犬皮質(zhì)醇檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

孫 寧，付家琳，徐 澍，俞 曦，水映懿，于廣波，朱啟文

（ 1. 中國(guó)刑事警察學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034 ； 2. 安徽省銅陵市公安局，安徽 銅陵 244000 ；3. 大連外國(guó)語(yǔ)大學(xué)，遼寧 大連 116000 ； 4. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院遼寧省行為認(rèn)知重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034 ）

皮質(zhì)醇是大多數(shù)哺乳動(dòng)物（包括犬）的壓力標(biāo)志物，可反映下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的活動(dòng)[1]。大量研究證明了皮質(zhì)醇測(cè)定衡量犬腎上腺皮質(zhì)活動(dòng)的可靠性和實(shí)用性，皮質(zhì)醇在某種程度上已成為評(píng)估犬對(duì)壓力反應(yīng)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，并被認(rèn)為是評(píng)估犬福利狀態(tài)的重要指標(biāo)。皮質(zhì)醇在機(jī)體內(nèi)以化合物和游離的形式存在，血液循環(huán)中大部分皮質(zhì)醇（超過(guò)90%）與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，約80%皮質(zhì)類(lèi)固醇與球蛋白結(jié)合（稱(chēng)為CBG），10%與白蛋白非特異性結(jié)合，余下的5%~10%血漿皮質(zhì)醇以未結(jié)合的生物活性形式循環(huán)，以游離狀態(tài)存在，即游離皮質(zhì)醇。對(duì)壓力應(yīng)激反應(yīng)的血漿皮質(zhì)醇濃度增加主要發(fā)生在游離皮質(zhì)醇，只有游離皮質(zhì)醇才能夠?qū)Π屑?xì)胞發(fā)生作用。

游離皮質(zhì)醇分子小、親脂性強(qiáng)，廣泛存在于身體中各處，因此血液、唾液、尿液、頭發(fā)和糞便均可作為測(cè)量皮質(zhì)醇的介質(zhì)。在血液和唾液中，皮質(zhì)醇變化可在數(shù)分鐘甚至數(shù)秒鐘檢測(cè)到，適合監(jiān)測(cè)短期壓力；糞便和尿液可反映數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天皮質(zhì)醇的分泌狀況；毛發(fā)樣本中皮質(zhì)醇水平可測(cè)量數(shù)周甚至數(shù)月的激素含量，適合監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期壓力。不同介質(zhì)的皮質(zhì)醇測(cè)定存在相關(guān)性，也具有相似之處和相對(duì)可行性。隨著人們對(duì)犬的福利狀況愈發(fā)重視，各種犬皮質(zhì)醇的測(cè)定方法不斷發(fā)展并逐漸完善，犬的皮質(zhì)醇已經(jīng)成為衡量犬壓力的一種可視化檢測(cè)方式。本文通過(guò)國(guó)內(nèi)外對(duì)血漿皮質(zhì)醇、唾液皮質(zhì)醇、糞便皮質(zhì)醇和毛發(fā)皮質(zhì)醇等4種犬皮質(zhì)醇檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行匯總，探究應(yīng)用于犬的皮質(zhì)醇測(cè)定方法，為改善犬的福利以及工作犬的性能提升提供參考。

1 皮質(zhì)醇檢測(cè)方法

1.1 血漿皮質(zhì)醇

早期研究大多測(cè)量血漿中皮質(zhì)醇濃度，現(xiàn)已趨向成熟并得到廣泛應(yīng)用，對(duì)于診斷和監(jiān)測(cè)犬的腎上腺皮質(zhì)功能異常非常重要?；谘簶颖咎崛∑べ|(zhì)醇是傳統(tǒng)的測(cè)定皮質(zhì)醇濃度的方法，因此血漿皮質(zhì)醇測(cè)量被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，不僅用于評(píng)估壓力反應(yīng)，也被視為判斷其他樣本介質(zhì)皮質(zhì)醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)。采集血液樣本具有方便、快捷的特點(diǎn)，能夠即時(shí)地反映特定狀態(tài)下機(jī)體的皮質(zhì)醇濃度。但血液取樣存在一定局限性，取樣過(guò)程中所采取的對(duì)犬的約束和處理可能成為壓力源本身，從而影響皮質(zhì)醇濃度；采用靜脈抽血等損傷性手段本身會(huì)對(duì)動(dòng)物造成不同程度的傷害；檢材的采集、保存要求較高。因此，目前多采用侵入性較小的措施檢測(cè)機(jī)體內(nèi)皮質(zhì)醇濃度。

1.1.1 樣本采集

1.1.1.1 采集時(shí)間點(diǎn)（與刺激源的時(shí)間差）

一般在壓力源發(fā)生10~20 min 后采血，確定該采集時(shí)間是因?yàn)槿浩べ|(zhì)醇濃度遇到壓力源后約20 min 達(dá)到峰值，在噪音刺激開(kāi)始后約11 min 達(dá)到峰值，30 min 后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。人類(lèi)遇到壓力源后20~40 min 達(dá)到峰值，具體的精準(zhǔn)時(shí)間取決于壓力持續(xù)時(shí)間和壓力性質(zhì)。

1.1.1.2 采集方法

犬頭靜脈靜脈采血3~4 mL，血樣收集到含肝素或EDTA 的試管，立即將樣品置于冰上，離心收集血漿，-20 ℃儲(chǔ)存直至分析。采血時(shí)間應(yīng)盡量快，以確保皮質(zhì)醇水平不會(huì)因采血過(guò)程的刺激而升高。整個(gè)采樣過(guò)程需在2 min內(nèi)完成，避免影響唾液皮質(zhì)醇結(jié)果。

1.1.2 保存

采集后樣品應(yīng)立即送檢，不宜長(zhǎng)期保存，原因是標(biāo)本在離體環(huán)境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，血清中的皮質(zhì)醇濃度或活性可能降低。盡管室溫條件下犬血漿中的皮質(zhì)醇具有穩(wěn)定性[1]，但在-20 ℃或更低的溫度下冷凍血清或血漿是一種理想的儲(chǔ)存方法。此外，儲(chǔ)存過(guò)程中要避免反復(fù)凍融，商業(yè)ELISA試劑盒手冊(cè)明確警告避免凍融循環(huán)，因?yàn)榉磸?fù)凍融樣品可能會(huì)影響血清或血漿中激素的穩(wěn)定性。

1.1.3 測(cè)定方法

犬皮質(zhì)醇的檢測(cè)方法常使用放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）等方法，以EIA 中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）被廣泛使用。目前測(cè)定皮質(zhì)醇通常使用商業(yè)試劑盒，可用于檢測(cè)血液、糞便、唾液、尿液中的皮質(zhì)醇濃度。

1.2 唾液皮質(zhì)醇

在犬類(lèi)研究中使用唾液皮質(zhì)醇很普遍，雖然血液和唾液均可作為犬急性應(yīng)激的壓力標(biāo)志物，但通常認(rèn)為唾液皮質(zhì)醇測(cè)量是一種比血漿皮質(zhì)醇更好的方法，因?yàn)橥僖翰蓸酉鄬?duì)簡(jiǎn)單、非侵入性，故經(jīng)常用于犬監(jiān)測(cè)短期壓力變化。唾液能夠最準(zhǔn)確地反映腎上腺皮質(zhì)反應(yīng)，主要原因是唾液皮質(zhì)醇濃度直接受血漿中游離皮質(zhì)醇濃度的影響，唾液中的皮質(zhì)醇基本是血漿游離皮質(zhì)醇在唾液腺腔腺泡細(xì)胞中被動(dòng)擴(kuò)散的結(jié)果[2]。皮質(zhì)醇從血漿到唾液的轉(zhuǎn)移非常迅速（<2 min），靜脈注射的皮質(zhì)醇不到1 min 就會(huì)出現(xiàn)在唾液中。犬唾液皮質(zhì)醇濃度與血漿濃度存在強(qiáng)烈的正相關(guān)性[3]。但唾液采樣的一個(gè)潛在缺點(diǎn)是唾液皮質(zhì)醇濃度遠(yuǎn)低于血液，因此，測(cè)定唾液皮質(zhì)醇需要采用比測(cè)定血漿皮質(zhì)醇更靈敏或更合適的測(cè)量技術(shù)以及更多的唾液采集量。

1.2.1 樣本采集

1.2.1.1 采集量

唾液皮質(zhì)醇濃度通常約為血漿濃度的7%~10%，因而用于測(cè)定的唾液量需為血漿皮質(zhì)醇測(cè)量的10倍以上，過(guò)少的樣品會(huì)導(dǎo)致從吸收性材料中提取的皮質(zhì)醇過(guò)低。為保證結(jié)果有效性，建議盡量采集多量樣本，一般檢測(cè)方法只需25 μL唾液即可進(jìn)行皮質(zhì)醇測(cè)定。

1.2.1.2 采集方法

唾液采樣的方式各有不同，包括犬咀嚼拭子、拭子在犬口腔內(nèi)保持不動(dòng)或在不同位置（舌頭、牙齦、硬腭、頰部）摩擦。文獻(xiàn)報(bào)道了多種收集犬唾液的方法，但尚未確定一種標(biāo)準(zhǔn)操作。犬不喜歡口腔內(nèi)的收集物，收集到的犬唾液量不足，為克服這個(gè)問(wèn)題已嘗試了幾種刺激犬唾液分泌的方法。食物引誘方法刺激唾液分泌很方便，如給犬嗅聞奶酪或采用乙酸、蔗糖、氯化鈉、牛肉味棉簽[4]等。使用檸檬酸刺激犬唾液分泌是使用最廣泛的方法，可將一些檸檬酸顆粒灑在犬的舌頭上或用浸過(guò)檸檬酸的棉簽擦拭犬的口腔和牙齦[5]。具體方法為：收集唾液前用浸有5%檸檬酸的棉簽擦拭犬的口腔，將海綿放入口腔1 min后取出，能夠吸收100~1 000 μL唾液。

但由于犬的唾液具有保護(hù)個(gè)體免受酸性物質(zhì)侵害的緩沖作用，采用檸檬酸鈉顆粒刺激唾液分泌會(huì)影響唾液皮質(zhì)醇濃度。研究表明，僅0.1 g/mL的檸檬酸即可引起唾液pH 值顯著下降，唾液皮質(zhì)醇濃度顯著升高。最近研究表明，蘸有生姜的棉簽可強(qiáng)烈刺激犬唾液分泌，收集時(shí)間僅30 s（訓(xùn)練有素的獸醫(yī)也很難將棉簽放在犬口腔堅(jiān)持2 min），可采集到足夠量的唾液（>400 μL）[6]。

1.2.1.3 采集材料

采集材料也是影響能否收集到足夠唾液的重要因素，采樣過(guò)程中不僅要吸收大量唾液，還應(yīng)能夠回收所吸收的唾液。從犬的口腔中收集唾液的采集材料最常用的有紗布、海綿、棉簽、繩子等；較常用的方法是濾紙法，一般將濾紙放置犬舌下或口腔內(nèi)，直到唾液徹底浸透濾紙。但從濾紙?zhí)崛∑べ|(zhì)醇的過(guò)程較煩瑣，需用乙醚從濾紙上提取皮質(zhì)醇，再用二乙醚溶解、離心、蒸發(fā)、二次蒸發(fā)、加緩沖液等[7]，且樣品蒸發(fā)耗時(shí)，乙醚具有副作用和毒性，需要特殊準(zhǔn)備防毒面具、化學(xué)防濺鏡等實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)設(shè)備。

一些報(bào)告稱(chēng)，棉質(zhì)材料唾液的回收率相對(duì)較低，尤其是在從犬口腔里吸收的唾液量低的情況下。而使用聚酯纖維對(duì)吸收唾液的效果較好，能夠收集唾液的（54.7±2.3）%，在離心后可以回收（95.8±1.1）%的唾液[8]。但也有報(bào)道，用棉拭子或聚酯拭子獲取犬的唾液量無(wú)差異。近年來(lái)，眼海綿被認(rèn)為是一種有效收集唾液用于成年人皮質(zhì)醇測(cè)定的新材質(zhì)，柔軟無(wú)味，可收集足夠的唾液進(jìn)行皮質(zhì)醇測(cè)定。現(xiàn)已有市售配套棉或聚酯拭子的特殊試管。

1.2.1.4 采集時(shí)間點(diǎn)（與刺激源的時(shí)間差）

目前關(guān)于唾液取樣的理想時(shí)間存在一些爭(zhēng)議。與血液相比，唾液皮質(zhì)醇濃度峰值出現(xiàn)時(shí)間稍有延遲，Beerda等[9]卻檢測(cè)到唾液皮質(zhì)醇濃度峰值與血漿相比沒(méi)有延遲。產(chǎn)生差異的原因可能在于是否將全血清或血漿濃度與唾液進(jìn)行比較，因?yàn)橥僖簝H含有皮質(zhì)醇的游離部分。有研究顯示，與血液中皮質(zhì)醇的峰值濃度相比，唾液中的皮質(zhì)醇峰值濃度滯后不到2~3 min[10]。因此一般在壓力刺激21~23 min后開(kāi)始采集，此時(shí)唾液濃度達(dá)到峰值。

1.2.1.5 采集時(shí)間

與采集的要求相似，整個(gè)采樣過(guò)程需在4 min內(nèi)完成。大部分研究認(rèn)為采樣時(shí)間應(yīng)為30~60 s，犬能夠保持安靜和配合，但也有部分犬在采樣過(guò)程中煩躁不安，取樣斷斷續(xù)續(xù)。一般采集拭子固定在口腔中的一處停留而非反復(fù)摩擦（這可能使犬更興奮），采樣比較快速而順利。

1.2.2 提取和保存

不同研究中樣本的離心條件差異較大[8]，如離心速率2 800~4 000 r/min，離心時(shí)間0~45 min，離心后保存條件為冷凍-20 ℃或-80 ℃。唾液中的皮質(zhì)醇相對(duì)穩(wěn)定，可在室溫下放置數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天，但樣品細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)降解皮質(zhì)醇，因此應(yīng)在收集后盡快冷凍樣本。唾液含有黏蛋白，在測(cè)定前冷凍樣品和離心（12 000 r/min 離心10 min）可降低唾液樣品的黏度，使其更容易移液，也能夠避免可能存在的顆粒物質(zhì)（如食物殘?jiān)┑奈廴尽?/p>

1.2.3 測(cè)定方法

樣品在室溫下解凍，6 000 r/min 離心10~20 s，使用移液器從離心管底部收集唾液。由于皮質(zhì)醇的唾液濃度通常比血漿濃度低10倍，若使用血漿或血清的商業(yè)試劑盒需要調(diào)整以適應(yīng)唾液皮質(zhì)醇。

1.3 糞便皮質(zhì)醇

糞便皮質(zhì)醇其實(shí)是糞便皮質(zhì)醇代謝物（FCM）。因?yàn)槠べ|(zhì)醇在肝臟中代謝快，其代謝物通過(guò)膽汁排泄到腸道中，糞便中無(wú)法發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇本身，因此使用FCM測(cè)量腎上腺皮質(zhì)的活動(dòng)[11]，本文中暫且稱(chēng)為糞便皮質(zhì)醇。

糞便皮質(zhì)醇測(cè)定具有很多優(yōu)點(diǎn)，如糞便可很容易地在不侵?jǐn)_犬的情況下在犬舍和自然環(huán)境中采集，采樣程序?qū)y(cè)量的皮質(zhì)醇濃度無(wú)影響。此外，與采集血樣相比，糞樣中的皮質(zhì)醇變化具有長(zhǎng)期特征，可反映某個(gè)時(shí)間段內(nèi)（犬為20~28 h[12]）的平均皮質(zhì)醇濃度，而非某一時(shí)刻的脈沖值，不受某一時(shí)間點(diǎn)的應(yīng)激條件影響。此外，糞便可長(zhǎng)期、連續(xù)地采集，對(duì)于研究某些生理特征及動(dòng)態(tài)是一種便捷有效的非損傷性方法，利于對(duì)犬的生理狀況進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

但糞便皮質(zhì)醇濃度受諸多因素影響，包括在肝臟中的代謝、通過(guò)胃腸道的時(shí)間、細(xì)菌分解、食糜質(zhì)量、食材類(lèi)型以及樣本收集、保存程序。因此，糞便樣本收集和儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)τ跈z測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。

1.3.1 樣本采集

1.3.1.1 采集時(shí)間點(diǎn)（與刺激源的時(shí)間差）

皮質(zhì)醇在糞便中的代謝有滯后性，即應(yīng)激的發(fā)生與糞便中出現(xiàn)皮質(zhì)醇代謝物之間存在滯后時(shí)間，糞便的采集時(shí)間需依據(jù)滯后時(shí)間方可相對(duì)精準(zhǔn)地與應(yīng)激壓力源對(duì)應(yīng)。正常情況下，糞便皮質(zhì)醇與血液皮質(zhì)醇濃度正相關(guān)，但二者會(huì)呈現(xiàn)分泌高峰時(shí)間不一致的現(xiàn)象。因?yàn)檠褐械钠べ|(zhì)醇在肝臟與蛋白相結(jié)合，以代謝物的形式經(jīng)腎進(jìn)入尿液排出或經(jīng)膽汁進(jìn)入腸道通過(guò)糞便排出，在腸道階段激素又可被重吸收進(jìn)入肝腸循環(huán)，整個(gè)過(guò)程使糞便中的皮質(zhì)醇濃度滯后于血漿皮質(zhì)醇濃度。使用放射性皮質(zhì)類(lèi)固醇示蹤劑（如14C-皮質(zhì)醇）能夠準(zhǔn)確地確定滯后時(shí)間。Schatz等[13]研究了犬的14C-皮質(zhì)醇的代謝，犬糞便中皮質(zhì)醇激素的峰值發(fā)生在（24±4） h后，在48 h后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。

1.3.1.2 采集量

一般檢測(cè)需要糞便0.2~0.5 g，但也有報(bào)告稱(chēng)樣本量小于0.05 g時(shí)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生偏差[14]。

1.3.2 保存

糞便中含有大量微生物，若不及時(shí)處理，糞樣中類(lèi)固醇激素的代謝產(chǎn)物會(huì)被自身及外界的微生物分解，樣品保存應(yīng)做適當(dāng)處理以減少影響，比如冷凍、冷凍干燥、加熱干燥、二氧化硅干燥或儲(chǔ)存在乙醇（90%~95%）、福爾馬林（10%）、乙酸（2%）和氫氧化鈉（2%）中。因?yàn)樗畷?huì)支持細(xì)菌酶的活性，為盡量減少由于細(xì)菌作用導(dǎo)致的糞便樣本變化，樣品最好是排便后盡早收集，采集后立即冷凍、凍干，-20 ℃儲(chǔ)存直至分析。此外，如果冷凍樣品在40 ℃下緩慢解凍，與在95 ℃下更快解凍相比，皮質(zhì)醇濃度會(huì)增加。

1.3.3 提取

糞便代謝物是幾種具有不同極性的代謝物的混合物，在皮質(zhì)醇測(cè)定之前需要進(jìn)行提取。到目前為止，甲醇對(duì)皮質(zhì)醇的提取率最高。Farca 等[15]分別用二乙醚和甲醇提取犬的糞便皮質(zhì)醇，二乙醚和甲醇提取物的回收率分別為（23.2±2.0）%和（89.0±6.0）%。提取犬糞便皮質(zhì)醇方法推薦的程序是：冷凍糞便在37 ℃培養(yǎng)箱中干燥72 h，因皮質(zhì)類(lèi)固醇在糞便中分布不均勻，故再將干糞便樣本粉碎均勻。提取時(shí)首先稱(chēng)量一定質(zhì)量的均質(zhì)糞便（如0.5 g），用固定體積的80% 甲醇（如5 mL）萃取，振蕩30 min，2 500 r/min離心15 min后取上層清液待測(cè)定。

1.3.4 測(cè)定方法

提取后，將樣品離心20 min，取1 mL 上清液在空氣流下干燥。首先加入50 μL 的100%乙醇，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液PBS，對(duì)干燥的提取物進(jìn)行復(fù)溶，等待測(cè)定。有研究表明，犬糞便代謝物中的皮質(zhì)醇EIA最適合監(jiān)測(cè)腎上腺皮質(zhì)活動(dòng)的變化[16]。

1.4 毛發(fā)皮質(zhì)醇

毛發(fā)皮質(zhì)醇測(cè)定是一種近年流行的壓力生物標(biāo)志物評(píng)估方法。毛發(fā)采集非侵入性，取樣輕松，價(jià)格低廉，材料來(lái)源豐富，還可常溫保存至數(shù)月甚至數(shù)年，具備比其他皮質(zhì)醇測(cè)定方法更多優(yōu)勢(shì)。如毛發(fā)皮質(zhì)醇比血漿和唾液皮質(zhì)醇測(cè)量的侵入性更??；比血漿、糞便或唾液中的皮質(zhì)醇更能夠指示長(zhǎng)期或慢性壓力源，血漿、唾液和糞便評(píng)估的是1 d 內(nèi)的急性應(yīng)激源，而毛發(fā)中的皮質(zhì)醇含量會(huì)隨著毛發(fā)的毛囊生長(zhǎng)反映前幾周至幾個(gè)月的壓力活動(dòng)，能夠評(píng)估犬的慢性壓力水平；毛發(fā)采樣比唾液或糞便更省力，唾液和糞便皮質(zhì)醇需要在多個(gè)時(shí)間段收集更多的樣本，而且4個(gè)糞便樣本才能夠達(dá)到1個(gè)毛發(fā)樣本相同的可重復(fù)性水平，避免了重復(fù)采樣，結(jié)果更穩(wěn)定。

與唾液、糞便等中的皮質(zhì)醇相比，毛發(fā)中的皮質(zhì)醇濃度不易受到晝夜節(jié)律、個(gè)體本身或外界一些因素的影響。Bennett等[17]報(bào)道，年齡、品種、體重或絕育對(duì)犬毛發(fā)皮質(zhì)醇無(wú)顯著影響，支持了毛發(fā)皮質(zhì)醇成為比較個(gè)體特征（如對(duì)慢性壓力的恢復(fù)力）的工具。頭發(fā)皮質(zhì)醇在取樣、測(cè)量和分析等方面的優(yōu)勢(shì)確保了其應(yīng)用于慢性壓力研究的可靠性。雖然毛發(fā)樣本是一種量化長(zhǎng)期皮質(zhì)醇濃度的實(shí)用且有效的方法，但皮質(zhì)醇進(jìn)入毛發(fā)的機(jī)制尚不完全清楚。目前普遍被接受的是由Vassiliki 等[18]提出的假說(shuō)，認(rèn)為游離皮質(zhì)醇會(huì)通過(guò)血液運(yùn)輸穿過(guò)毛細(xì)血管壁，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散到毛囊并摻入毛干的角蛋白基質(zhì)中，再沿著發(fā)軸生長(zhǎng)方向擴(kuò)散運(yùn)輸至發(fā)梢部位。一些研究表明，犬的毛發(fā)顏色會(huì)影響皮質(zhì)醇濃度，黑色犬的毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度較低，深色毛發(fā)的皮質(zhì)醇濃度低于淺色毛發(fā)，有時(shí)同一頭犬身上不同顏色的皮質(zhì)醇濃度也存在差異。目前認(rèn)為原因是犬的黑色毛發(fā)中含有黑色素，黑色素與皮質(zhì)醇等中性化合物結(jié)合較少。

最有爭(zhēng)議的是毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度是否隨著毛發(fā)的生長(zhǎng)而變化，有研究表明，犬緊貼皮膚處（新生毛發(fā)）和毛末端（舊毛發(fā)）皮質(zhì)醇濃度無(wú)差異。盡管犬毛發(fā)皮質(zhì)醇檢測(cè)相對(duì)處于起步階段，但犬的毛發(fā)與唾液和糞便皮質(zhì)醇濃度之間的正相關(guān)性已得到證明。Mack等[19]對(duì)從犬指甲和毛發(fā)樣本中測(cè)量的皮質(zhì)醇進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種方法存在顯著正相關(guān)。毛發(fā)皮質(zhì)醇測(cè)定是衡量犬慢性壓力的非常的潛力的評(píng)估方法。但目前毛發(fā)皮質(zhì)醇的研究仍處于不成熟的階段，需要深入研究。

1.4.1 樣本采集

1.4.1.1 采集部位

人類(lèi)的頭發(fā)采樣部位比較一致，位置在腦后頂點(diǎn)，取樣盡可能接近頭皮。犬的采樣部位多為薦部（坐骨區(qū)）、肩部、胸部（劍突區(qū)）和腿部（內(nèi)側(cè)），同一只犬的左肩和右肩采樣的毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度沒(méi)有差異。

1.4.1.2 采集量及采集方法

一般使用電動(dòng)剃須刀或剪刀采集犬毛發(fā)，皮質(zhì)醇分析需約250 mg的毛發(fā)（最少7~50 mg）。采集毛發(fā)時(shí)，對(duì)于是否帶有毛囊連根拔起盡管還存有疑議，但大部分研究的毛發(fā)樣本中均不含毛囊。Gow等[20]建議不要拔毛，認(rèn)為拔毛會(huì)帶有毛囊，毛囊中的皮質(zhì)醇可能會(huì)混淆毛干中皮質(zhì)醇的濃度。毛囊本身會(huì)在局部產(chǎn)生皮質(zhì)醇，與下丘腦-垂體-腎上腺軸全身應(yīng)激反應(yīng)相協(xié)調(diào)合成皮質(zhì)醇[21]。

1.4.2 清洗

在檢測(cè)前清洗毛發(fā)樣本是一種很好的做法，旨在去除毛發(fā)外部的污染物。在不影響內(nèi)部皮質(zhì)醇濃度的情況下，使用異丙醇清洗2 次，每次洗滌3 min 是去除污染源的最有效方法[22]。這種預(yù)提取洗滌程序已被許多研究采用，具體方法是：稱(chēng)重250 mg頭發(fā)樣品，置入15 mL聚丙烯管中，加入5 mL異丙醇，輕輕搖動(dòng)試管3 min清洗。該程序重復(fù)2次，在室溫下干燥毛發(fā)樣品7 d。

1.4.3 剪碎/研磨

為增加從毛干中提取皮質(zhì)醇的比例，大部分研究在測(cè)定前將毛發(fā)剪碎或研磨。毛發(fā)皮質(zhì)醇的提取取決于頭發(fā)的粒度，粒度越高，提取的皮質(zhì)醇的濃度就越高。剪碎是指將毛發(fā)的長(zhǎng)度精細(xì)切割至約1 mm，檢測(cè)結(jié)果差異性較大；而研磨則用球磨機(jī)產(chǎn)生細(xì)粉和均質(zhì)的毛發(fā)顆粒，皮質(zhì)醇水平是剪碎毛發(fā)的3.5 倍，可最大限度地提高皮質(zhì)醇的提取量。因此，研磨頭發(fā)是毛發(fā)皮質(zhì)醇制備的優(yōu)選方法。具體方法是：將50 mg 的毛發(fā)樣品精細(xì)切成小段（>1~2 mm），使用球磨機(jī)（30~50 Hz，8~10 min）研磨成粉末。

1.4.4 提取

測(cè)定前必須采用有機(jī)溶劑提取毛發(fā)角蛋白基質(zhì)中的皮質(zhì)醇。提取通常包括將毛發(fā)粉末或片段與甲醇混合，室溫和50 ℃之間孵育過(guò)夜至24 h。具體方法是將毛發(fā)樣品浸入1.5 mL 的無(wú)水甲醇中（20 ℃，24 h），3 000×g 離心5 min，吸取0.6 mL 上清液，置于培養(yǎng)箱中孵育（50 ℃，18 h），干燥以蒸發(fā)甲醇，加入試劑盒中提供的0.2~0.4 mL緩沖液[23]。

1.4.5 測(cè)定

與唾液皮質(zhì)醇的方法相似，毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度通常很低，所以測(cè)定靈敏度是測(cè)定的關(guān)鍵。液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）在犬毛發(fā)皮質(zhì)醇測(cè)定中經(jīng)常使用，確定犬毛中是否存在皮質(zhì)醇的“金標(biāo)準(zhǔn)”。2004年，Raul等[24]使用LC-MS/MS報(bào)告了人類(lèi)頭發(fā)中的皮質(zhì)醇。Bryan等[25]使用了LC-MS/MS 測(cè)量犬毛中的皮質(zhì)醇。具體方法為提取100 mg 毛發(fā)粉末樣品，用20 μL 氘代皮質(zhì)醇作為內(nèi)標(biāo)（每次進(jìn)樣800 pg），與甲醇混合，并在室溫和50 °C 之間孵育過(guò)夜，加入50 μL 甲醇和50 μL 水復(fù)溶，14 000×g 離心10 min，提取40 μL注入LC-MS/MS系統(tǒng)。

2 影響皮質(zhì)醇測(cè)定的因素

皮質(zhì)醇檢測(cè)結(jié)果受個(gè)體差異、檢測(cè)方法程序和具體環(huán)境等因素的影響。因?yàn)槠べ|(zhì)醇反應(yīng)通過(guò)復(fù)雜的途徑調(diào)節(jié)，受到個(gè)體差異、晝夜節(jié)律波動(dòng)以及壓力源強(qiáng)度和以往經(jīng)歷等諸多因素的影響，需要在犬皮質(zhì)醇測(cè)定中加以考慮，以增加檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2.1 晝夜節(jié)律

在人類(lèi)和其他一些哺乳動(dòng)物中，皮質(zhì)醇濃度會(huì)受到晝夜節(jié)律波動(dòng)的影響，尤其是對(duì)急性壓力更為敏感的血液皮質(zhì)醇、唾液皮質(zhì)醇。在非壓力條件下，健康成年人在早晨血漿皮質(zhì)醇濃度最高，之后逐漸降低至午夜時(shí)最低，犬是否存在皮質(zhì)醇晝夜波動(dòng)規(guī)律尚未達(dá)成共識(shí)。

一些研究發(fā)現(xiàn)了犬皮質(zhì)醇晝夜變化的證據(jù)，如Palazzolo[26]的研究認(rèn)為，成年犬的血漿皮質(zhì)醇中存在晝夜節(jié)律，但在老年犬血漿中未檢測(cè)到24 h 內(nèi)存在顯著變化，幼犬中不存在血漿皮質(zhì)醇的晝夜節(jié)律。杜鳳鳴等[27]發(fā)現(xiàn)，犬8：00時(shí)血漿皮質(zhì)醇濃度最高，12：00、16：00、20：00:逐漸下降，24：00最低，翌日4：00回升，8：00再次升至最高。

但更多的研究表明，犬血漿中可能根本不存在這種晝夜模式。有研究指出，犬似乎沒(méi)有明顯的晝夜皮質(zhì)醇節(jié)律，在24 h 內(nèi)每小時(shí)測(cè)量比格犬，并未發(fā)現(xiàn)犬唾液皮質(zhì)醇濃度之間的差異[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，每日3 次采集結(jié)果顯示犬唾液皮質(zhì)醇沒(méi)有出現(xiàn)系統(tǒng)性的晝夜節(jié)律差異。在持續(xù)30 d，每隔20 min 采集一次血漿的試驗(yàn)中，皮質(zhì)醇濃度晝夜節(jié)律均不明顯[28]。

無(wú)論犬的皮質(zhì)醇濃度是否存在晝夜波動(dòng)，每天犬正?；顒?dòng)時(shí)的皮質(zhì)醇濃度波動(dòng)確實(shí)會(huì)發(fā)生，如運(yùn)動(dòng)或其他體力消耗等，均為正常應(yīng)對(duì)應(yīng)激的腎上腺激素釋放，可采用測(cè)量長(zhǎng)期壓力的毛發(fā)皮質(zhì)醇檢測(cè)方法消除1 d中皮質(zhì)醇濃度自然波動(dòng)的影響。

2.2 個(gè)體差異

犬類(lèi)對(duì)于壓力在行為和生理上的反應(yīng)，在個(gè)體間差異很大。即使是同一品種的不同個(gè)體，也可能由于性別、年齡、健康、氣質(zhì)、過(guò)去經(jīng)歷等因素影響到皮質(zhì)醇反應(yīng)。

2.2.1 年齡差異

年齡對(duì)犬皮質(zhì)醇濃度的影響不可忽視，然而關(guān)于年齡和皮質(zhì)醇濃度的關(guān)系尚未得到廣泛證實(shí)，仍然存在不少爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為，小于6月齡幼犬的皮質(zhì)醇濃度低于成年犬及大于8歲的老年犬[29]。Sandri等[30]的研究中統(tǒng)計(jì)分析了不同年齡的犬的皮質(zhì)醇濃度，結(jié)果顯示，老年犬的唾液中皮質(zhì)醇濃度更高。Rothuizen等[31]研究結(jié)果顯示，犬血液中的皮質(zhì)醇濃度隨著年齡呈周期性的增長(zhǎng)。Jamie等[32]的研究顯示，犬的性格隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)逐漸穩(wěn)定，對(duì)刺激的生理和心理反應(yīng)也會(huì)趨于穩(wěn)定，年齡大的犬對(duì)壓力可能會(huì)表現(xiàn)較低的皮質(zhì)醇反應(yīng)。但在Mongillo 等[33]的試驗(yàn)中卻沒(méi)有觀(guān)察到犬的血漿皮質(zhì)醇濃度在成年前和成年后存在明顯的變化。因此在分析研究中應(yīng)盡量避免年齡的差異給犬帶來(lái)的干擾，不應(yīng)將年齡差異較大的犬皮質(zhì)醇濃度進(jìn)行匯總或直接比較。

2.2.2 品種差異

犬的種屬特異性可能會(huì)影響犬對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)性，不同品種個(gè)體的應(yīng)激反應(yīng)可能不同。同一條件下，羅威納犬和德國(guó)牧羊犬的唾液皮質(zhì)醇濃度明顯高于杜賓犬和比利時(shí)牧羊犬，羅威納犬表現(xiàn)出刻板行為的次數(shù)更高[34]。不同氣質(zhì)類(lèi)型的犬對(duì)外界刺激的反映程度也存在差異，皮質(zhì)醇濃度變化也存在差異，越膽小的犬可能越需要更長(zhǎng)的時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境帶來(lái)的焦慮和壓力，高濃度皮質(zhì)醇也可能因此持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間。由于犬之間的個(gè)體差異，建議盡可能統(tǒng)一其他潛在的變異來(lái)源，如年齡、性別、絕育、氣質(zhì)和以前的經(jīng)歷等因素。此外，保證足夠的樣本量對(duì)于彌補(bǔ)犬的個(gè)體差異也很必要。

2.2.3 各種測(cè)定方法的差異

各種方法測(cè)定犬皮質(zhì)醇的有效性在試驗(yàn)中已得到驗(yàn)證，盡管不同方法測(cè)定的皮質(zhì)醇濃度存在很強(qiáng)的相關(guān)性，但不同方法中的數(shù)值差別較大。同一只犬在同一條件下，糞便皮質(zhì)醇濃度為（363.0±12.9） ng/g，唾液皮質(zhì)醇濃度為（1.42±0.06） μg/L，毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度為（11.6±0.8） ng/g[35]。采用同一檢測(cè)方法，采樣、提取和儲(chǔ)存方法及檢測(cè)程序不同時(shí)，測(cè)量濃度范圍也存在顯著差異[36-37]。如測(cè)量毛發(fā)皮質(zhì)醇濃度時(shí)，Bryan等[25]研究測(cè)得濃度為11.6 ng/g，有相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（分別為10.9 ng/g 和9.8 ng/g），也存在差異較大的結(jié)果（2.10 ng/g）。此外，皮質(zhì)醇濃度各介質(zhì)的度量單位常表示為：毛發(fā)（ng/g），唾液（μg/L 或nmol/L），糞便（ng/g），血漿（nmol/L或μg/L）；單位換算關(guān)系是：1 nmol/L=0.362 47 μg/L（皮質(zhì)醇分子量為362.47）。各文獻(xiàn)中使用的皮質(zhì)醇濃度單位并不統(tǒng)一，故有必要對(duì)皮質(zhì)醇濃度統(tǒng)一單位，便于比較研究。

目前，皮質(zhì)醇檢測(cè)方法仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的程序和對(duì)比試驗(yàn)，因此采用各種檢測(cè)方法之間進(jìn)行交互的方法學(xué)驗(yàn)證非常有必要，《免疫測(cè)定手冊(cè)》可作為測(cè)定開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的指南[38]。除了方法學(xué)驗(yàn)證外，還可采取生物學(xué)驗(yàn)證。生物驗(yàn)證有時(shí)被認(rèn)為是對(duì)自然壓力源的反應(yīng)，有時(shí)是對(duì)腎上腺皮質(zhì)活動(dòng)的藥理操作（如外源性促腎上腺皮質(zhì)激素）的反應(yīng)。在實(shí)踐中可結(jié)合犬暴露在各種壓力源下的反應(yīng)，如噪音、新環(huán)境、運(yùn)輸、惡劣條件等壓力源，測(cè)量犬的皮質(zhì)醇濃度變化，評(píng)估壓力反應(yīng)與皮質(zhì)醇濃度的相應(yīng)性，以犬的壓力反應(yīng)驗(yàn)證皮質(zhì)醇檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)皮質(zhì)醇的檢測(cè)用以評(píng)估和提高犬福利狀態(tài)的終極目的。

3 結(jié)論

綜上所述，各種測(cè)量皮質(zhì)醇的檢測(cè)方法各具特點(diǎn)，其有效性在試驗(yàn)中已得到驗(yàn)證。本文對(duì)血漿皮質(zhì)醇、唾液皮質(zhì)醇、糞便皮質(zhì)醇和毛發(fā)皮質(zhì)醇等4種犬皮質(zhì)醇檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及每種檢測(cè)方法的采集、提取、測(cè)定等進(jìn)行綜述。皮質(zhì)醇檢測(cè)應(yīng)用于評(píng)估犬壓力的研究方興未艾，該領(lǐng)域需要進(jìn)一步深入探索，建議犬皮質(zhì)醇檢測(cè)結(jié)果可采用方法學(xué)和生物學(xué)驗(yàn)證，采用犬的壓力反應(yīng)驗(yàn)證皮質(zhì)醇檢測(cè)結(jié)果，以驗(yàn)證皮質(zhì)醇作為評(píng)價(jià)動(dòng)物福利的可靠指標(biāo)，更精準(zhǔn)地評(píng)估和提高犬福利狀態(tài)。