蔣剛健 胡 淼 胡東坡 (漯河市中心醫(yī)院檢驗科,漯河 462000)
支氣管上皮細胞是維持機體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障,可防御微生物等病原菌感染,支氣管上皮細胞損傷與感染性疾病發(fā)生密切相關(guān),而炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等是導致支氣管上皮細胞損傷的重要原因,如何減輕支氣管上皮細胞損傷已成為研究重點,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成,可誘發(fā)炎癥反應(yīng),并可作為支氣管上皮細胞損傷體外研究的重要誘導因子[1-2]。支氣管上皮細胞損傷的機制尚未闡明。微小RNA(miRNA)在支氣管上皮細胞中表達異常,并參與 支氣管上皮細胞損傷過程[3-4]。支氣管哮喘患兒miR-98-5p表達降低,并參與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展過程[5]。starbase預測顯示缺氧誘導因子1-α抑制劑(HIF1AN)可能是miR-98-5p的靶基因,在心肌缺血再灌注損傷中表達升高,抑制其表達可減輕心肌缺血再灌注損傷[6]。本研究主要探討miR-98-5p與HIF1AN對LPS誘導的支氣管上皮細胞損傷的影響及可能作用機制。
1.1 材料 人正常支氣管上皮細胞16-HBE購自美國ATCC細胞庫;LPS購自北京百奧萊博科技有限公司;TNF-α、IL-6、IL-1α檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司;Lipofectamine2000購自北京宜科思源科技有限公司;Trizol試劑購自上海索寶生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR檢測試劑盒購自上海迪奧生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI雙染法檢測試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司;miR-98-5p mimics及其陰性對照miR-NC、 si-HIF1AN及其陰性對照si-NC、anti-miR-98-5p及其陰性對照anti-miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司;pcDNA3.1購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;兔抗人Cleaved-caspase-3抗體購自美國CST;兔抗人HIF1AN、BNIP3抗體購自美國Abcam;二抗購自武漢艾美捷。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組 16-HBE細胞以5×103個/孔接種于96孔板,加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液刺激24 h, 記為LPS組[7]。正常培養(yǎng)的細胞記為NC組。參照Lipofectamine2000試劑說明分別將miR-NC、miR-98-5p mimics、si-NC、si-HIF1AN、pcDNA-NC、pcDNAHIF1AN、miR-98-5p mimics與pcDNA-NC、miR-98-5p mimics與pcDNA-HIF1AN轉(zhuǎn)染至16-HBE細胞,加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液刺激24 h,分別記為miR-NC+LPS組、miR-98-5p+LPS組、si-NC+LPS組、si-HIF1AN+LPS組、pcDNA-NC+LPS組、pcDNA-HIF1AN+LPS組、miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組、miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組。
1.2.2 qRT-PCR檢測細胞miR-98-5p、HIF1AN mRNA表達 取各組16-HBE細胞,采用Trizol法提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄過程嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(yīng),按照試劑盒說明書操作,7500Fast型熒光定量PCR儀檢測miR-98-5p、HIF1AN mRNA相對表達。
1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取各組16-HBE細胞加入預冷PBS洗滌,棄上清,加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞,按照凋亡試劑盒說明書檢測細胞 凋亡率。
1.2.4 ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平 取各組細胞上清,ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平,嚴格按照試劑盒說明書操作。
1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-98-5p與HIF1AN的靶向關(guān)系 分別構(gòu)建野生型載體WTNek6與突變型載體MUT-Nek6,分別將miR-NC、miR-98-5p mimics與WT-HIF1AN、MUT-HIF1AN共轉(zhuǎn)染至16-HBE細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,檢測細胞熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-98-5p mimics、antimiR-NC、anti-miR-98-5p轉(zhuǎn)染至16-HBE細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細胞,Western blot檢測HIF1AN蛋白水平。
1.2.6 Western blot檢測HIF1AN、Cleaved-caspase-3、BNIP3蛋白表達 16-HBE細胞加入500 μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,分別加入兔抗人Cleaved-caspase-3、兔抗人HIF1AN、BNIP3一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育24 h,加入二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h,滴加ECL,暗室內(nèi)曝光顯影,Image J軟件分析各條帶灰度值。
1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 LPS對16-HBE細胞miR-98-5p和HIF1AN表達的影響 與NC組比較,LPS組miR-98-5p表達降低(P<0.05),HIF1AN mRNA及蛋白表達升高(P<0.05),見圖1。
圖1 LPS對人正常支氣管上皮細胞16-HBE miR-98-5p 和HIF1AN表達的影響Fig.1 Effect of LPS on expressions of miR-98-5p and HIF1AN in human normal bronchial epithelial cells 16-HBE
2.2 過表達miR-98-5p對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響 與NC組比較,LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高(P<0.05);與LPS組比較,miR-98-5p+LPS組凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平降低(P<0.05),見圖2。
圖2 過表達miR-98-5p對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡 和炎癥因子的影響Fig.2 Effects of overexpression of miR-98-5p on apoptosis and inflammatory factors in LPS-induced 16-HBE cells
2.3 低表達HIF1AN對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響 與si-NC+LPS組比較,si-HIF1AN+LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平降低(P<0.05),見圖3。
2.4 miR-98-5p靶向HIF1AN starbase預測顯示,miR-98-5p與HIF1AN存在結(jié)合位點(圖4A)。miR-98-5p過表達可降低野生型載體WT-HIF1AN熒光素酶活性(P<0.05);miR-98-5p可負調(diào)控HIF1AN表達(P<0.05,圖4B、C)。
圖4 miR-98-5p靶向調(diào)控HIF1AN表達Fig.4 miR-98-5p targeting regulates HIF1AN expression
2.5 過表達HIF1AN可逆轉(zhuǎn)miR-98-5p對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響 與pcDNANC+LPS組比較,pcDNA-HIF1AN+LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高(P<0.05);與miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組比較,miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高(P<0.05),見圖5。
圖5 過表達HIF1AN可逆轉(zhuǎn)miR-98-5p對LPS誘導的 16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響Fig.5 Overexpression of HIF1AN reverses effects of miR-98-5p on LPS-induced 16-HBE cells apoptosis and inflammatory factors
2.6 HIF-1α/BNIP3信號通路蛋白表達 與NC組比較,LPS組BNIP3蛋白表達升高(P<0.05);與miRNC+LPS組比較,miR-98-5p+LPS組BNIP3蛋白表達降低(P<0.05);與miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組比較,miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組BNIP3蛋白表達升高(P<0.05),見圖6。
圖6 BNIP3蛋白表達Fig.6 BNIP3 protein expression
miRNA在支氣管細胞損傷中表達異常并參與細胞損傷過程,如miR-Let-7f-1-3p通過靶向FOXO1抑制煙氣誘導的支氣管上皮細胞凋亡[8];miR-34a表達上調(diào)抑制支氣管上皮細胞凋亡[9];miR-216a-5p通過靶向HMGB1/NF-κB途徑保護支氣管上皮細胞免受氧化應(yīng)激損傷[10]。表明miRNA可能成為減輕支氣管上皮細胞損傷的作用靶點。
miR-98-5p在兒童支氣管哮喘中呈低表達,并可能作為篩查兒童支氣管哮喘的生物標志物[11]。miR-98-5p通過靶向Hmga2減輕糖尿病腎病上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腎纖維化[12]。miR-98-5p通過抑制Bach1減輕氧葡萄糖剝奪/復氧誘導的神經(jīng)元損傷[13]。但miR-98-5p與支氣管上皮細胞損傷的相關(guān)研究尚未見報道。本研究顯示,LPS誘導的支氣管上皮細胞中miR-98-5p表達降低,提示miR-98-5p在支氣管上皮細胞損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究顯示,LPS可提高支氣管上皮細胞凋亡率及Cleavedcaspase-3表達,與既往研究結(jié)果相似[14],提示細胞損傷模型構(gòu)建成功。本研究進一步分析顯示,miR-98-5p過表達可降低細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3 表達。炎癥反應(yīng)加重可引起細胞凋亡,本研究深入分析顯示,LPS可提高炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平,而miR-98-5p過表達可明顯降低TNF-α、IL-6、 IL-1α水平,提示miR-98-5p過表達可能通過抑制炎癥反應(yīng)抑制細胞凋亡,進而減輕細胞損傷。
本研究證實HIF1AN是miR-98-5p的靶基因。下調(diào)HIF1AN表達可減輕心肌缺血損傷發(fā)揮心臟保護作用[15]。miR-1-3p通過與HIF1AN作用增強MC3T3-E1細胞成骨細胞分化[16]。miR-214可能通過靶向HIF1AN減輕心肌缺血再灌注損傷[17]。但HIF1AN在支氣管上皮細胞損傷中的作用機制尚未可知。本研究顯示,LPS可提高支氣管上皮細胞HIF1AN與BNIP3表達,進一步分析顯示HIF1AN過表達可明顯拮抗miR-98-5p過表達對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡及炎癥的抑制作用。
綜上,miR-98-5p可通過抑制HIF1AN表達抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡及炎癥反應(yīng),減輕支氣管上皮細胞損傷,為進一步闡釋支氣管上皮細胞損傷的分子機制奠定了基礎(chǔ)。但miR-98-5p是否可通過靶向調(diào)控其他靶基因發(fā)揮作用及其具體作用機制仍需進一步探究。