牛乳與山羊乳中乳橋蛋白的比較研究

羅元理，于雪，竇宇琪，任向楠，張立實(shí)，朱婧

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610041；2.北京市科學(xué)技術(shù)研究院北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100069；3.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100089；4.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050）

0 引 言

乳源性骨橋蛋白（osteopontin,OPN），也稱(chēng)乳橋蛋白（lactopontin,LPN）[1-2]，最初發(fā)現(xiàn)存在于骨組織中[3-4]，之后發(fā)現(xiàn)具有兩種形式：細(xì)胞內(nèi)OPN[5]和分泌型OPN[6]。人乳中LPN是分泌型OPN，含量遠(yuǎn)高于其他組織和分泌物[7]。研究發(fā)現(xiàn)乳汁中LPN在嬰兒早期發(fā)育中可能發(fā)揮多種作用[8]，特別是在嬰兒早期腸道、大腦和免疫發(fā)育中顯示出生物活性[9]。

不同物種LPN間存在結(jié)構(gòu)相似性，均含有谷氨酸-甘氨酸-天冬氨酸構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)序列，以及酶解后可暴露的隱蔽基序，可與細(xì)胞上整合素蛋白結(jié)合[10]。人乳和牛乳L(zhǎng)PN在氨基酸序列、磷酸化和糖基化修飾位點(diǎn)等方面具有許多相似性[7]，比如牛乳L(zhǎng)PN中有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)與人乳L(zhǎng)PN相同[3,11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)添加牛乳L(zhǎng)PN試驗(yàn)組的嬰兒發(fā)熱發(fā)生率、血漿促炎癥細(xì)胞因子TNF-α水平以及外周血T細(xì)胞比例與純母乳喂養(yǎng)組無(wú)差別[12-13]，該研究結(jié)果提示人乳和牛乳L(zhǎng)PN可能具有相似的生物活性。

有研究認(rèn)為山羊乳的較低致敏性及易消化性適合牛乳不耐受或患有胃腸道疾病的嬰幼兒[14]，因此山羊乳正成為越來(lái)越多嬰幼兒配方粉的乳源選擇。山羊乳中可檢測(cè)到LPN含量比牛乳略低[15]。目前關(guān)于山羊乳L(zhǎng)PN的研究較少，山羊乳L(zhǎng)PN與牛乳L(zhǎng)PN結(jié)構(gòu)，特別是其磷酸化修飾是否存在差異，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)山羊乳和牛乳中LPN進(jìn)行序列相似度分析，并進(jìn)行富集和測(cè)定，比較兩者磷酸化修飾的差異，探討兩者結(jié)構(gòu)的異同，為山羊乳L(zhǎng)PN的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列比對(duì)（sequence alignment）

在Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）中輸入關(guān)鍵詞“osteopontin“，獲得蛋白質(zhì)氨基酸序列，選擇人（Homo sapiens,human）、牛（Bos taurus,bovine），山羊（Capra hircus,goat），Uniprot ID分別為P10451，P31096，A9YUB7，去除信號(hào)肽（signal peptide）后分別為P10451|17-314，P31096|17-278，A9YUB7|17-277。通過(guò)Uniprot自帶的CLUSTALO程序，分別進(jìn)行人和牛、人和山羊、牛和山羊的氨基酸序列比對(duì)，計(jì)數(shù)完全相同的氨基酸位點(diǎn)（identical positions），相同氨基酸位點(diǎn)比例（identity），相似氨基酸位點(diǎn)（similar positions）。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)樣品：新鮮牛奶和新鮮山羊奶（200 m L）分別采集自內(nèi)蒙古和陜西牧場(chǎng)，采集后迅速保存于-20°C冰箱，通過(guò)冷鏈快遞運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室保存于-80°C冰箱。

試劑與耗材：如無(wú)特殊說(shuō)明，均購(gòu)自Thermo Fisher，純度為分析純。Pierce磷酸化蛋白富集試劑盒（內(nèi)含離心柱、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液和超濾柱），蛋白酶和磷酸酶抑制劑，Oasis PRiME HLB 96孔板（Waters），Glu-C蛋白酶（Thermo Fisher，MS級(jí)），胰蛋白酶（Thermo Fisher，MS級(jí)），胃蛋白酶（Sigma Aldrich），嗜熱菌蛋白酶（Sigma Aldrich）；鹽酸（HCl），氯化鈣（CaCl2），碳酸氫銨（NH4HCO3），脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate,SDC），三(羥甲基)氨基甲烷（Tris），三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP），2-氯乙酰胺（2-Chloroacetamide,CAA），三氟乙酸（Trifluoroacetic acid,TFA），乙腈（Sigma Aldrich，色譜純），甲酸（Sigma Aldrich，色譜純）。

1.3 儀器與設(shè)備

低溫高速離心機(jī),Sigma Aldrich；真空離心濃縮儀,赫西；負(fù)壓萃取器,Waters；Nanodrop,Thermo Fisher；Easy nLC 1200系統(tǒng)，Thermo Fisher；Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜儀，Thermo Fisher。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 LPN富集及濃縮

由于LPN是高度磷酸化蛋白，可采用Pierce磷酸化蛋白富集試劑盒對(duì)其進(jìn)行富集。但由于牛、山羊乳中高豐度的酪蛋白也是磷酸化蛋白，在使用Pierce磷酸化蛋白富集試劑盒前，需先沉淀并去除酪蛋白。將牛乳和山羊乳樣品于4℃解凍并充分混勻后，各取2 mL，分別調(diào)節(jié)p H至4.3和CaCl2的終濃度至60 mmol/L，并以1 500 g在4℃離心30 min沉淀酪蛋白，取上清1 mL，按照Pierce磷酸化蛋白富集試劑盒的說(shuō)明，通過(guò)離心柱吸附、洗滌緩沖液洗滌非磷酸化蛋白、洗脫緩沖液洗脫磷酸化蛋白，并將洗脫的磷酸化蛋白溶液通過(guò)超濾柱濃縮至150～200μL。

1.4.2 蛋白酶解

用Nanodrop測(cè)定濃縮后的磷酸化蛋白的濃度，每管取20 ng蛋白后使用超濾管將溶液置換為200 mmol/L NH4HCO3后，加入終濃度為1%(w/v)SDC，100 mmol/L Tris，5 mmol/L TCEP和30 mmol/L CAA使蛋白變性及二硫鍵還原和烷基化，分別采用5種加酶方式消化以增加鑒定的肽段覆蓋率。管1加入胰蛋白酶0.4 ng于37℃消化14 h；管2加入Glu-C蛋白酶0.8 ng于37℃消化14 h；管3先加入胰蛋白酶0.4 ng于37℃消化14 h后加入Glu-C蛋白酶0.8 ng繼續(xù)在37℃消化4 h；管4加入嗜熱菌蛋白酶0.8 ng于70℃消化14 h；管5加入1 mol/L HCl調(diào)節(jié)p H至2.0，加入胃蛋白酶1 ng于37℃消化3 h。之后加入TFA至其終濃度為0.5%以停止酶解，20 000 g于室溫離心10 min，保留上清，采用Oasis PRiME HLB 96孔板對(duì)其中的肽段脫鹽后，在真空離心濃縮儀中干燥后保存于-80℃冰箱待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

凍干的肽段用10%甲酸回溶后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析。采用配備Acclaim Pep Map 100-C18捕集柱（Thermo Fisher）和Acclaim Pep Map RSLC-C18分析柱（Thermo Fisher）的Easy nLC 1200系統(tǒng)（Thermo Fisher）分離肽，流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相B）組成。梯度洗脫時(shí)間為60 min，流速為300 nL/min，3 min內(nèi)從3%B增加到8%B，隨后在45 min內(nèi)增加到35%B，之后在5 min內(nèi)增加到100%B，并保持7 min。通過(guò)與LC系統(tǒng)耦合的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜儀（Thermo Fisher）進(jìn)行分析，電噴霧電壓2.0 k V。肽段的分析在數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集（data-dependent acquisition,DDA）模式下使用高能碰撞解離（higher energy collision dissociation,HCD）進(jìn)行MS/MS碎裂。MS1掃描范圍為350～2 000 m/z，在200 m/z的分辨率為60 000，自動(dòng)增益控制（automated gain control,AGC）設(shè)置為4e5，最大進(jìn)樣時(shí)間（maximum injection time,MIT）為50 ms。篩選強(qiáng)度>3e4的2+至6+電荷狀態(tài)的母離子用于MS/MS（隔離窗口：1.6 m/z）。使用10 ppm排除窗口設(shè)置60 s動(dòng)態(tài)排除，循環(huán)時(shí)間為2 s。M S/M S掃描采用HCD破碎，歸一化碰撞能量為30%，Orbitrap檢測(cè)的掃描從100 m/z開(kāi)始，在200 m/z的分辨率為15 000，AGC為5e4，MIT為22 ms。使用相同的設(shè)置并行分析相同的樣品，不同之處在于觸發(fā)電子轉(zhuǎn)移解離（electron-transfer dissociation,ETD）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索采用Byonic軟件（版本3.10.2，Protein Metrics Inc.），使用UniProt Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索（牛：Bos Taurus、山羊：Capra Hircus），固定修飾為Cys位點(diǎn)脲甲基化（carbamidomethylation），可變修飾為Met位點(diǎn)氧化（oxidation）、肽段N端的Met損失和乙?；╝cetylation）、Ser，Thr，Tyr位點(diǎn)磷酸化（phosphorylation）、O-聚糖（6種常見(jiàn)O聚糖）。搜索設(shè)置的切割特異性根據(jù)文件選擇不同的蛋白酶切位點(diǎn)。僅保留|log Prob|≥2.0且Byonic分?jǐn)?shù)≥100的肽段，并使用Skyline（版本20.2.0.286，華盛頓大學(xué)）獲得肽段母離子的提取離子流色譜圖（extracted ion chromatogram,XIC）對(duì)肽段進(jìn)行定量。將同一修飾位點(diǎn)的肽段的定量值，以100%為總值，計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)該修飾的位點(diǎn)覆蓋率。當(dāng)不同的蛋白酶處理肽段均可計(jì)算位點(diǎn)覆蓋率時(shí)，計(jì)算不同處理的均值作為位點(diǎn)覆蓋率。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列相似性比較

人和牛、人和山羊、牛和山羊的氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果見(jiàn)表1所示。其中人乳L(zhǎng)PN由298個(gè)氨基酸構(gòu)成，牛乳L(zhǎng)PN由262個(gè)氨基酸構(gòu)成，山羊乳L(zhǎng)PN由261個(gè)氨基酸構(gòu)成。人乳L(zhǎng)PN與牛乳L(zhǎng)PN有173個(gè)氨基酸位點(diǎn)完全相同，相同氨基酸位點(diǎn)比例（identity）為58.05%，相似氨基酸位點(diǎn)為59個(gè)，具有較高的序列相似性。人乳L(zhǎng)PN和山羊乳L(zhǎng)PN的序列相似性結(jié)果顯示，有169個(gè)氨基酸位點(diǎn)完全相同，identity為56.71%，相似氨基酸位點(diǎn)為57個(gè)，也表現(xiàn)出較高的序列相似性。而牛乳和山羊乳L(zhǎng)PN的序列高度相似，兩者有238個(gè)氨基酸位點(diǎn)完全相同，identity高達(dá)90.94%，相似氨基酸位點(diǎn)為17個(gè)。

表1 不同物種乳橋蛋白序列相似性比較

圖1對(duì)牛乳與山羊乳乳源性骨橋蛋白的氨基酸序列進(jìn)一步進(jìn)行內(nèi)源酶切位點(diǎn)（虛線箭頭標(biāo)示）、整合素結(jié)合序列（下劃線標(biāo)示，紅色：牛乳，綠色：山羊乳）、磷酸化修飾位點(diǎn)（紅色加粗字體：牛乳中有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)的磷酸化修飾，藍(lán)色加粗字體：牛乳中可能但未被實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)的磷酸化修飾，綠色加粗字體：根據(jù)序列相似性推測(cè)的山羊乳中磷酸化修飾位點(diǎn)）和O-糖基化修飾位點(diǎn)（黃色加粗字體：牛乳，綠色加粗字體：山羊乳中根據(jù)序列相似性推測(cè)的位點(diǎn)）的比對(duì)。結(jié)果顯示，牛乳L(zhǎng)PN和山羊乳L(zhǎng)PN在內(nèi)源酶切位點(diǎn)上存在高度的相似性，第一個(gè)酶切位點(diǎn)均為L(zhǎng)ys（K），第二個(gè)酶切位點(diǎn)牛乳L(zhǎng)PN為Arg（R），山羊乳為L(zhǎng)ys（K），但R和K均為乳中最主要的內(nèi)源性蛋白酶纖溶酶（Plasmin）的酶切位點(diǎn)[16]。牛乳L(zhǎng)PN和山羊乳的LPN的整合素結(jié)合序列，RGD序列和隱蔽基序（SVAYGLK）則完全一致。從可能的磷酸化修飾位點(diǎn)和O-糖基化修飾位點(diǎn)來(lái)看，山羊乳L(zhǎng)PN在牛乳L(zhǎng)PN所有的可能位點(diǎn)處都具有相同的氨基酸。因此，牛乳L(zhǎng)PN和山羊乳L(zhǎng)PN從序列相似度、內(nèi)源酶切位點(diǎn)、整合素結(jié)合序列、可能的磷酸化修飾位點(diǎn)和O-糖基化修飾位點(diǎn)等多方面，均具有明顯的相似性。

圖1 牛乳與山羊乳乳橋蛋白氨基酸序列及關(guān)鍵位點(diǎn)

2.2 肽段覆蓋率比較

山羊乳L(zhǎng)PN的修飾位點(diǎn)僅根據(jù)與牛乳L(zhǎng)PN的相似性推測(cè)，還未有實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)證實(shí)，因此本研究通過(guò)LC-MS/MS比較山羊乳L(zhǎng)PN和牛乳L(zhǎng)PN在修飾位點(diǎn)的差異。由于兩種LPN的氨基酸序列特點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)密集，需要使用多種蛋白酶提高肽段覆蓋率和分開(kāi)成簇的磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)不同蛋白酶的特異性消化位點(diǎn)，此次研究采用了5種不同的蛋白酶解方式，使得肽段覆蓋率比使用單種酶時(shí)得到了極大的提高。表2對(duì)5種酶解方式和合計(jì)的肽段覆蓋率進(jìn)行了描述。牛乳L(zhǎng)PN和山羊乳L(zhǎng)PN在同一蛋白酶處理時(shí)肽段覆蓋率相似，且將所有蛋白酶切肽段合并時(shí)，肽段覆蓋率均較單一蛋白酶提高。

表2 不同蛋白酶處理下乳橋蛋白的肽段覆蓋率

2.3 蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)及位點(diǎn)覆蓋率比較

根據(jù)Uniprot，牛乳L(zhǎng)PN中有28個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)（27個(gè)磷酸絲氨酸位點(diǎn)，1個(gè)磷酸蘇氨酸位點(diǎn)）和3個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)曾在過(guò)往研究中被證實(shí)存在[17]，根據(jù)相似性還有8個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)但尚未被證實(shí)。而山羊乳L(zhǎng)PN還未報(bào)道過(guò)磷酸化修飾位點(diǎn)或O-糖基化修飾位點(diǎn)，但根據(jù)與牛乳L(zhǎng)PN的序列的高度相似性，山羊乳L(zhǎng)PN也在同樣的位置可能具有蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)酶解后肽段的鑒定和XIC的提取，對(duì)牛乳L(zhǎng)PN和山羊乳L(zhǎng)PN的各個(gè)蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)的修飾位點(diǎn)覆蓋率進(jìn)行了計(jì)算和比較，見(jiàn)表3。需要特別指出的是，由于一些包含修飾位點(diǎn)的肽段沒(méi)有被鑒定，一些位點(diǎn)無(wú)法計(jì)算位點(diǎn)覆蓋率。還有一些肽段中包含多個(gè)可能的修飾位點(diǎn)，從譜圖無(wú)法區(qū)分每個(gè)位點(diǎn)的覆蓋情況時(shí)，對(duì)于磷酸化修飾，對(duì)該肽段的多個(gè)位點(diǎn)按照P0（均無(wú)修飾）、P1（其中1個(gè)位點(diǎn)存在修飾）、P2（其中2個(gè)位點(diǎn)存在修飾）和P3（其中3個(gè)位點(diǎn)存在修飾）的方式來(lái)表示；而對(duì)于O-糖基化修飾，則采用G0、G1、G2的方式表示。

對(duì)于O-糖基化位點(diǎn)而言，山羊乳L(zhǎng)PN的3個(gè)可能O-糖基化位點(diǎn)未鑒定到相關(guān)的修飾肽段，而牛乳L(zhǎng)PN的T 124和T129的其中1個(gè)位點(diǎn)存在O-糖基化修飾，其中糖鏈結(jié)構(gòu)為Hex(1)HexNAc(1)NeuAc(1)的肽段占20.6%，Hex(1)HexNAc(1)NeuAc(2)占79.4%。對(duì)于磷酸化修飾位點(diǎn)而言，當(dāng)牛乳L(zhǎng)PN的位點(diǎn)為無(wú)磷酸化修飾（P0接近100%）和完全磷酸化修飾（P1接近100%）時(shí)，山羊乳L(zhǎng)PN與牛乳L(zhǎng)PN完全一致，如山羊乳L(zhǎng)PN的S171、S182分別與牛乳L(zhǎng)PN的S172、S183的位點(diǎn)覆蓋率一致；當(dāng)牛乳L(zhǎng)PN的位點(diǎn)上同時(shí)存在無(wú)磷酸化修飾和不同數(shù)量的磷酸化修飾時(shí)，山羊乳L(zhǎng)PN的部分位點(diǎn)與牛乳L(zhǎng)PN不同，如山羊乳T(mén)161位點(diǎn)，46.7%為無(wú)磷酸化修飾，53.3%為具有磷酸化修飾，而相對(duì)應(yīng)的牛乳T(mén)162位點(diǎn)則分別為24.1%和75.9%，具有更高的磷酸化修飾比例?？傮w而言，山羊乳L(zhǎng)PN未識(shí)別到O-糖基化修飾；與牛乳L(zhǎng)PN的磷酸化修飾相比，山羊乳L(zhǎng)PN的修飾位點(diǎn)與牛乳L(zhǎng)PN存在高度的一致性，但一些位點(diǎn)的磷酸化修飾在兩者間略有差異。

（續(xù)表3）

3 討論

LPN在生命早期的作用近年來(lái)受到許多關(guān)注，特別已經(jīng)有許多研究通過(guò)一些體外、動(dòng)物和臨床試驗(yàn)等方式對(duì)牛乳L(zhǎng)PN的作用進(jìn)行了探討。如體外實(shí)驗(yàn)表明，牛乳L(zhǎng)PN可上調(diào)腸道上皮細(xì)胞（Caco-2）白介素-18的分泌并促進(jìn)Caco-2的分化[18]。對(duì)于新生恒河猴的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，添加牛乳L(zhǎng)PN比普通配方喂養(yǎng)的腸道轉(zhuǎn)錄組更接近恒河猴母猴母乳喂養(yǎng)組[19]。添加牛乳L(zhǎng)PN可促進(jìn)乳豬的大腦體積和神經(jīng)結(jié)構(gòu)發(fā)育[20]。對(duì)健康足月兒的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)牛乳L(zhǎng)PN的添加對(duì)于免疫相關(guān)的自訴癥狀、細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞水平等具有益處[12-13]。而山羊乳作為我國(guó)重要的動(dòng)物乳源，對(duì)其LPN的研究還較少。

牛乳L(zhǎng)PN的生理功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，特別RGD序列和酶解后可暴露的隱蔽基序，是其發(fā)揮作用促進(jìn)細(xì)胞黏附的特有結(jié)構(gòu)，可與細(xì)胞表面的αvβ3等整合素結(jié)合或CD44受體結(jié)合，并介導(dǎo)一系列細(xì)胞代謝過(guò)程[21]。在生命早期，LPN有助于促進(jìn)大腦、腸道以及免疫發(fā)育，這些作用中有許多是通過(guò)LPN與整合素結(jié)合介導(dǎo)的，特別是αvβ3整合素受體[22]。山羊乳和牛乳L(zhǎng)PN在RGD序列和隱藏基序方面完全一致，表明山羊乳L(zhǎng)PN也應(yīng)該具有同樣的整合素或CD44受體結(jié)合能力。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，山羊乳和牛乳L(zhǎng)PN在序列上存在高度的一致性，表現(xiàn)在完全相同的氨基酸比例高達(dá)90.94%。同時(shí)，在比較人乳L(zhǎng)PN與山羊乳和牛乳L(zhǎng)PN的序列后發(fā)現(xiàn)，完全相同的氨基酸比例均超過(guò)一半，呈現(xiàn)出較高的相似性，可能提示兩者與人乳L(zhǎng)PN之間具有相似的生物活性。

牛乳L(zhǎng)PN是高度磷酸化并具有O-糖基化修飾的蛋白質(zhì)[17]。研究表明，磷酸化和糖基化修飾的改變可影響不同來(lái)源的OPN與細(xì)胞表面受體的結(jié)合從而影響功能。比如，破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶導(dǎo)致的部分去磷酸化的OPN對(duì)破骨細(xì)胞的細(xì)胞黏附活性降低[23]。正常大鼠腎細(xì)胞分泌的磷酸化和非磷酸化形式的OPN表現(xiàn)出不同的細(xì)胞表面相互作用和可溶性纖連蛋白的復(fù)合物形成情況[24]。只有磷酸化形式的OPN與整合素αvβ3結(jié)合并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的白介素-12表達(dá)[25]。而糖基化修飾不僅影響磷酸化，還影響LPN的細(xì)胞黏附活性[26]。本次研究結(jié)果顯示，山羊乳L(zhǎng)PN和牛乳L(zhǎng)PN的磷酸化修飾存在較高的一致性，表現(xiàn)在可能的磷酸化位點(diǎn)完全一致，并且對(duì)于完全磷酸化的位點(diǎn)、完全無(wú)磷酸化修飾的位點(diǎn)的位點(diǎn)覆蓋率完全一致，但是需要注意的是，一些存在不同程度磷酸化的位點(diǎn)在山羊乳L(zhǎng)PN和牛乳L(zhǎng)PN間存在位點(diǎn)覆蓋率的不同。并且山羊乳L(zhǎng)PN未鑒定到O-糖基化修飾，而牛乳L(zhǎng)PN可鑒定到1個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)。在氨基酸序列、結(jié)合序列、修飾位點(diǎn)基本一致的情況下，部分位點(diǎn)覆蓋率和少數(shù)的修飾位點(diǎn)不同，是否會(huì)影響山羊乳L(zhǎng)PN和牛乳L(zhǎng)PN的生物活性還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果顯示，山羊乳和牛乳L(zhǎng)PN在序列上存在高度的一致性，表現(xiàn)在完全相同的氨基酸比例高達(dá)90.94%，均存在同樣的整合素蛋白結(jié)合序列，磷酸化修飾位點(diǎn)基本一致。當(dāng)位點(diǎn)為無(wú)磷酸化修飾和完全磷酸化修飾時(shí)，山羊乳L(zhǎng)PN與牛乳L(zhǎng)PN完全一致，但當(dāng)位點(diǎn)上同時(shí)存在無(wú)磷酸化修飾和不同數(shù)量的磷酸化修飾時(shí)，山羊乳L(zhǎng)PN和牛乳L(zhǎng)PN的一些位點(diǎn)存在差異。此外，山羊乳L(zhǎng)PN未鑒定到O-糖基化修飾，而牛乳L(zhǎng)PN可鑒定到1個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)。這些結(jié)果提示，盡管山羊乳L(zhǎng)PN和牛乳L(zhǎng)PN的部分蛋白質(zhì)修飾具有一定的程度差異，但主要的功能序列和大多數(shù)磷酸化修飾具有較高的相似性，山羊乳L(zhǎng)PN可能具有與牛乳L(zhǎng)PN相似的生物活性。