正交試驗優(yōu)化二丁口服液提取工藝

康玉霞，王 欣，王亞麗，崔小七，陳長青，郭玉凡

(鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450000)

二丁口服液主要由紫花地丁、蒲公英、半邊蓮、板藍根四味藥材組成，方中紫花地丁、蒲公英苦寒，清熱解毒，消癰，為君藥；板藍根解毒利咽，消腫，為臣藥；半邊蓮甘淡滲利，為佐使，可使熱隨體液而出，又兼具消腫解毒之功效。諸藥合用，力專而雄，實為清熱解毒之重劑?，F(xiàn)代藥理學研究表明，紫花地丁具有抑菌、抗炎、抗病毒、調節(jié)免疫等作用[1]，蒲公英具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫等作用[2]，半邊蓮具有抑菌、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化等作用[3]，板藍根具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗病原微生物、提高機體免疫力等作用[4]；方中各味藥材通過配伍，相輔相成，不僅能夠直接殺滅病毒和細菌等病原體，還能扶助正氣、調節(jié)機體免疫功能，通過扶正祛邪、標本兼顧，用于治療火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風熱火眼。為盡可能提取藥材中的有效成分，本研究通過正交試驗設計優(yōu)化二丁口服液的提取工藝，以液料比、提取次數(shù)和提取時間等因素為考察對象，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的綜合考察為評價指標，對處方的提取參數(shù)進行篩選，優(yōu)選出最佳提取工藝，以期為二丁口服液的生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 秦皮乙素(批號：110741-201708，純度：99.9%)和咖啡酸(批號：110885-201703，純度：99.7%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；紫花地丁、半邊蓮、蒲公英和板藍根，均購自河南禹州藥材市場，經檢驗均符合2020版《中華人民共和國藥典》該藥材項下的有關規(guī)定；純化水，本實驗室自制；分析純甲醇，購自天津市富宇精細化工有限公司；色譜純甲醇，購自天津市精細化學品有限公司。

1.2 主要儀器 DZKW-4型水浴鍋(北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司)；LC-1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備長廠)；十萬分之一分析天平(MS205DU，梅特勒-托利多)；TD5Z低速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 二丁口服液提取液的制備 分別稱取處方量的紫花地丁、蒲公英、半邊蓮和板藍根，加12倍量水加熱提取2次，每次1 h，濾過，濾液合并，濃縮，離心，上清液制成1 g/mL的藥液，備用。

1.3.2 干膏得率 精密吸取1.3.1中制備藥液10 mL置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，105 ℃烘箱干燥4 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻至室溫，稱重，按公式(1)計算干膏得率(%)[5]。

(1)

1.3.3 含量測定 采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)進行含量測定，并進行方法學驗證。色譜條件：色譜柱：ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸(20∶80，v/v)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：324 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下，秦皮乙素、咖啡酸與其他組分均有較好的分離，理論塔板數(shù)按各峰計算，均不低于3 000。

1.3.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取秦皮乙素對照品18.62 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.93 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取該對照品儲備液3.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.33 mg/mL的秦皮乙素對照品溶液。精密稱取咖啡酸對照品11.85 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得質量濃度為472.58 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取該對照品儲備液1.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得質量濃度為18.90 μg/mL的咖啡酸對照品溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取1.3.3.1中制備的藥液5 mL，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3.3 陰性對照溶液的制備 取紫花地丁、蒲公英陰性樣品適量，按1.3.3.2項下的方法制備陰性對照溶液。

1.3.3.4 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按1.3.3項下的色譜條件進樣測定。

1.3.3.5 線性關系考察 精密量取秦皮乙素對照品儲備液0.35、0.70、1.00、1.40、1.80、2.10和2.50 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質量濃度為0.065、0.130、0.186、0.260、0.335、0.391和0.465 mg/mL的秦皮乙素對照品系列溶液。精密量取咖啡酸對照品儲備液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20和1.40 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質量濃度為3.78、7.56、11.34、15.12、18.90、22.68和26.46 μg/mL 的咖啡酸對照品系列溶液。精密吸取秦皮乙素和咖啡酸對照品系列溶液各10 μL，按照1.3.3項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各對照品的峰面積(Y)對其進樣質量濃度(X)進行線性回歸，計算線性回歸方程。

1.3.3.6 精密度試驗 按照1.3.3項下的色譜條件，精密吸取對照品溶液各10 μL，重復進樣6次，記錄峰面積，計算秦皮乙素和咖啡酸的RSD值。

1.3.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，在0、2、4、6、8、10和12 h，按照1.3.3項下的色譜條件，分別進樣測定，記錄峰面積，計算秦皮乙素和咖啡酸的RSD值。

1.3.3.8 重復性試驗 取同一批藥液，按照1.3.3.2項下的方法，制備6份供試品溶液，并按照1.3.3項下的色譜條件，分別進樣測定，記錄峰面積，計算秦皮乙素和咖啡酸的平均含量和RSD值。

1.3.3.9 加樣回收率試驗 精密量取1.3.3.8中藥液2.5 mL共6份，加入一定量的秦皮乙素和咖啡酸對照品儲備液，加甲醇18 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。精密吸取10 μL，按照1.3.3項下的色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。

1.3.3.10 檢測限 按信噪比3∶1為標準，精密稱取秦皮乙素、咖啡酸對照品適量，加甲醇分別配制成相應的濃度，進樣檢測，分別測定秦皮乙素和咖啡酸的檢測限。

1.3.3.11 定量限 按信噪比10∶1為標準，精密稱取秦皮乙素、咖啡酸對照品適量，加甲醇分別配制成相應的濃度，進樣檢測，分別測定秦皮乙素和咖啡酸的定量限。

1.3.4 單因素考察 影響中藥制劑提取工藝的因素有很多，但主要影響因素為液料比、提取時間和提取次數(shù)。現(xiàn)結合生產實際，分別對每個因素進行考察，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸的含量為綜合評價指標，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的最大值為參照，對數(shù)據(jù)進行歸一化法分析，干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的權重系數(shù)分別為0.4、0.3和0.3，按公式(2)計算綜合評分[6]。

綜合評分=(干膏得率/干膏最大得率)×0.4+(秦皮乙素/秦皮乙素最大值)×0.3+(咖啡酸/咖啡酸最大值)×0.3

(2)

1.3.4.1 液料比 分別稱取處方量的藥材，按液料比10∶1、12∶1、15∶1、18∶1，加熱提取2次，每次1 h，濾過，濾液合并，濃縮，離心，上清液制成1 g/mL的藥液，分別測定干膏得率、秦皮乙素和蒲公英的含量，按公式(2)計算綜合評分。

1.3.4.2 提取時間 分別稱取處方量的藥材，按液料比12∶1加水，加熱提取2次，每次提取時間分別為1、2和3 h，濾過，濾液合并，濃縮，離心，上清液制成1 g/mL的藥液，分別測定干膏得率、秦皮乙素和蒲公英的含量，按公式(2)計算綜合評分。

1.3.4.3 提取次數(shù) 分別稱取處方量的藥材，按液料比12∶1，加熱提取次數(shù)分別為1、2和3次，每次提取1 h，濾過，濾液合并，濃縮，離心，上清液制成1 g/mL的藥液，分別測定干膏得率、秦皮乙素和蒲公英的含量，按公式(2)計算綜合評分。

1.3.5 正交試驗 根據(jù)單因素試驗和檢索相關文獻的結果[6，7]，液料比、提取時間和提取次數(shù)為影響提取效果的主要因素。因此正交試驗選擇液料比、提取時間和提取次數(shù)3個因素為考察對象，每個因素分別選取3個水平，按L9(34)正交表進行試驗，優(yōu)選最佳提取參數(shù)。正交試驗采用綜合評分的方法，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量為綜合評價指標，按公式(2)計算綜合評分。

1.3.6 工藝驗證 稱取處方量的藥材共50 g，平行稱取3份，按照最佳工藝參數(shù)進行提取，分別制成3批1 mg/mL的藥液，測定干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量，分別對3批藥液進行驗證。

2 結果

2.1 含量測定

2.1.1 專屬性試驗 結果顯示，供試品溶液和對照品溶液的色譜峰保留時間一致，陰性對照溶液在對照品相應的保留時間均未出現(xiàn)色譜峰(圖1)。表明該色譜條件下，秦皮乙素和咖啡酸吸收良好，藥液中其他組分對其含量測定均無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.2 線性關系考察 以各對照品的峰面積(Y)對其進樣質量濃度(X)進行線性回歸，分別得到秦皮乙素線性回歸方程為Y=37 776X+162.95(R2=0.999)(圖2)；咖啡酸線性回歸方程為Y=57.076X+26.357(R2=0.998 3)(圖3)。結果表明，秦皮乙素質量濃度在0.065～0.465 mg/mL、咖啡酸質量濃度在3.78～26.46 μg/mL范圍內線性關系良好。

圖2 秦皮乙素的標準曲線

圖3 咖啡酸的標準曲線

2.1.3 精密度試驗 秦皮乙素和咖啡酸RSD值分別為0.41%和0.96%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 秦皮乙素和咖啡酸的RSD值分別為0.89%和1.27%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復性試驗 秦皮乙素的平均含量為1.48 mg/mL，RSD值為1.12%；咖啡酸的平均含量為91.06 μg/mL，RSD值為1.46%。表明該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 由表1可知，秦皮乙素平均加樣回收率99.69%，RSD值為1.72%，咖啡酸加樣回收率92.80%，RSD值為1.92%，均符合要求。

表1 加樣回收率試驗結果

2.1.7 檢測限 秦皮乙素的檢測限為0.07 μg/mL，咖啡酸的檢測限為0.04 μg/mL。

2.1.8 定量限 秦皮乙素的定量限為0.33 μg/mL，咖啡酸的定量限為0.21 μg/mL。

2.2 單因素考察

2.2.1 液料比 由表2可知，隨著液料比的增大，干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量隨之增加，但當液料比增大到12∶1之后，干膏得率變化不明顯，液料比增大到15∶1之后，秦皮乙素和咖啡酸的含量增加幅度較小。

表2 不同液料比對干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的影響

2.2.2 提取時間 由表3可知，隨提取時間的增加，干膏得率隨之增加，當提取時間增加至2 h后無明顯變化，秦皮乙素和咖啡酸的含量隨著提取時間的增加略有增加，當提取時間增加至3 h后，咖啡酸含量略有增加，而秦皮乙素含量反而顯著下降。

表3 不同提取時間對干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的影響

2.2.3 提取次數(shù) 由表4可知，隨著提取次數(shù)的增加，干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量均隨之增加，當提取次數(shù)在2次之后，各參數(shù)的增加幅度變小。

表4 不同提取次數(shù)對干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的影響

2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗的結果，正交試驗選擇液料比(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)3個因素為考察對象，每個因素分別選取3個水平，依據(jù)L9(34)正交表分別進行試驗，因素水平見表5。采用正交助手專業(yè)版軟件進行設計，用方差分析評價各因素水平對提取工藝影響的顯著性。正交試驗結果見表6，方差分析結果見表7。

表5 L9(34)正交試驗因素水平

表6 L9(34)正交試驗結果

續(xù)表

表7 方差分析

由表6可知，各因素對綜合評分的影響依次為C>A>B，即提取次數(shù)影響最大，然后是液料比，提取時間對綜合評分的影響最小。

由表7可知，提取次數(shù)對綜合評分的影響具有顯著性差異(P<0.05)。根據(jù)正交試驗結果可知，最佳提取工藝參數(shù)為A3B1C3，即液料比為14∶1，提取時間為1 h，提取3次。

2.4 工藝驗證 按照最佳工藝參數(shù)A3B1C3提取制成3批1 mg/mL的藥液，測定干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量，結果見表8。3批藥液的平均干膏得率為31.16%，秦皮乙素的平均含量為1.37 mg/mL，咖啡酸的平均含量為108.14 μg/mL。表明該工藝條件穩(wěn)定，重復性良好，可用于工業(yè)化生產。

表8 驗證試驗結果(n=3)

3 討論

關于考察指標的選擇，由于紫花地丁和蒲公英同為處方的君藥，秦皮乙素是紫花地丁的主要藥效成分之一，咖啡酸是蒲公英的主要藥效成分之一，而干膏得率又是影響提取效率的重要因素，所以選擇三者的綜合評分作為提取工藝的考察指標，更加科學、合理。

關于檢測波長的選擇，秦皮乙素的最大吸收波長為353 nm，咖啡酸的最大吸收波長為324 nm，由于樣品中咖啡酸的含量較低，峰面積比較小，為同時兼顧兩組分的吸收，選擇324 nm為檢測波長。

關于流動相的選擇，筆者考察了乙腈-0.4%冰醋酸、甲醇-0.4%冰醋酸、甲醇-0.6%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸[8-11]，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸能把兩者較好的分離，且峰形良好。流動相的水相使用冰醋酸溶液時，色譜峰有拖尾現(xiàn)象，有機相選擇乙腈時，兩組分的分離度不好。

關于供試品溶劑的選擇，根據(jù)檢索相關文獻的結果[10-13]，分別考察了50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和100%甲醇等提取溶劑，結果發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑，雜質更少，幾種提取溶劑制得的樣品，含量相差無幾，所以最終選擇甲醇為供試品的提取溶劑。

單因素試驗結果發(fā)現(xiàn)，藥液的提取時間超過2 h，秦皮乙素的含量顯著降低，可能是由于持續(xù)長時間受熱導致秦皮乙素化學結構遭到破壞所致。

二丁口服液采用正交試驗設計優(yōu)選出最佳提取工藝，最佳工藝參數(shù)為液料比14∶1，提取3次，每次1 h。該提取工藝的綜合考察指標明顯優(yōu)于2020版《中華人民共和國藥典》二丁顆粒提取工藝的綜合考察指標，且該工藝穩(wěn)定，重復性良好，為二丁口服液的后續(xù)開發(fā)研究提供了有力的理論基礎。