑癌作用機(jī)制進(jìn)行了探討。miRNAs是通過(guò)與靶基因的3’UTR區(qū)的堿基序列通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)模式結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)integrin β1 基因ITGB1PB1是miR‐143‐3p 潛在的靶基因。integrin β1 被發(fā)現(xiàn)在多種癌中表達(dá)上調(diào)，可直接促進(jìn)癌細(xì)胞與基底膜黏附[12‐13]。另外，integrin β1與配體結(jié)合可激活的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）/EGF 信號(hào)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[16]，也可通過(guò)黏附激酶（focal adhesion kinase,FAK）激活下游比如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases, MAPK）[17]、磷脂酰肌醇‐3‐ 激 酶（phosphatidylinositol‐3‐kinase, PI3K）[18]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and transcription activator, STAT）[19]等信號(hào)進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。在肝癌中也發(fā)現(xiàn)，integrin β1 表達(dá)上調(diào)，其和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且上調(diào)integrin β1能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與遷移[10‐11]。本研究結(jié)果顯示integrin β1 在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，隨T 分期而增高，這與前人研究一致。另外，本研究顯示，miR‐143‐3p與integrin β1在肝癌中呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR‐143‐3p 能抑制integrin β1 表達(dá)，而過(guò)表達(dá)integrin β1能廢除miR‐143‐3p 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用，這些結(jié)果說(shuō)明miR‐143‐3p 是通過(guò)靶向integrin β1 進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用。

綜上，本研究表明，miR‐143‐3p 是肝癌的抑癌因子，其可通過(guò)靶向integrin β1 抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。