發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立

趙興坤， 孫 昊， 楊麗云， 羅麗娟*， 劉攀道

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 農(nóng)業(yè)部華南作物 基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室， 海南 ?？?571101)

柱花草屬(StylosanthesSw.)植物屬于豆科蝶形花亞科，全屬約有50個種，遺傳多樣性豐富，分布于美洲、非洲和東南亞，其起源中心為巴西和墨西哥[1]。圭亞那柱花草(S.guianensis)是目前世界范圍內(nèi)栽培面積最大的柱花草屬植物，在熱帶與亞熱帶地區(qū)，既可作為物草種植，也可作為綠肥作物種植，用于提升土壤肥力和防止水土流失[2]。圭亞那柱花草最早由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院于20世紀(jì)八十年代引入我國，主要用作幼齡橡膠園的覆蓋作物[3]。隨后，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院又陸續(xù)從國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)引進(jìn)了圭亞那柱花草種質(zhì)200余份，并利用這些種質(zhì)為親本培育了11個圭亞那柱花草的國家審定牧草品種，這些品種在海南、云南、貴州、廣西、廣東等省區(qū)已累計推廣30多萬公頃，圭亞那柱花草已成為我國最重要的熱帶豆科牧草之一[4]。圭亞那柱花草相較于其他柱花草屬植物具有產(chǎn)量高、粗蛋白含量高、飼用品質(zhì)好、對酸性土壤逆境脅迫(低磷、鋁毒害、錳毒害)的適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，也存在莖稈匍匐、抗寒性低、落粒性強(qiáng)缺點(diǎn)，因此，利用與近緣種雜交的方式對圭亞那柱花草進(jìn)行改良是今后柱花草育種的主要目標(biāo)[7]。

細(xì)莖柱花草(S.gracilis)在植物分類學(xué)上原被歸為圭亞那柱花草的變種(S.guianensisvar. gracilis)，后來被認(rèn)定為一個新種[8]。細(xì)莖柱花草與圭亞那柱花草在基因組分型上均為GG型二倍體種，在目前發(fā)現(xiàn)的柱花草屬植物中兩者親緣關(guān)系最近，可種間雜交(無生殖隔離)[9]。作為圭亞那柱花草的野生近緣種，細(xì)莖柱花草因產(chǎn)量低、易感炭疽病、木質(zhì)化程度高等缺點(diǎn)，未被馴化選育成牧草品種用于生產(chǎn)利用。但是，細(xì)莖柱花草也具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，如抗旱能力較強(qiáng)、種子產(chǎn)量高(落粒性低)、莖稈直立利于機(jī)械化收割等特點(diǎn)。因此，細(xì)莖柱花草可作為改良現(xiàn)有柱花草品種的理想材料。

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤中，早在20世紀(jì)初科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)一部分植物產(chǎn)生毛狀根，其攜帶Ri質(zhì)粒中的T-DNA片段進(jìn)入植物細(xì)胞并整合進(jìn)植物基因組中，能刺激植物產(chǎn)生大量的毛狀根，且產(chǎn)生的毛狀根均由單個的細(xì)胞發(fā)育而來，遺傳性狀穩(wěn)定，無嵌合體[10-11]。毛狀根轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在多種植物中被廣泛應(yīng)用，本文旨在利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，建立一種適用于細(xì)莖柱花草的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，為今后的柱花草屬植物的基因功能研究及生物育種提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料與試劑 本研究使用的細(xì)莖柱花草種子材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。GFP抗體、山羊抗兔IgG-HRP抗體均采購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.2菌株與質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌ArQua1，K599，MSU440，C58C1和大腸桿菌DH5α均采購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；pEGAD為常見的雙元載體，該載體含有綠色熒光蛋白報告基因(GFP)，由本實驗室保存并提供。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株的選擇和活化 選取4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ArQua1、K599、MSU440、C58C1進(jìn)行試驗。將4種發(fā)根農(nóng)桿菌在含有50 mg·L-1鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單菌落分別接種于含有鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃下200 r·min-1培養(yǎng)12 h。取500 μL菌液轉(zhuǎn)移至50 mL含有鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1培養(yǎng)菌液OD600至0.9，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，使用不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基重懸菌體，菌液用于侵染細(xì)莖柱花草外植體。

1.2.2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌 采用凍融法將pEGAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440感受態(tài)。取500 ng質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)中混勻，冰上靜置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min，加入500 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃震蕩培養(yǎng)2 h，吸取100 μL菌液涂布于含有50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素的LB固體平板上28℃培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR鑒定，選擇陽性克隆菌落保存，用于下一步轉(zhuǎn)化柱花草。

1.2.3柱花草無菌苗的培育 取適量的細(xì)莖柱花草種子去除外種皮，挑選完整飽滿的種子放置于2 mL離心管中，加入1 mL去離子水，80℃水浴3 min打破種子的休眠，于無菌工作臺中吸取去離子水，75%的酒精浸泡90 s，無菌水洗滌3次，0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，無菌水洗滌6次，置于無菌濾紙上吸干。將滅菌后的種子使用無菌的鑷子接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。

1.2.4外植體的獲得及毛狀根的誘導(dǎo) 使用已滅菌的鑷子將萌發(fā)2 d的無菌苗從培養(yǎng)基上取出，置于鋪有無菌水浸濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿上，使用無菌手術(shù)刀從柱花草子葉節(jié)下約1 mm處切去下胚軸，再沿子葉節(jié)將兩片子葉切開，同時在子葉上劃出3個傷口，即獲得侵染所需的子葉外植體。將子葉外植體放入侵染液中侵染15 min，用鑷子將侵染后的外植體放至無菌濾紙上吸干多余菌液，置于MS固體培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)2 d；暗培養(yǎng)結(jié)束后使用1/2 MS+特美汀(200 mg·L-1)液體培養(yǎng)基清洗外植體，最后將外植體置于1/2 MS+特美汀固體培養(yǎng)基上25℃、12 h·d-1光照條件下培養(yǎng)。

圖1 細(xì)莖柱花草子葉毛狀根的誘導(dǎo)Fig.1 Hairy roots of Stylosanthes gracilis induced from its cotyledon注：A～B，待轉(zhuǎn)化細(xì)莖柱花草幼苗；C～G，子葉外植體獲取；H，發(fā)根農(nóng)桿菌侵染；I，共培養(yǎng)；J～K，毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)；L，毛狀根脫菌培養(yǎng)Note:Panel A～B display the seedings to be transferred;Panel C～G the acquisition of cotyledon explants;Panel H the Agrobacterium rhizogenes infection;Panel I the co-culture duration;Panel J～K the induced root;Panel L the sterilized culture

1.2.5不同發(fā)根農(nóng)桿菌侵染實驗 利用OD600=0.6的4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌液分別侵染細(xì)莖柱花草的子葉外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后統(tǒng)計毛狀根的誘導(dǎo)率。本試驗共3個重復(fù)，每個重復(fù)20個子葉外植體。

1.2.6菌液濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間正交試驗 基于菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間開展L9(34)正交實驗，菌液濃度分別設(shè)置為OD600=0.3，0.6，0.9；侵染時間設(shè)置為10 min，15 min，30 min；共培養(yǎng)時間設(shè)置為2 d，3 d，4 d。誘導(dǎo)20天后對毛狀根進(jìn)行形態(tài)檢測，使用雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源(LUYOR-3415RG)觀察并統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的毛狀根數(shù)目，計算毛狀根轉(zhuǎn)化率，同時對發(fā)綠色熒光的毛狀根進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.7轉(zhuǎn)基因毛狀根的DNA分子鑒定 使用雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源觀察GFP的表達(dá)情況，初步篩選出陽性毛狀根。取0.1 g毛狀根樣品，液氮研磨，通過CTAB法[12]提取DNA。以DNA為模板，通過四對基因特異引物進(jìn)行PCR驗證，其中rolB為發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的毛狀根誘導(dǎo)基因，其上游引物為GCTCTTGCAGTGCTAGATTT(引物方向5′→3′，下同)，下游引物為GAAGGTGCAAGCTACCTCTC，PCR產(chǎn)物長度為423 bp；GFP為pEGAD載體上T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的綠色熒光蛋白基因，其上游引物為TCGTGACCACCCTGACCTAC，下游引物為GACCATGTGATCGCGCTTCT，PCR產(chǎn)物長度為478 bp；Bar為pEGAD載體上T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的抗除草劑基因，其上游引物為GGTCTGCACCATCGTCAACC，下游引物為CCCACGTCATGCCAGTTCC，PCR產(chǎn)物長度為426 bp；UBCE1(ubiquitin-conjugating enzyme 1)為柱花草內(nèi)參基因，其上游引物為CAGATCAAGCTGCTGACGAA，下游引物為GAACAAGCGATCATCAGGTTT，PCR產(chǎn)物長度為127 bp。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 取0.5 g柱花草毛狀根樣品，液氮研磨后加入50 μl 2.5×SDS-PAGE loading buffer，65℃水浴7 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清即為蛋白樣品。取10 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠恒壓80V約60 min，分離膠恒壓120V，通過預(yù)染蛋白Marker確定電泳終止時間。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒壓60V約120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜用1× TBST清洗4次，每次10 min，清洗后加入2%的脫脂牛奶封閉60 min。按照1∶1 000的比例將10 μl GFP抗體加入到10 ml的2%脫脂牛奶中，4℃搖床孵育過夜。用1× TBST清洗4次，每次10 min以洗去未結(jié)合的抗體，按照1∶10 000的比例稀釋二抗，室溫孵育60 min后用1× TBST清洗4次。加入等比例顯色液A和B，利用Image Quant LAS 4000 mini (Cytiva美國) 在化學(xué)發(fā)光下采集圖像。

1.2.8數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Office 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌毛狀根誘導(dǎo)效率的比較

發(fā)根農(nóng)桿菌K599在侵染細(xì)莖柱花草子葉后，無法誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根(圖2)。發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和Arqua1的誘導(dǎo)效率均低于60%，而MSU440的誘導(dǎo)效率高于80%。因此，發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440是誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根的最佳菌株，本研究選取該菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 不同侵染條件對細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化率的影響

在毛狀根誘導(dǎo)20天后，將外植體在綠色熒光蛋白激發(fā)光源下觀察發(fā)光情況并記錄。圖3所示，新生的毛狀根在激發(fā)光下觀察到綠色熒光，證明外源基因成功轉(zhuǎn)入。對正交試驗結(jié)果(表1)進(jìn)行分析可知，在試驗處理水平的選擇范圍內(nèi)，菌液濃度對于轉(zhuǎn)化效率的影響最大，極差為17.63，其次為共培養(yǎng)時間，而農(nóng)桿菌侵染時間對于轉(zhuǎn)化效率的影響最小。最優(yōu)組合菌液濃度為0.3，侵染15 min，共培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)化效率最高為34.72%。

圖2 不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株毛狀根誘導(dǎo)效率的比較Fig.2 Induction efficiency of the hairy roots of Stylosanthes gracilis by different Agrobacterium rhizogenes strains注:圖中不同字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different letters indicate significant differences among different strains (P<0.05)

圖3 毛狀根熒光檢測Fig.3 The hairy root detected by fluorescence注：A,明場下的轉(zhuǎn)基因毛狀根；B,轉(zhuǎn)基因毛狀根熒光檢測；C,明場下的未轉(zhuǎn)基因根；D,未轉(zhuǎn)基因根熒光檢測Note:Panel A displays the transgenic hairy root under natural light;Panel B the transgenic hairy roots detected by fluorescence;Panel C the non-transgenic root under natural light;Panel D the non-transgenic hairy roots detected by fluorescence

表1 不同侵染條件對毛狀根轉(zhuǎn)化效率的影響Table 1 Effects of different infection conditions on transformation efficiency of hairy roots

2.3 轉(zhuǎn)基因毛狀根的鑒定

為進(jìn)一步驗證發(fā)根農(nóng)桿菌的相關(guān)基因以及植物表達(dá)載體pEGAD是否成功整合到細(xì)莖柱花草毛狀根的基因組，以5個發(fā)綠色熒光毛狀根的基因組DNA為模板利用PCR技術(shù)檢測GFP,Bar,rolB,UBCE1基因，以野生型柱花草根系基因組和ddH2O作為陰性對照模板，以轉(zhuǎn)入pEGAD質(zhì)粒的MSU440菌液作為陽性對照模板。圖4A可知，ddH2O和陽性對照未擴(kuò)增出UBCE1片段，而在6個柱花草根系樣品中均擴(kuò)增出UBCE1條帶且大小一致，表明樣品可靠。5個轉(zhuǎn)基因毛狀根中均擴(kuò)增出Bar,rolB,GFP條帶且與陽性對照條帶大小一致，陰性對照未擴(kuò)增出條帶，表明Bar,rolB,GFP均成功整合到細(xì)莖柱花草毛狀根基因組中。此外，利用Western blot對這5個轉(zhuǎn)基因毛狀根中GFP的表達(dá)進(jìn)行蛋白水平的鑒定，用野生型柱花草根系作為陰性對照。圖4B可知，5個轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品均有明顯條帶條帶大小正確，且陰性對照未出現(xiàn)條帶，表明GFP在柱花草毛狀根中正常表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)化毛狀根的分子檢測Fig.4 Molecular detection of transformed hairy roots注：A,轉(zhuǎn)化毛狀根PCR檢測；WT,野生型柱花草根系；d,ddH2O；P,轉(zhuǎn)入pEGAD質(zhì)粒的MSU440菌液,T1～T5,轉(zhuǎn)GFP基因毛狀根株系；M,Maker B：轉(zhuǎn)化毛狀根Western Blot檢測；WT：野生型柱花草根系；T1～T5：轉(zhuǎn)GFP基因毛狀根株系；M：MakerNote:Panel A displays the PCR detection of hairy roots. WT stands for the negative controls;d ddH2O;P the positive controls;T1～T5 the transgenic hairy roots;M:Maker. The same as below. Panel B displays the Western Blot detection of hairy roots

3 討論

在發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化體系中，毛狀根的誘導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)化效率受到菌株類型、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間等多種因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根時，不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的效率存在顯著差異。菌株K599無法誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根，這與在白花草木樨[12]、小扁豆[13]、白羽扇豆[14]等豆科植物中的研究結(jié)果存在差異，這可能與物種之間的差異有關(guān)。ArQua1,MSU440,C58C1這3種均能誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根，其中MSU440菌株的誘導(dǎo)能力顯著高于其它兩個菌株，且毛狀根生長狀態(tài)良好，因此，MSU440是最適用于細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系建立的菌株。羅萍等[15]發(fā)現(xiàn)MSU440菌株對尾巨桉的毛狀根誘導(dǎo)率高達(dá)80.1%，這與本試驗研究結(jié)果一致。侵染所用的菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間也是影響毛狀根的轉(zhuǎn)化效率的重要因素。本研究結(jié)果表明，菌液OD600為0.3、侵染時間為15 min以及共培養(yǎng)4 d時毛狀根轉(zhuǎn)化效率最高，是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草子葉產(chǎn)生毛狀根時最佳侵染條件(表1)。過高的菌液濃度和較長的侵染時間都會降低毛狀根的轉(zhuǎn)化效率，這可能是發(fā)根農(nóng)桿菌大量附著在細(xì)莖柱花草子葉表面，后期共培養(yǎng)階段菌大量繁殖，導(dǎo)致子葉褐化死亡，無法誘導(dǎo)產(chǎn)生較多毛狀根。

確定合適的篩選壓是成功獲得植物轉(zhuǎn)基因材料的關(guān)鍵步驟，對轉(zhuǎn)化效率有極大影響。本試驗參照本課題組前期實驗結(jié)果，選擇0.6 mg·L-1Basta?進(jìn)行篩選，獲得了34.72%的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率仍待進(jìn)一步提高[9]。周玲燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)在水稻的轉(zhuǎn)基因過程中使用潮霉素作為篩選劑優(yōu)于Basta，具有較少的假陽性，能顯著提高陽性率。韓秀麗等[17]在大麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究中也發(fā)現(xiàn)潮霉素較草丁膦更適于作為篩選劑。因此，為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率，減少假陽性，后續(xù)研究可使用不同的篩選劑，確定最適的篩選壓。

目前，發(fā)根農(nóng)桿菌因其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根分化程度高、遺傳性狀穩(wěn)定以及操作簡易等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于蛋白定位、蛋白互作等，Meng等[18]采用雙分子熒光互補(bǔ)實驗在木豆(Cajanuscajan)毛狀根中驗證了CBLs與CIPKs相互作用；程媛媛等[19]在大豆中利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆毛狀根技術(shù)成功進(jìn)行了CRISPR/Cas9基因編輯、亞細(xì)胞定位及蛋白-蛋白互作分析，且發(fā)現(xiàn)互作的兩種蛋白在煙草葉片細(xì)胞和大豆毛狀根中的表達(dá)量存在差異，表明毛狀根可能更利于準(zhǔn)確預(yù)測基因的功能。此外，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的離體毛狀根也是叢枝菌根真菌雙重培養(yǎng)的理想宿主材料，對于研究AM真菌于植物根系的共生及相關(guān)分子機(jī)制有極大的輔助作用怕[20]；同時，離體毛狀根在無激素的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，一個月可增殖數(shù)千倍，因此，可作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物[21]，在藥用植物有效成分工業(yè)化生產(chǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗后續(xù)將探索細(xì)莖柱花草毛狀根的離體培養(yǎng)體系，助力代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究以細(xì)莖柱花草為材料，采用子葉節(jié)侵染法建立了一種細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系。通過比較毛狀根誘導(dǎo)率篩選出最適于細(xì)莖柱花草毛狀根誘導(dǎo)的菌株MSU440，并確定了其侵染細(xì)莖柱花草的最佳條件，成功獲得了表達(dá)GFP蛋白的毛狀根，轉(zhuǎn)化效率為34.72%。細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立為柱花草屬物種的基因功能研究提供了強(qiáng)有力的手段，為以后柱花草的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。