MBD2對Th2/Th17細(xì)胞平衡的調(diào)控及其在哮喘中的作用研究①

馬乙云 鄭亞妹 許玉妮 （海南省人民醫(yī)院， 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院檢驗(yàn)科，?？?70311）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是常見的一種呼吸系統(tǒng)慢性疾病，其特征是氣道反應(yīng)性增高，臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和（或）咳嗽等癥狀，嚴(yán)重者可危及生命［1］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，我國約有超3 000萬哮喘患者，病死率高達(dá)49.2/10萬，居世界第一，給社會及家庭造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。眾所周知，Th細(xì)胞比例失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中占重要地位［3］。大量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥類型是臨床上最常見的哮喘類型，其次是以嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞混合浸潤的氣道炎癥類型（又被稱為以中性粒細(xì)胞主導(dǎo)的哮喘），而后者對經(jīng)典的糖皮質(zhì)激素吸入性治療方法并不敏感［3-4］。而中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的哮喘并不依賴經(jīng)典的Th2細(xì)胞途徑，研究表明其主要以Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子為主［3，5］。

甲基CpG結(jié)合區(qū)域蛋白2（methyl-CpG binding domain protein 2，MBD2）能夠特異性結(jié)合靶基因的啟動子區(qū)域，并通過招募其他分子改變組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)［6］。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)MBD2能夠調(diào)控多種基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子傳導(dǎo)抑制蛋白3（SOCS3），干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-α）的表達(dá)而參與Th17細(xì)胞的分化［7-9］。然而，均未在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)地探究MBD2對哮喘發(fā)病及Th2與Th17細(xì)胞分化的影響。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過屋塵螨聯(lián)合卵清蛋白與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對條件基因敲除小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)重癥哮喘模型，觀察MBD2在其發(fā)病過程中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 由南方模式動物研究中心應(yīng)用Cre-flox體系與Crisper-cas9 方法構(gòu)建C57BL/6小鼠的CD4CreMBD2fl/fl及MBD2fl/fl對照品系（WT）；屋塵螨（house dust mite，HDM）（美國Greer公司）；LPS、氫氧化鋁凝膠、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、乙酰膽堿（methacholine，Mch）（美國Sigma公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；4%甲醛、戊巴比妥鈉（武漢博士德生物公司）；FITC、APC、PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4（FITC-CD4）、IL-17（APC-IL-17）及IL-4（PEIL-4）（美國Biolegend公司）；CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒（德國Miltenyi生物公司）；攜帶靶向沉默MBD2基因的siRNA（si-MBD2）與陰性對照序列si-NC的慢病毒載體（廣州銳博生物科技有限公司）；SYBR Green Real-time PCR （上海索萊寶生物公司）；IL-4、IL-17 ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；大鼠抗Gr1、Ecp、GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司）；大鼠抗MBD2單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG（廣州晶彩生物公司）；HE染色試劑盒（江蘇碧云天生物公司）；RT-PCR引物由上海生工合成；其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠哮喘模型的制備及分組 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將雌性WT小鼠與CD4CreMBD2fl/fl隨機(jī)分為 4組，分別記為WT生理鹽水組，WT哮喘組，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組，CD4CreMBD2fl/fl哮喘組，每組10只。參考既往文獻(xiàn)［9］方法，使用如下方法構(gòu)建哮喘小鼠模型：將含有100 μg HDM、100 μg OVA、15 μg LPS、2 mg氫氧化鋁的200 μl生理鹽水于第0、1、2天經(jīng)腹腔注射至WT哮喘組和CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠體內(nèi)進(jìn)行致敏，并于第14、15、18和19天時，使用6%OVA液霧化上述小鼠30 min后在鼻內(nèi)注射10 μg/μl的HDM進(jìn)行激發(fā)。WT生理鹽水組和CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠僅使用生理鹽水進(jìn)行致敏及刺激，處理方法及時間與哮喘組一致。認(rèn)真觀察并記錄所有小鼠在實(shí)驗(yàn)期間的行為改變，如呼吸節(jié)奏的改變、打噴嚏的頻率，情緒是否易怒、躁動等，大小便有無失禁，是否出現(xiàn)易疲倦、嗜睡等哮喘相關(guān)癥狀樣改變。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均于第21天時處死。

1.2.2 氣道高發(fā)反應(yīng)（airway hyperreactivity，AHR）檢測 參考文獻(xiàn)［9］方法在第21天時（即最后一次激發(fā)的24 h）通過Buxco肺功能直接容積描記儀檢測Mch誘導(dǎo)下的氣道阻力變化，步驟如下：應(yīng)用10%的水合氯醛麻醉小鼠，切開氣管進(jìn)行插管，首先測定肺阻力基線值1 min，然后予以10 μl生理鹽水及濃度呈遞增趨勢（0.39、0.78、1.56、3.12 mg/ml） 10 μl Mch進(jìn)行刺激氣道，再次記錄肺阻力值。取各組小鼠各個刺激物質(zhì)及濃度的平均值進(jìn)行分析計(jì)算并繪制小鼠氣道反應(yīng)曲線，以表示AHR的高低。

1.2.3 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集 根據(jù)文獻(xiàn)［10］方法收集BALF，處死小鼠后，切開小鼠氣管并插入氣管導(dǎo)管，暴露肺臟，摘取小鼠左肺并用絲線結(jié)扎斷端后，向?qū)Ч軆?nèi)注入0.5 ml無菌生理鹽水灌洗右肺并回收BALF，重復(fù) 3次。將收集的BALF于4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，收集上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取離心后的底層沉淀，經(jīng)紅細(xì)胞裂解，并按上述方法進(jìn)行離心2次后，使用血細(xì)胞儀測定BALF中的細(xì)胞總數(shù)。使用 Biping沉降系統(tǒng)制作細(xì)胞切片，HE染色后對200個BALF細(xì)胞進(jìn)行中性粒細(xì)胞（neutrophile，NEU）和嗜酸性細(xì)胞（eosinophils，EOS）計(jì)數(shù)。

1.2.4 肺組織病理學(xué)觀察 將1.2.3摘取的左肺組織固定于10%甲醇溶液中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片至5 μm后固定，蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.5 脾臟T細(xì)胞的分離、活化及流式分析 小鼠處死后，于無菌條件下取脾臟，PBS充分沖洗后，采用70 μm孔的尼龍網(wǎng)將其切碎，200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，收集細(xì)胞懸液，300 g離心10 min，取上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測，PBS重懸底層細(xì)胞沉淀，利用Ficoll密度梯度離心法分離小鼠脾臟中的單個核細(xì)胞。參考CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒說明方法利用陽選法分選各組小鼠脾臟單個核細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，接種至12孔板中，并應(yīng)用含50 ng/ml PMA、1 μg/ml 離子霉素和3 μg/ml 莫能菌素，1% 青鏈霉素，10%FBS的RPMI1640于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激、活化細(xì)胞5 h。PBS洗滌細(xì)胞后，再調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml加入流式管，加入FITC-CD4于4 ℃避光孵育30 min后，再加入100 μl細(xì)胞固定/破膜液，于室溫下避光孵育30 min，300 g離心10 min后分別加入PE-IL-4與APC-IL-17試劑，并于4 ℃避光孵育30 min。對照管分別加入各色的同型對照抗體。每管加入適量PBS，再次離心后，加入0.5 ml多聚甲醛重懸細(xì)胞，300目濾膜過濾細(xì)胞團(tuán)塊后，流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.6 ELISA實(shí)驗(yàn) 按照ELISA試劑盒說明方法檢測小鼠BALF中IL-4與IL-17表達(dá)水平；將各組小鼠脾臟分離的CD+T細(xì)胞，聯(lián)合使用160 ng/ml PMA、4 μg/ml的離子霉素刺激6 h后，使用ELISA檢測 IL-4與IL-17的表達(dá)。

1.2.7 siRNA慢病毒載體的體外感染 參考文獻(xiàn)［9］方法，使用免疫磁珠分選小鼠脾臟na?ve CD4+T細(xì)胞，按1×105個/孔密度接種至包被CD3/CD28抗體的12孔板，使用含10 U/ml IL-2的RPMI1640刺激48 h后，去除培養(yǎng)基，使用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將其分為3組，si-NC組，si-MBD2組和Control組。其中si-NC組與si-MBD2組的慢病毒感染操作如下：取約2×106個細(xì)胞懸液置于流式管中，加入6 μg/ml polybrene，使用si-MBD2和陰性對照慢病毒載體si-NC以感染復(fù)數(shù)MOI=20進(jìn)行感染CD4+T細(xì)胞，并在室溫下800 r/min離心4 h以提高干擾效率。

1.2.8 Th2與Th17細(xì)胞的分化和流式分析 取1.2.7中3組約1×106個CD4+T細(xì)胞，接種至包被CD3/CD28抗體的培養(yǎng)皿，加入含10 ng/ml IL-4、30 U/ml IL-2、2 000 ng/ml 可溶性CD28、5 000 ng/ml IFN-γ抗體、10%FBS和1%青鏈霉素RPMI1640進(jìn)行Th2的定向誘導(dǎo)分化6 d，隔日更換培養(yǎng)液，隨后按上述條件進(jìn)行破膜，加入PE-IL-4，PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入0.5 ml多聚甲醛重懸細(xì)胞，按1.2.5方法處理細(xì)胞后上機(jī)檢測。Th17細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化步驟如下：按上述方法進(jìn)行接種已包被CD3/CD28抗體后，加入含5 ng/ml TGF-β、 20 ng/ml IL-1β、20 ng/ml IL-6、10 ng/ml IL-21和10 μg/ml IL-4與IFN-γ抗體、10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640進(jìn)行Th17定向誘導(dǎo)分化6 d，進(jìn)行換液、破膜，最后加入APC-IL-17上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.9 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 按照TRIzol法提取各組小鼠脾臟中分離的CD4+T細(xì)胞中的總RNA，分光光度計(jì)檢測RNA純度與濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR Green Real-time PCR試劑說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時間與溫度進(jìn)行實(shí)時定量PCR。RT-PCR引物序列為：MBD2正向引物5'-CCCAGCGGATGAATGAACAAC-3＇，反 向 引 物 5'-CTGGACCGACTCCTTGAAGACC-3'；RORγt正向引物5'-AGTGTAATGTGGCCTACTCCTGAPDH-3'，反向引物5'-GCTCCTGTTGCAGTTGTTTCT-3'；GATA3正向引物5＇-ACACTCTGGAGGAGGAATGCCAAT-3＇，反向引物5＇-TTCGGTTTCTGGTCTGGATGCCTT-3＇；GAPDH正 向 引 物5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。以GAPDH為待測miRNA或mRNA的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.10 Western blot實(shí)驗(yàn) 取各組小鼠待測組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取組織中總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，按照1∶4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，分別加入MBD2（1∶300）、Gr1（1∶300）、ECP（1∶300），β-actin （1∶1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST溶液清洗3次。均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為其相對含量。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0和 GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett's或Bonferroni's多重比較進(jìn)行分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MBD2在各組小鼠中的表達(dá) RT-PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT生理鹽水組小鼠相比，CD4CreMBD2fl/fl小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中MBD2 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），而WT哮喘組小鼠脾臟CD4細(xì)胞中MBD2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05，圖1）。

圖1 MBD2在各組小鼠中的表達(dá)Fig.1 Expression level of MBD2 of mice in each group

2.2 MBD2缺陷改善小鼠哮喘癥狀 小鼠的一般情況觀察顯示，WT哮喘組在刺激后的第4天開始出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡等癥狀，而CD4CreMBD2fl/fl哮喘組在刺激后的第5天開始出現(xiàn)躁動、呼吸加快與易疲倦等現(xiàn)象，WT生理鹽水組與CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠精神狀態(tài)正常，無上述相關(guān)癥狀。肺功能檢測結(jié)果顯示，與WT生理鹽水組或CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組的氣道反應(yīng)性明顯增加（P＜0.05），但WT哮喘組具有較高的基線值，其在低劑量Mch刺激下即氣道阻力明顯增加，且隨著Mch濃度的增加，氣道反應(yīng)性升高趨勢較CD4CreMBD2fl/fl哮喘組更為顯著（P＜0.05），WT生理鹽水組與CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠氣道阻力變化Fig.2 Changes of airway resistance of mice in each group

BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與WT生理鹽水組或CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞均顯著增加（P＜0.05），前兩組無明顯差異（P＞0.05）；而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl哮喘組BALF中的細(xì)胞總量、中性粒細(xì)胞均明顯降低（P＜0.05），嗜酸性細(xì)胞明顯增加（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)與成分Fig.3 Total number of cells and components in BALF of each group of mice

肺組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示，WT哮喘組小鼠肺組織的支氣管黏膜充血水腫，管腔狹窄，其內(nèi)可見黏液栓形成，黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死脫落，氣道、肺間質(zhì)和血管周圍浸潤大量炎癥細(xì)胞；而CD4CreMBD2fl/fl哮喘組肺組織損傷明顯減輕，浸潤的炎癥細(xì)胞顯著減少；WT生理鹽水組與CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，管腔通暢，氣道黏膜上皮細(xì)胞完整，肺間質(zhì)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。ELISA檢測BALF中細(xì)胞因子結(jié)果顯示，與WT生理鹽水組小鼠相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠脾臟中IL-17、IL-4均顯著增加（P＜0.01），CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組IL-4明顯增加（P＜0.05）；而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組上述細(xì)胞因子均顯著降低（P＜0.01），而CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠IL-17明顯減少（P＜0.05），但I(xiàn)L-4顯著增加（P＜0.05）；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT生理鹽水組或CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組相比，WT哮喘組和CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），且與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組和CD4CreMBD2fl/fl哮喘組的中性粒細(xì)胞升高趨勢明顯降低（P＜0.05）；與WT生理鹽水組相比，WT哮喘組，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組及CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠肺組織內(nèi)的嗜酸性細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組小鼠肺組織內(nèi)的嗜酸性細(xì)胞明顯降低（P＜0.05），CD4CreMBD2fl/fl哮喘組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4A，B）。

圖4 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變和肺組織中浸潤的炎癥因子與細(xì)胞檢測Fig.4 Pathological changes of lung tissue and inflammatory factors and cells in lung tissue of mice in each group

2.3 MBD2缺陷對哮喘小鼠體內(nèi)Th2與Th17表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和ELISA結(jié)果顯示，與WT生理鹽水組小鼠相比，WT哮喘組與CD4CreMBD2fl/fl哮喘組小鼠脾臟中Th17、Th2細(xì)胞比例，RORγt與GATA3 mRNA，IL-17和IL-4細(xì)胞因子均顯著增加（P＜0.05），CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組Th2細(xì)胞比例、GATA3 mRNA和IL-4細(xì)胞因子均明顯增加（P＜0.05）；而與WT哮喘組相比，CD4CreMBD2fl/fl生理鹽水組及哮喘組小鼠以Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子占主要優(yōu)勢，即Th2細(xì)胞比例、GATA3 mRNA和IL-4細(xì)胞因子均明顯增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 MBD2缺陷促進(jìn)哮喘小鼠體內(nèi)Th2細(xì)胞表達(dá)Fig.5 MBD2 deficiency promotes Th2 expression in asthmatic mice

2.4 沉默MBD2對小鼠na?ve CD4+T細(xì)胞Th2與Th17分化的影響 RT-PCR檢測慢病毒載體感染后小鼠na?ve CD4+T細(xì)胞中MBD2 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與Control組相比，si-MBD2組中MBD2mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），si-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測Th2與Th17的分化結(jié)果顯示，與Control組相比，si-MBD2組中Th2細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），而Th17細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），si-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 沉默MBD2在體外調(diào)控Th2與Th17細(xì)胞的分化Fig.6 Silencing MBD2 regulates differentiation of Th2 and Th17 cells in vitro

3 討論

本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞在經(jīng)刺激分化后，細(xì)胞中MBD2的表達(dá)水平顯著升高。同時，通過對比哮喘患者與健康人群外周血的研究證實(shí)，CD4+T細(xì)胞中MBD2在哮喘患者體內(nèi)同樣存在高表達(dá)現(xiàn)象，這提示MBD2可能與哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制及CD4+T的分化密切相關(guān)［7］。而MBD2作為表觀遺傳調(diào)控元件，既往研究表明其能夠通過甲基化Tbet/HIx誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，從而參與哮喘，尤其是重型哮喘的發(fā)病過程［11］。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的重要組成部分，維甲酸相關(guān)孤核受體γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt）是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［12］。與Th2細(xì)胞產(chǎn)生以IL-4為主的細(xì)胞因子相比，Th17細(xì)胞主要通過產(chǎn)生IL-17招募中性粒細(xì)胞浸潤至氣道，且其誘發(fā)的哮喘類型不易受到糖皮質(zhì)激素的抑制［13］。這也進(jìn)一步證實(shí)臨床上對激素治療產(chǎn)生抵抗的哮喘類型多以Th17介導(dǎo)中性粒細(xì)胞炎癥為主［14］。

本研究通過HDM聯(lián)合OVA與LPS在特異性敲除CD4+T細(xì)胞中MBD2基因表達(dá)的小鼠體內(nèi)構(gòu)建哮喘模型，與既往文獻(xiàn)證實(shí)的結(jié)果一致，即該條件誘導(dǎo)的哮喘模型主要以中性粒細(xì)胞浸潤為主［15］。在驗(yàn)證MBD2在各組小鼠中的mRNA與蛋白表達(dá)后，小鼠行為學(xué)改變、Mch激發(fā)的氣道高反應(yīng)試驗(yàn)和肺組織病理學(xué)染色均證實(shí)哮喘小鼠模型的成功建立。BALF細(xì)胞類型分析及細(xì)胞因子檢測的結(jié)果表明，在野生型小鼠哮喘中以中性粒細(xì)胞及IL-17炎癥因子占主導(dǎo)地位，這與NEWCOMB等［16］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IL-17表達(dá)增加與中性粒細(xì)胞浸潤為主的哮喘具有相關(guān)性的結(jié)果一致。而在MBD2基因缺陷的小鼠哮喘模型中，肺組織損傷明顯減輕，且以嗜酸性粒細(xì)胞與IL-4相關(guān)的炎癥反應(yīng)占主要地位。COOK等［17］學(xué)者在研究樹突狀細(xì)胞活化機(jī)制中發(fā)現(xiàn)MBD2的缺失可導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，而抑制其向Th17細(xì)胞分化，進(jìn)一步的研究表明MBD2可調(diào)控Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而下調(diào)初始CD4+T細(xì)胞向該方向的分化水平。這說明MBD2可能是調(diào)控Th2與Th17的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究為進(jìn)一步明確MBD2在哮喘疾病過程中是否同樣發(fā)揮上述作用，再次通過流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠脾臟中Th2與Th17及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果表明在MBD2基因缺陷的哮喘小鼠中，Th17細(xì)胞的表達(dá)、分化及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌均較野生型哮喘小鼠顯著降低，而Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著增加，且對體外分離的na?ve CD4+T細(xì)胞進(jìn)行靶向沉默MBD2基因表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了MBD2基因能夠通過調(diào)控Th2與Th17細(xì)胞的分化，在哮喘發(fā)生的免疫機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究表明可通過促進(jìn)Th2細(xì)胞及IL-4細(xì)胞因子表達(dá)敲除CD4+T細(xì)胞中MBD2基因表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞及IL-17的表達(dá)從而改善以中性粒細(xì)胞浸潤為主的重癥哮喘。然而，MBD2作為重要的甲基化調(diào)節(jié)蛋白，其在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，前期雖研究證實(shí)MBD2能夠通過調(diào)控相關(guān)基因影響Th2/Th17細(xì)胞的分化，但Th細(xì)胞的發(fā)育、分化等生物學(xué)過程涉及眾多分子與蛋白，MBD2能否通過調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展尚不得而知，后續(xù)將進(jìn)一步通過基因芯片等技術(shù)對比分析CD4+T細(xì)胞中MBD2基因缺陷的哮喘小鼠中差異表達(dá)的基因驗(yàn)證其在哮喘發(fā)病過程中的作用，以期進(jìn)一步闡明哮喘發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制，并且MBD2有望成為哮喘的新型臨床標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。