過表達(dá)SIRT1通過上調(diào)幽門螺桿菌感染的胃癌細(xì)胞自噬通量以促進(jìn)其凋亡并抑制炎癥因子釋放①

郭偉勝 付利然 張 娟 趙 林 魏光亞 （河南省中醫(yī)院普外科，鄭州 450000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）是最常見的人類病原體之一，其感染人數(shù)可達(dá)世界總?cè)丝诘?/2，且能夠在無抗生素干預(yù)的條件下長期持續(xù)存在［1］。Hp感染通?？梢鹇匝装Y和細(xì)胞損傷，并通過慢性胃炎、腸上皮化生，非典型增生等Correa級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致胃癌發(fā)生［2-3］。既往研究認(rèn)為，Hp是一種胞外定植的細(xì)菌，但越來越多的證據(jù)表明Hp具有兼性胞內(nèi)性質(zhì)，即細(xì)菌能夠在胃上皮細(xì)胞內(nèi)存活甚至繁殖［4-5］。而Hp的上述生存方式不僅能使其逃避先天性免疫反應(yīng)，還能對相關(guān)根除治療產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性［6］。但迄今為止，Hp誘導(dǎo)胞內(nèi)定植及生存繁殖的相關(guān)機(jī)制卻知之甚少。

自噬是一個(gè)進(jìn)化保守的過程，可分為兩個(gè)步驟。首先，雙膜自噬體形成并隔離細(xì)胞內(nèi)成分；其次，自噬-溶酶體合并最終降解自噬體內(nèi)容物，后一步也被稱為自噬通量［7-8］。自噬可被多種有害刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，并在防止病原體感染和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用。近期有研究報(bào)道，在自噬通量發(fā)生前，Hp可誘導(dǎo)自噬體形成，并能在其中進(jìn)行繁殖，但當(dāng)自噬通量發(fā)生時(shí)，細(xì)胞能以溶酶體依賴的方式清除Hp，即Hp可能通過抑制細(xì)胞中自噬通量增加胞內(nèi)細(xì)菌的存活和定植，但其拮抗自噬通量的具體機(jī)制仍有待闡明［9-10］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1，SIRT1）屬于Ⅲ類組蛋白去乙?；?，其能夠通過一系列轉(zhuǎn)錄因子的去乙?；閷?dǎo)自噬，從而對細(xì)胞的增殖、代謝與凋亡等過程產(chǎn)生重要作用［11］。同時(shí)，有數(shù)據(jù)表明SIRT1可通過上調(diào)細(xì)胞中自噬通量促進(jìn)自噬發(fā)生［12］。在胃癌中，SIRT1被認(rèn)為是胃癌良好的預(yù)后因子，其在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴浸潤呈負(fù)相關(guān)，而與生存率提高呈正相關(guān)［13］。但在Hp感染的胃癌細(xì)胞中，SIRT1是否參與Hp介導(dǎo)的自噬通量抑制及其相關(guān)作用尚無報(bào)道，因此本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究SIRT1在Hp感染的胃癌細(xì)胞中的作用及其相關(guān)機(jī)制，以期為治療Hp誘導(dǎo)的胃癌提供新的策略及可能的研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本來源 收集自2018年1月至2020年10月于河南省中醫(yī)院就診并行部分或全部胃切除術(shù)的68例胃癌患者（男性45例，女性23例，中位年齡56歲，年齡27～79歲），其中通過活檢或術(shù)后病理確認(rèn)共有37例Hp陰性患者，設(shè)為GC（Hp-）組，31例Hp陽性患者，設(shè)為GC（Hp+）組，同時(shí)從37例Hp-陰性患者的胃癌手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本中，選取32例癌旁（≥3 cm）正常胃黏膜組織樣本設(shè)為正常對照（Normal）組。受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：均為原發(fā)性胃癌，無合并其他器官或系統(tǒng)的惡性腫瘤，且既往無放療或化療史。本研究通過河南省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有受試者或其親屬均簽署知情同意告知書。

1.1.2 菌株、細(xì)胞系與主要試劑 Hp 26695標(biāo)準(zhǔn)菌株（CagA+/VacA-）購自中國疾病控制中心；胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MNK45、HGC27和SGC-7901均購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)液、0.25%含EDTA的胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（美國Gibco公司）；兔抗SIRT1、Bcl-2單克隆抗體、兔抗LCB、SQSTM1/p62多克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗Bad、cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3單克隆抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Annexin V-FITC/PI試劑盒（江蘇碧云天生物科技有限公司）；DAB染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT、SYBR Green定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的RT-PCR試劑盒、PrimeScript RT Master Mix（日本Ta-KaRa公司）；攜帶過表達(dá)SIRT1及陰性對照序列質(zhì)粒的慢病載體（LV-SIRT1與LV-NC）由廣州銳博生物有限公司合成及鑒定；mRFP-EGFP-LC3B質(zhì)粒（上海欽誠生物科技有限公司）；TRIzol（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC） 將1.1中收集的組織樣本置于4%福爾馬林中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋并切片至4 μm，二甲苯透明，梯度乙醇脫蠟至水后，置于10 mmol/L（pH=6.0）檸檬酸緩沖液中微波抗原提取20 min，隨后3%過氧化氫溶液常溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，山羊血清進(jìn)行抗體封閉后，加入稀釋后的SIRT1抗體（1∶800）于4 ℃下孵育過夜，PBS充分洗滌后，添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）并于室溫下孵育2 h，DAB試劑染色20 min，最后蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。使用雙盲法，分別由兩位高年資病理科醫(yī)師根據(jù)文獻(xiàn)［14］方法評(píng)估染色強(qiáng)度與特定染色強(qiáng)度細(xì)胞的百分比判定樣本結(jié)果。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染 使用含10%FBS與1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì) 胞 系A(chǔ)GS、MNK45、HGC27和SGC-7901，置 于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的AGS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/ml接種至6孔板，培養(yǎng)過夜后，更換培養(yǎng)基為opti-MEM溶液，使用過表達(dá)SIRT1及陰性序列的慢病毒載體LV-SIRT與LV-NC感染AGS細(xì)胞48 h后，以8 μg/ml嘌呤霉素處理感染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選以建立穩(wěn)定感染細(xì)胞系，RT-PCR檢測感染效率。

1.2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集慢病毒感染后的AGS細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，分光光度計(jì)測定其濃度后，使用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照SYBR Green定量聚合鏈反應(yīng)試劑盒說明書方法進(jìn)行 RT-PCR。SIRT1（F）：5＇-AACCTCCTGTTGACCGATG-3＇，SIRT1（R）：5＇-CCGTCTCTTGATCTGAAGTCA-3＇；CagA（F）：5＇-ATAATGCTAAATTACACAACT-3＇，CagA（R）：5＇-TTAGAATAATCAACAACATC-3＇；β-actin（F）：5＇-CCTGGCACCCAGCACAAT-3＇，β-actin（R）：5＇-GGGCCGGACTCGTCATAC-3＇。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析SIRT1表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.4 Hp的感染及細(xì)胞分組 在37 ℃微氧環(huán)境（5%O2、10%CO2、85%N2）下使用含10%羊血清的彎曲弧菌瓊脂培養(yǎng)板進(jìn)行Hp培養(yǎng)。取上述慢病毒感染后的AGS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/孔接種至6孔板中培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞生長融合至80%左右時(shí)，去除原培養(yǎng)液，更換為含0.5%FBS的新鮮培養(yǎng)基。收集Hp菌落，使用布魯氏菌肉湯制成細(xì)菌懸液，分光光度計(jì)在660 nm波長處測定細(xì)菌密度，參考文獻(xiàn)［15］按感染復(fù)數(shù)（MOI）=100加入AGS及轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，并將其分為4組：LV-NC組、LVSIRT1組、Hp感染的LV-NC組（Hp+LV-NC）和Hp感染的LV-SIRT1組（Hp+LV-SIRT1），置于37 ℃微氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 mRFP-EGFP-LC3B熒光顯微鏡觀察 取慢病毒感染后胃癌細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種至蓋玻片，培養(yǎng)過夜后，按Lipofectaimin3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將100 nmol/L的mRFP-EGFP-LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入各組胃癌細(xì)胞中，按1.2.4方法進(jìn)行Hp感染后，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，熒光顯微鏡隨機(jī)每組取5個(gè)視野進(jìn)行觀察拍照。串聯(lián)mRFP-EGFP-LC3B熒光蛋白質(zhì)粒發(fā)出mRFP的紅色斑點(diǎn)熒光時(shí)表示自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，提示自噬流通暢；而發(fā)出mRFP的紅色熒光與EGFP綠色熒光Merge后的黃色或橙黃色斑點(diǎn)熒光時(shí)，表示未與溶酶體結(jié)合的自噬體，提示自噬流受阻。即根據(jù)紅、黃熒光斑點(diǎn)可顯示細(xì)胞中自噬流情況。

1.2.6 ELISA 取1.2.4中的各組胃癌細(xì)胞，取細(xì)胞上清液，室溫下2 200 r/min離心10 min后，根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法檢測各組胃癌細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測各組胃癌細(xì)胞凋亡率。簡述如下：收集各組胃癌細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，取約2×105個(gè)細(xì)胞至流式管中，200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，加入10 μl Annexin V-FITC與5 μl PI溶液，室溫下避光孵育15 min，最后加入300 μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 樣本組織或細(xì)胞在含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解，BCA法檢測蛋白濃度，加熱變性后，取約25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，5%脫脂奶粉于室溫下孵育1 h進(jìn)行抗體封閉，加入適當(dāng)稀釋后的一 抗：SIRT1（1∶500）、CagA（1∶1 000）、LC3B（1∶ 1 000）、p62（1∶1 000）、Bcl-2（1∶800）、Bad（1∶800）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶ 1 000）、β-actin（1∶1 500） 4 ℃孵育過夜，加入稀釋后的二抗（1∶5 000）于室溫下孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中拍照，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。其中CagA蛋白被認(rèn)為是Hp誘導(dǎo)胃癌產(chǎn)生的主要原因，且我國大部分胃癌患者均為CagA+的Hp菌株［16-18］，因此使用Western blot檢測胃癌樣本中CagA蛋白表達(dá)對感染Hp的組織進(jìn)行鑒定與校對。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù) 3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用LSD-t進(jìn)行多重比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在胃癌組織中的表達(dá) IHC結(jié)果顯示，與Normal組相比，SIRT1在Hp+胃癌組織中表達(dá)強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05），在Hp-胃癌組稍有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Hp-胃癌組相比，SIRT1在Hp+胃癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05，圖1A）；Western blot結(jié)果表明，SIRT1在Hp+胃癌組織中蛋白表達(dá)水平較Normal組和Hp-胃癌組織顯著降低（P＜0.05）；Hp+胃癌組織中CagA表達(dá)水平較Normal組和Hp-胃癌組明顯提高（P＜0.01），且后兩組樣本中SIRT1與CagA差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1B）。

圖1 SIRT1在Hp+胃癌組織中表達(dá)異常降低Fig.1 Abnormal decreased expression of SIRT1 in Hp+ gastric cancer tissues

2.2 Hp感染對胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，SIRT1在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中表達(dá)顯著高于MNK45、HGC27和SGC-7901細(xì)胞（P＜0.05，圖2A）；RT-PCR檢測結(jié)果顯示AGS細(xì)胞中CagA mRNA表達(dá)水平隨Hp刺激時(shí)間延長而升高（P＜0.05），48 h呈穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)（圖2B）；同時(shí)，AGS細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)水平逐漸降低，與0 h相比，Hp刺激12 h后上述細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），且以48 h的降低幅度最為顯著 （P＜0.01，圖2C），提示Hp感染可時(shí)間依賴性地降低胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)。因此，后續(xù)選擇Hp感染48 h后的AGS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖2B）。

圖2 Hp感染降低胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)Fig.2 Hp infection reduces SIRT1 expression in gastric cancer cells

2.3 過表達(dá)SIRT1的慢病毒載體感染后對胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與感染LC-NC組相比，LV-SIRT1組中SIRT1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，圖3A）；Western blot檢測結(jié)果顯示，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組中SIRT1蛋白水平明顯升高（P＜0.05），Hp+LV-NC組與Hp+LVSIRT1組中SIRT1表達(dá)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），但與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組明顯升高（P＜0.05，圖3B）。

圖3 慢病毒感染提高胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)Fig.3 Lentivirus infection increases SIRT1 expression in gastric cancer cells

2.4 過表達(dá)SIRT1對胃癌細(xì)胞自噬水平的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與LV-NC組相比，LVSIRT1組、Hp+LV-NC組和Hp+LV-SIRT1組中自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ均明顯增加（P＜0.05），LVSIRT1組中SQSTM1/p62蛋白水平明顯降低（P＜0.05），但Hp+LV-NC組 和Hp+LV-SIRT1組 中SQSTM1/p62蛋白水平均明顯增加（P＜0.05）；與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ無明顯變化（P＞0.05），SQSTM1/p62蛋白明顯降低（P＜0.05，圖4A）。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組中出現(xiàn)大量紅色熒光斑點(diǎn)，而Hp+LV-NC組和Hp+LV-SIRT1組中呈黃色熒光斑點(diǎn)，即Hp感染促進(jìn)了胃癌細(xì)胞中自噬通量的抑制；而與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組中紅色熒光斑點(diǎn)明顯增多，提示過表達(dá)SIRT1能改善Hp對胃癌細(xì)胞中自噬通量的抑制作用（圖4B）。

圖4 過表達(dá)SIRT1改善Hp對胃癌細(xì)胞中自噬流的抑制 作用Fig.4 Overexpression of SIRT1 improves inhibitory effect of Hp on autophagy flow in gastric cancer cells

2.5 過表達(dá)SIRT1對Hp感染的胃癌細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的影響 ELISA結(jié)果顯示，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但Hp+LVNC組和Hp+LV-SIRT1組中上述炎癥因子均顯著增加（P＜0.05）；與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組中TNF-α、IL-1β和IL-8表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 ELISA檢測各組胃癌細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-8表達(dá)水平（±s，pg/ml）Tab.1 Expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-8 in supernatant of gastric cancer cells in each group were detected by ELISA （±s，pg/ml）

表1 ELISA檢測各組胃癌細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-8表達(dá)水平（±s，pg/ml）Tab.1 Expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-8 in supernatant of gastric cancer cells in each group were detected by ELISA （±s，pg/ml）

Note：Compared with LV-NC group， 1）P＜0.05； compared with Hp+LVNC group， 2）P＜0.05.

2.6 過表達(dá)SIRT1對Hp感染胃癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與LV-NC組相比，LV-SIRT1組與Hp+LV-SIRT1組胃癌細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），而Hp+LV-NC組凋亡率無明顯變化（P＞0.05）；與Hp+LV-NC組相比，Hp+LV-SIRT1組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 過表達(dá)SIRT1上調(diào)Hp感染胃癌細(xì)胞凋亡率Fig.5 Overexpression of SIRT1 up-regulates apoptosis rate of Hp infected gastric cancer cells

2.7 過表達(dá)SIRT1對Hp感染胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測各組胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bad及cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3的表達(dá)結(jié)果顯示，與LV-NC相比，LV-SIRT1組與Hp+LV-SIRT1組中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低（P＜0.05），而促凋亡相關(guān)蛋白Bad及cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Hp+LV-NC組上述蛋白指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Hp+LV-NC組相比，Hp+LVSIRT1組Bcl-2明顯降低（P＜0.05），而Bad及cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3明顯升高（P＜0.05， 圖6）。

圖6 Western blot檢測各組胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expressions of apoptosis-related proteins in gastric cancer cells of each group was detected by Western blot

3 討論

Hp是胃癌發(fā)展中公認(rèn)的確定因素之一，流行病學(xué)資料顯示，約90%的胃癌可歸因于Hp感染，而根除Hp可將胃癌的發(fā)病率降至原來的1/3以下［19-21］。自噬作為進(jìn)化中的保守過程，不僅可作為一種防御機(jī)制被激活以消除病原體感染，還能在癌癥中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)［22-23］。研究表明，Hp在急性感染期間可通過分泌多種毒力因子來干擾胃黏膜上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能，而此時(shí)自噬作為一種重要的防御機(jī)制，可通過溶酶體等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以限制Hp的生存與繁殖。但發(fā)生慢性感染時(shí)，Hp可通過誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白的功能發(fā)生障礙，使細(xì)胞中自噬水平出現(xiàn)抑制，以維持其持續(xù)感染［24］。然而，Hp在其中的作用及相關(guān)機(jī)制仍不清楚。本研究結(jié)果表明，Hp感染可抑制胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平，但在利用慢病毒過表達(dá)細(xì)胞中SIRT1可通過削弱Hp對腫瘤細(xì)胞中自噬通量的抑制作用上調(diào)細(xì)胞自噬水平，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

SIRT1是一類煙堿氨酰嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶，其可通過乙酰化組蛋白和許多非組蛋白靶點(diǎn)參與影響腫瘤的發(fā)展、能量穩(wěn)態(tài)、自噬、DNA損傷與修復(fù)及炎癥等病理生理過程。同時(shí)，SIRT1的表達(dá)水平也是包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的預(yù)后指標(biāo)。有研究報(bào)道，SIRT1在裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)外均能抑制胃癌細(xì)胞生長，且過表達(dá)后可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路活性抑制細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)展［25］。此外，白藜蘆醇能以SIRT1依賴的方式在荷瘤小鼠體內(nèi)外抑制胃癌的進(jìn)程，研究也表明SIRT1在胃癌發(fā)展中的抑癌作用［26］。然而，在其他研究中則報(bào)道了SIRT1在胃癌中的促進(jìn)作用。如，CHA等［27］利用組織芯片和IHC對177例胃癌患者的組織樣本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，73%（130/177）的胃癌患者出現(xiàn)SIRT1陽性表達(dá)，同時(shí)FENG等［28］研究表明，胃癌組織中高表達(dá)的SIRT1與患者腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的侵襲程度呈正相關(guān)。LI等［29］則利用動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)胃癌肥胖小鼠中SIRT1表達(dá)水平顯著高于瘦小鼠，且上調(diào)促生存Nampt/SIRT1/c-myc正反饋環(huán)表達(dá)可增強(qiáng)小鼠前胃癌細(xì)胞的遷移、增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)降低細(xì)胞凋亡。因此，SIRT1在胃癌發(fā)展中的矛盾作用仍有待進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)通過IHC及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1在Hp陽性胃癌組織樣本中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織與Hp陰性胃癌組織，且體外研究表明，隨Hp刺激時(shí)間延長，胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)明顯降低，提示Hp感染可能是影響SIRT1在胃癌中表達(dá)的作用因素之一。

同時(shí)，作為一種乙?；傅鞍?，SIRT1介導(dǎo)的自噬在細(xì)胞增殖、凋亡和抵抗細(xì)胞應(yīng)激中同樣具有重要地位。如白藜蘆醇可通過SIRT1依賴的方式增強(qiáng)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的受損自噬通量，并通過自噬-溶酶體途徑改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬功能以保護(hù)其功能［12］。在急性胰腺炎小鼠模型體內(nèi)外的研究中發(fā)現(xiàn)，溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain containing 4，BRD4）能夠通過促進(jìn)胰腺組織中SIRT1表達(dá)上調(diào)自噬通量，從而促進(jìn)胰腺腺泡的損傷和促炎因子表達(dá)，而抑制BRD4介導(dǎo)的SIRT1表達(dá)能有效減輕疾病進(jìn)展［30］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SIRT1能顯著改善Hp誘導(dǎo)的自噬通量受損情況，即促進(jìn)胃癌細(xì)胞中的自噬水平，同時(shí)還能顯著降低Hp誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-8釋放。其中TNF-α、IL-1β和IL-8是Hp感染相關(guān)炎癥研究較為廣泛的細(xì)胞因子，其在胃癌患者的血清和組織中均異常升高［31-32］。自噬與凋亡的動(dòng)態(tài)演變是決定細(xì)胞生死存亡的兩個(gè)重要生理過程，最近的數(shù)據(jù)顯示，自噬的調(diào)節(jié)早于凋亡的發(fā)生，且自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與胃腸道腫瘤細(xì)胞的自噬性凋亡密切相關(guān)［33］。本研究表明，過表達(dá)SIRT1不僅能促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，還可顯著削弱Hp感染引起的凋亡抑制作用，這可能與促凋亡相關(guān)蛋白Bad、cleaved caspase-9與cleaved-caspase-3的升高和凋亡抑制蛋白Bcl-2的降低有關(guān)。

綜上，本研究表明SIRT1在Hp陽性的胃癌組織中異常降低，且Hp感染能抑制胃癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)，而過表達(dá)胃癌細(xì)胞中的SIRT1能通過削弱Hp誘導(dǎo)的自噬通量受損現(xiàn)象上調(diào)細(xì)胞的自噬水平，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并降低炎癥因子表達(dá)。后期課題組將在動(dòng)物模型中進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證上述結(jié)論，并深入探究SIRT1這一作用的相關(guān)分子機(jī)制，以期為Hp感染相關(guān)胃癌的預(yù)防及治療提供更有效的策略。