雞傳染性支氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

崔鶴馨,呼延含蓉

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院,吉林 長(zhǎng)春 130021; 2.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,吉林 長(zhǎng)春 130021

0 引言

雞傳染性支氣管炎屬于雞二類傳染病,以呼吸困難、打噴嚏、啰音、咳嗽為典型臨床癥狀,該類病癥主要由傳染性支氣管炎病毒引起,屬于呼吸道系統(tǒng)傳染病,可以通過墊草、飲水、飼料等渠道傳播。如果養(yǎng)殖環(huán)境通風(fēng)不良,飼養(yǎng)密度過大或舍內(nèi)陰濕、高溫等均容易誘發(fā)該病,冬季發(fā)病最為嚴(yán)重。雞傳染性支氣管炎主要危害1～2周齡雛雞,在雛雞中發(fā)病率較高,為2%～5%,如果檢驗(yàn)、診斷、防控不及時(shí)可能導(dǎo)致整個(gè)雞舍內(nèi)產(chǎn)蛋雞、成年雞染病,因此應(yīng)該對(duì)疑似病雞進(jìn)行及時(shí)檢測(cè),為后續(xù)隔離、治療等提供科學(xué)依據(jù)。文章主要以熒光RT-PCR檢測(cè)方法為例,分析該類檢測(cè)方法在雞傳染性支氣管炎病毒中的診斷和應(yīng)用,旨在進(jìn)一步發(fā)揮該類分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在雞傳染性支氣管炎中的檢測(cè)作用。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料采集

在2022年4月某養(yǎng)雞場(chǎng)選擇疑似傳染性支氣管炎病例6例,疑似病雞日齡為7～34 d,主要臨床癥狀為流淚、流鼻涕、打噴嚏,夜間有明顯嘶啞叫聲,張嘴呼吸,咳嗽,鼻部腫脹,部分疑似病雞食欲不振,縮頭閉目,拉黃色稀糞。為對(duì)病雞進(jìn)行進(jìn)一步確診,同時(shí)便于后續(xù)分離病毒,選擇病死雞支氣管、氣管等病毒易增殖的主要部位作為病料采集部位。如果病雞臨床癥狀持續(xù)15 d以上,可以采集病死雞盲腸扁桃體或者輸卵管、腎臟作為病料。

1.2 試劑與儀器

1)本次試驗(yàn)所需試劑:青霉素-鏈霉素雙抗,由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn);小提質(zhì)粒DNA試劑盒,由美國(guó)Bio-Tek公司生產(chǎn);胰蛋白酶,由杭州浦泰生物科技有限公司生產(chǎn);Trans5α感受態(tài)細(xì)胞,由北京全式金生物科技有限公司生產(chǎn);PCR PreMixture(2×),由成都飛克天泰科技有限公司生產(chǎn);Tris-飽和粉(ph8.0),由成都飛克天泰科技有限公司生產(chǎn);SDS,由潤(rùn)德生物科技有限公司生產(chǎn);first-Strand Buffer,由廈門慧嘉生物科技有限公司生產(chǎn),規(guī)格200 μL;Rnasin(核糖核酸酶圄制劑),由上海哈靈生物科技有限公司生產(chǎn);Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒,由德國(guó)羅氏生命科學(xué),由北實(shí)縱橫科學(xué)公司代理生產(chǎn),規(guī)格Transcriptase25 μL(20 U/μL);Binding Buffer,由蘇州瑞諾德生物科技有限公司生產(chǎn);Wash Buffer,由美國(guó)艾美捷科技有限公司生產(chǎn)。

2)本次試驗(yàn)所需儀器:低溫高速離心機(jī),型號(hào)5435R,由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn);恒溫可調(diào)水溶鍋,型號(hào)DK-600A,由上海一恒公司生產(chǎn);立式壓力蒸汽滅菌器,型號(hào)LDZX-50 KBS,由上海申安公司生產(chǎn);-80 ℃超低溫冰箱,型號(hào)Forma 902,由美國(guó)Thermo Fisher 公司生產(chǎn);臺(tái)式電子秤,型號(hào)PL203,由梅特勒托利多公司生產(chǎn);漩渦混合器,型號(hào)QL901,由海門其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn);穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀,型號(hào)DYY-Ⅲ-8B,由北京市六一儀器廠生產(chǎn);超凈工作臺(tái),型號(hào)SW-CJ-2FD,由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn);微波爐,型號(hào)WD900(MG-5523M),由LG電子電器有限公司生產(chǎn);生化培養(yǎng)箱,型號(hào)SPX-450,由寧波萊福科技有限公司生產(chǎn);PCR儀,型號(hào)D-37085,由德國(guó)SensoQuert公司生產(chǎn);紫外凝膠成像分析儀,型號(hào)Gel Doc2000,由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn);無RNA酶EP管,本生(天津)健康科技有限公司供應(yīng),規(guī)格50mL、15mL;DNA凝膠回收試劑盒,北京擎科生物科技股份有限公司。

1.3 試劑配置

1)0.01 mol磷酸緩沖液:配置方法為由1/15 mol磷酸二氫鉀19 mL,結(jié)合磷酸氫二鈉81 mL(1/15mol),溶于生理鹽水,生理鹽水為566 mL。

2)75%乙醇:在焦炭酸二乙酯(DEPC)處理水中加入無水乙醇,其中DEPC為25 mL,無水乙醇為75 mL。

3)10x胰蛋白酶:葡萄糖1 g、氯化鈉0.4 g、胰蛋白酶0.5 g,溶于100 mL二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)+0.2 g去離子水,存放溫度為-20 ℃。

4)10xTBX:EDTA 9.3 g溶于去離子水,去離子水約800 mL,取硼酸55g,將pH值調(diào)至8.2,之后定溶100 mL。

5)Hank’s液:取七水合硫酸鎂0.2 g、氯化鈉16 g、六水合氯化鎂0.2 g、氯化鉀0.8 g,溶于去離子水,去離子水80 mL。之后將10 mL去離子水與氯化鈣0.28 g混合定容至100 mL,將以上溶液作為甲液[1]。之后取葡萄糖2 g、十二水合磷酸氫二鈉0.304 g、磷酸二氫鉀0.12 g,溶于去離子水,去離子水為80 mL,加入0.4%酚紅液10 mL,定容至100 mL,作為乙液,放置4 ℃環(huán)境保存,之后按照去離子水:甲液:乙液為18：1：1稀釋滅菌備用。

6)其他。①第九代尿囊液,利用0.1%新潔爾滅溶液,消毒雞胚(雞胚提前冷藏6 h,冷藏溫度4 ℃),之后扒出氣室,收獲第九代尿囊液。②Trizol抽提試劑,主要成分苯酚,為新型總RNA抽提試劑,在溶解細(xì)胞時(shí)可保持RNA(核糖核酸)完整性。③MDTT,3.09 g二硫蘇糖醇+0.01MNaOAc,置于50 mL離心管內(nèi),-20 ℃保存。④1%瓊漿糖凝膠,取0.5 g瓊脂糖、70 mL瓊漿糖凝膠電泳,加熱煮沸至全部融化。⑤solutionⅠ,10 mM EDTA+Tris-飽和粉(ph8.0)25 mM,高溫滅菌后4 ℃保存,solutionⅡ,500 mLSDS、氫氧化鈉200 mM,加滅菌水定容500 mL,solutionⅢ,0.5MEDTA、300 mL去離子水溶解,高溫滅菌后4 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

引物參考序列號(hào)GU393332.1,序列TTGCTAGAGAGTGTGC,長(zhǎng)度為271bp,位置為398-415(上游引物)[2]。序列AGACTACTTCCTCCTGTTG,長(zhǎng)度為271bp,位置為668-650(下游引物),按使用說明進(jìn)行稀釋。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 熒光RT-PCR檢測(cè)方法建立

2.1.1 提取BD株毒株RNA

取第九代尿囊液,取BD株病毒,離心10 min,12 000 r/min,后取上清,之后加入1 mL Trizol,取0.2 mL上清液,溫室放置5 min,加入氯仿0.2 mL,震蕩15 s,定容,溫室放置3 min,之后離心15 min,10 000 r/min,離心溫度4 ℃。取異丙醇0.5 mL,取上清0.5 mL,顛倒10次以上,混合搖勻,靜止20 min,溫室下存放,之后離心10 min,10 000 r/min,離心溫度4 ℃,棄上清,加入乙醇,乙醇濃度為75%,含量為1 mL,懸浮沉淀,之后離心3 min,5 000 r/min,離心溫度4 ℃,剩余少量液體,短暫離心,不吸出沉淀,倒出液體放置溫室下晾干,加入DEPC 9 μL,充分溶解RNA,反復(fù)吹打,搖勻。

2.1.2 病毒總RNA提取

在無RNA酶EP管中加入Trizol750 μL,溫室下擱置10 min,之后加入氯仿200 μL,溫室擱置10 min,之后離心15 min,15 000 r/min,收取上清,輕柔吹打8次,擱置30 min之后離心10 min,轉(zhuǎn)速12 000 r/min,棄上層液體,加入75%乙醇,離心10 min,轉(zhuǎn)速8 000 r/min,離心溫度4 ℃,溫室干燥10 min,之后加入DEPC處理水20 μL,放置-80 ℃環(huán)境下保存。

2.2 熒光RT-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用

2.2.1 RT-PCR擴(kuò)增

下游引物2 μL,RNA模板為9 μL,pH值為中性[3]。加熱5 min后(加熱溫度為70 ℃),立即在冰上冷卻2 min,收集反應(yīng)液后,分別加入4 μL 5*first-Strand Buffer、1 μL 0.1 μLMDTT、1 μLRnasin(40 M/μL),42 ℃環(huán)境下溫浴2 min,之后加入1 μLTiANSCript,放置95 ℃環(huán)境下加熱5 min,之后冷凍保存。RT-PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置為:共5個(gè)周期,每個(gè)周期分別是94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,靜止后50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 5 min,最后將RT-PCR產(chǎn)物放置于4 ℃保存,上游引物體積0.5 μL,下游引物體積0.5 μL,CDNA模板體積為2.00 μL,無 RNA酶水體積為9.5 μL。

2.2.2 PCR純化回收

取擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊漿糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定[4]。參照DNA凝膠回收試劑盒說明書,取DNA目的條帶,稱取所切下凝膠重量,放置于清潔EP管中,加入100 μLBinding Buffer加入0.1 g凝膠,水浴10 min,水溫55 ℃,每3 min上下顛倒1次,保證溶液完全溶解。將溶解后溶液利用高速離心機(jī),加入吸附柱后離心1 min,12 000 r/min,之后加入300 μLBinding Buffer,使用高速離心機(jī)離心1 min,12 000 r/min,之后加入700 μLBinding Buffer,使用高速離心機(jī)離心時(shí)間1 min,10 000 r/min,重復(fù)1次后收取管中液體,將吸附柱放入新的EP管中,置于-20 ℃低溫保存,加入30 μLBinding Buffer,靜止3 min后離心1 min,10 000 r/min。

2.2.3 質(zhì)粒DNA提取

取純化后菌液,利用高速離心機(jī)離心2 min,10 000 r/min,留取沉淀,之后加入250 μL solutionⅠ、250 μL solution Ⅱ、350 μL solution Ⅲ,上下翻轉(zhuǎn)6～8次,之后溫和顛倒混勻,滯留2 min左右,離心10 min,10 000 r/min,將上清液至于吸附柱中,離心1 min,10 000 r/min,除去液體,加入500 μL DNA Wash Buffer,離心1 min,10 000 r/min,棄去液體,加入50 μL緩沖液,離心2 min,12 000 r/min,剩余液體即為重組質(zhì)粒DNA。

2.3 結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳可得到增片段,大小為405 bp,且標(biāo)準(zhǔn)毒株通過擴(kuò)增也得到同樣大小條帶,之后分析特異性條帶,可發(fā)現(xiàn)每個(gè)泳道是否存在明顯的特異性擴(kuò)增,以此判斷陽性病例。在本次試驗(yàn)中,共收集6份疑似病例病料,通過以上RT-PCR檢測(cè)方法,以各毒株反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,結(jié)合1%瓊脂糖凝膠電泳,擴(kuò)增出了l條電泳帶,電泳帶條大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致,非雞傳染性支氣管炎病毒則沒有擴(kuò)增出條,將尿囊液上清作連續(xù)10倍稀釋,板量為5×102～5×103EID50/mL,每條條帶大小均為405 bp,并得出電泳條帶(由明到暗呈梯度依次遞減),其中有2份病料條帶呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增(陽性)。

3 討論

雞傳染性支氣管炎是肉雞養(yǎng)殖管理工作中常見疾病之一,由雞傳染性支氣管炎病毒引起[5]。該病毒是冠狀病毒科的一個(gè)代表種,表面有桿狀纖突,有囊膜,為單股DNA,且該類病毒病原性較為復(fù)雜,有眾多血清型,同時(shí)變異株較。近年來各獸醫(yī)專家學(xué)者依據(jù)雞傳染性支氣管炎發(fā)病癥狀和臨床表現(xiàn)的不同,將毒株分離為3種形態(tài),最終將雞傳染性支氣管炎劃分出3種病癥類型,分別是腎型、腺胃型和呼吸型。

在雞傳染性支氣管炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法中,如血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法,雖然該類方法操作簡(jiǎn)單,但是存在特異性不強(qiáng)、檢測(cè)敏感性低、檢測(cè)周期長(zhǎng)等弊端,難以滿足大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)病雞集中檢測(cè)時(shí)效性要求。因此建立快速特異的診斷方法尤為重要,RT-PCR方法就是其中之一,該類方法特異敏感性更強(qiáng),靈敏、快速、精準(zhǔn),是近年來臨床檢測(cè)和診斷中的常見技術(shù),本次試驗(yàn)研究利用RT-PCR方法,通過基因分子生物學(xué)信息,設(shè)計(jì)特異性引物,之后擴(kuò)增出目的條帶,分析條帶特異性,之后通過基因判斷,可測(cè)定病料擴(kuò)增陰陽性,為臨床診斷提供可靠的技術(shù)支撐,時(shí)效更快,精準(zhǔn)程度更高。

基層畜牧獸醫(yī)技術(shù)人員和相關(guān)部門應(yīng)該及時(shí)對(duì)疑似病例進(jìn)行診斷,利用生物分子檢測(cè)技術(shù),開展流行病學(xué)調(diào)查,分析養(yǎng)殖場(chǎng)所內(nèi)雞傳染性支氣管炎感染現(xiàn)狀,以此為后續(xù)防控和治療工作提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)束語

RT-PCR檢測(cè)技術(shù)可以為雞傳染性支氣管炎診斷提供科學(xué)依據(jù),值得臨床推廣和應(yīng)用,相關(guān)基層畜牧獸醫(yī)技術(shù)人員應(yīng)該熟練掌握該種收入分子檢測(cè)技術(shù),以此充分發(fā)揮RT-PCR檢測(cè)技術(shù)在雞傳染性支氣管炎診斷中的作用。