固相萃取結(jié)合LC/MS-MS法測定奶粉中四溴雙酚A

綦艷，李錦清，李聰，黃翠莉

廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院（順德 528300）

四溴雙酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）是一種常見的溴類阻燃劑，被廣泛應(yīng)用于塑料、橡膠、紡織品、電子電氣等工業(yè)產(chǎn)品中。工業(yè)產(chǎn)品釋放的TBBPA容易通過水體、土壤等途徑進(jìn)入環(huán)境中[1]，通過遷移、擴散污染食物。據(jù)報道，環(huán)境樣品[2]、動物源性食品[3]、人體內(nèi)[4]均檢出TBBPA。TBBPA具有生物蓄積性和持久性，可能會危害人類健康，據(jù)研究報道[5-6]，TBBPA能干擾人體甲狀腺激素分泌，歐盟將其列為優(yōu)先控制化學(xué)品之一，并開展危險性評估[7]。

關(guān)于TBBPA的研究主要集中在環(huán)境水體[8-9]、土壤[10-12]、塑料包裝材料[13]、電氣產(chǎn)品[14]、食品[15-18]等方面，檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]、液相色譜法等。TBBPA極性較強[20]，在毛細(xì)管色譜柱中保留時間很短，GC-MS法測定前需衍生化，步驟繁瑣。液相色譜法靈敏度較低，不適合痕量TBBPA檢測。LC-MS/MS法無需衍生化，靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，成為TBBPA檢測的主要手段。

牛奶經(jīng)加工制成奶粉后，可能存在的TBBPA被濃縮富集，危害性增大。奶粉中TBBPA檢測的標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)尚未見諸報道。食品中TBBPA的檢測標(biāo)準(zhǔn)僅有DBS 42/004—2014《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A的測定》，其前處理方法采用索氏提取和自制硅膠柱凈化，步驟繁瑣、耗時長、有機溶劑消耗較大。試驗旨在建立固相萃取結(jié)合LCMS/MS法測定奶粉中TBBPA的分析方法，具有操作簡單、有機溶劑消耗少，回收率高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸銨（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，美國Tedia公司）；氫氧化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；水（符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》要求的一級水）；C18固相萃取柱（未封尾，規(guī)格1 g/12 mL，月旭科技有限公司）；PTFE-Q針式濾頭（規(guī)格0.22 μm/13 mm，美國Agilent公司）；四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.4%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；四溴雙酚A-D4（TBBPA-D4，純度≥98%，加拿大C/D/N ISOTopes公司）。

奶粉樣品（包括嬰幼兒配方奶粉1段15批次，2段10批次，3段10批次，中老年奶粉10批次；市售，隨機購買）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Exion LC AD/SCIEX Triple Quad 4500，美國AB SCIEX公司）；艾本德高速冷凍離心機（5804R，德國eppendorf公司）；多位渦旋振蕩器（MV-3000，廣東晉元科技有限公司）；全自動智能氮吹儀（FV64，廣州得泰儀器科技有限公司）；去離子水發(fā)生器（Milli-Q，美國Millipore公司）；電子天平（JJ500Y，精度0.01 g，福州華志科學(xué)儀器有限公司）；電子天平[MS105DU，精度0.1 mg，梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；超聲波清洗機（JPC300，廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司）；pH計（雷磁PHS-3C，精度0.01，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取四溴雙酚A、四溴雙酚A-D4各10 mg（精確至0.1 mg）分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配得質(zhì)量濃度均為100 mg/L的四溴雙酚A、四溴雙酚A-D4標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于-20 ℃保存。精密吸取0.1 mL四溴雙酚A、四溴雙酚A-D4標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配得質(zhì)量濃度均為1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品中間液。精密吸取1 mL四溴雙酚A、四溴雙酚A-D4標(biāo)準(zhǔn)品中間液，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，配得質(zhì)量濃度均為0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品使用液。

精密吸取適量四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品中間液或標(biāo)準(zhǔn)品使用液及四溴雙酚A-D4標(biāo)準(zhǔn)品使用液，用空白奶粉基質(zhì)提取液稀釋，配成四溴雙酚A-D4質(zhì)量濃度均為5 μg/L及質(zhì)量濃度范圍為0.2～150 μg/L的四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用LC-MS/MS測定，以基質(zhì)匹配-同位數(shù)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法定量。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

稱取2 g（精確至0.01 g）奶粉樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入50 μL四溴雙酚A-D4標(biāo)準(zhǔn)品使用液，加入10 mL水和200 μL 5%氫氧化鈉溶液，按2 300 r/min渦旋3 min，加入9 mL乙腈，搖勻后超聲提取30 min，按9 000 r/min離心3 min，取液體轉(zhuǎn)移至另一個50 mL聚丙烯塑料離心管中，樣品再用3 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并液體于50 mL聚丙烯塑料離心管中，用水稀釋至離心管50 mL刻度，用磷酸調(diào)節(jié)提取液pH＜5，搖勻，制得待凈化液，待凈化。

1.3.2.2 凈化

C18固相萃取柱依次用12 mL甲醇、15 mL水活化。將1.3.2.1制得的待凈化液分次轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱中，棄去全部流出液，分別用12 mL 5%甲醇水（V/V）溶液和12 mL水淋洗C18固相萃取柱，棄去淋洗液，負(fù)壓抽干5 min。用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，45 ℃水浴條件下用氮氣吹干，用1.0 mL 70%甲醇-水溶液復(fù)溶，過0.22 μm有機系濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為甲醇；流動相B為水；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～2.0 min，55% B；2.0～2.1 min，55%～20% B；2.1～8.0 min，20% B；8.0～8.1 min，20%～10% B；8.1～12.0 min，10% B；12.0～12.1 min，10%～55% B；13.0～14.0 min，55% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）；數(shù)據(jù)采集：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧電壓-4 500 V；脫溶劑溫度550 ℃；氣簾氣壓力25 psi；霧化氣壓力50 psi；干燥氣壓力50 psi；碰撞氣壓力9 psi?；衔锉Ａ魰r間、離子對、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間等見表1。

表1 四溴雙酚A和四溴雙酚A-D4質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取

四溴雙酚A微溶于水，易溶于乙腈，且乙腈沉淀蛋白效果較好，因此選擇乙腈作為提取試劑和蛋白沉淀劑。奶粉呈顆粒狀，乙腈難以滲透至奶粉顆粒內(nèi)部，不能有效提取待測化合物。因此，用水將奶粉樣品溶解并形成分散性較好的奶液，加入氫氧化鈉溶液使奶液中四溴雙酚A充分轉(zhuǎn)化為易溶于水的四溴雙酚A鈉鹽游離至水中，使獲得較高的萃取率。

試驗比較分別加入2，3，4，5和6倍于奶粉質(zhì)量（2 g）的水體積（單位為mL）溶解奶粉對提取回收率影響。結(jié)果表明：當(dāng)加入水體積2～4倍于奶粉質(zhì)量時，形成的奶液較黏稠，乙腈與奶液混合不充分；加入水體積5～6倍于奶粉質(zhì)量時，形成的奶液分散性較好，黏稠度低，乙腈與奶液可充分混合，有利于提取。因此，選擇5倍于奶粉質(zhì)量的水體積（10 mL）溶解奶粉。

5%氫氧化鈉溶液加入量200 μL左右較合適，此時奶液pH呈堿性，既可使分子態(tài)的四溴雙酚A轉(zhuǎn)化為易溶于水的四溴雙酚A鈉鹽，同時去除奶粉中脂肪，避免加入過多氫氧化鈉溶液導(dǎo)致分解出更多干擾雜質(zhì)。樣品首次提取乙腈用量為9 mL，蛋白質(zhì)可完全沉淀，獲得澄清提取液，重復(fù)提取時乙腈用量僅需3 mL，與常用的索氏提取法或加速溶劑萃取法相比，具有有機試劑用量少、回收率高、批量樣品檢測效率高等優(yōu)點。

2.2 樣品凈化

四溴雙酚A含有2個酚羥基，其水溶性隨pH變化[21]，2個酚羥基的pKa值分別為7.5和8.5[22]，在pH＜5條件下，基本上以未離解的分子形式存在；在中性pH條件下，離子態(tài)和分子態(tài)共存；堿性條件下，以易溶于水的離子形式存在。利用四溴雙酚A的這些特點，用堿性水溶液溶解奶粉樣品，可將各種形態(tài)存在的四溴雙酚A轉(zhuǎn)化為易溶于水的離子態(tài)，提高溶出率，從而提高回收率。試驗比較發(fā)現(xiàn)，提取液pH為中性或堿性時，C18固相萃取回收率較低，但提取液調(diào)節(jié)為pH＜5后，回收率顯著提高。因此，選擇采用堿性水溶液提取，pH＜5條件下C18固相萃取柱凈化。

進(jìn)一步比較C18固相萃取柱填料封尾與未封尾對回收率的影響。結(jié)果表明，填料未封尾的C18固相萃取柱的絕對回收率比封尾的高約30%，原因可能是未封尾的填料表面較多的硅醇官能團為四溴雙酚A提供額外的極性相互作用，與封尾的相比，增強對四溴雙酚A的保留，因此回收率更高。試驗比較發(fā)現(xiàn)，待凈化液中乙腈比例超過25%時，C18固相萃取回收率較低，因此，用水稀釋使待凈化液中乙腈比例不超過25%，用磷酸調(diào)節(jié)提取液pH＜5，確保具有較高回收率。

四溴雙酚A易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機試劑[23]，這些試劑均可作為C18固相萃取的洗脫液，但洗脫效果差異較大。試驗比較發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯洗脫時回收率最高，且回收率較穩(wěn)定，僅需10 mL乙酸乙酯洗脫，回收率達(dá)90%以上，因此選擇乙酸乙酯作為洗脫試劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測過程中普遍存在的現(xiàn)象[24-26]，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度有很大影響，因此開展基質(zhì)效應(yīng)評估十分必要。除不加同位素內(nèi)標(biāo)外，按照優(yōu)化方法對添加四溴雙酚A 3 μg/kg的奶粉樣品進(jìn)行3平行測定，分別用70%甲醇-水溶液、空白樣品基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，計算平均回收率，考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，以70%甲醇-水溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量的平均回收率為35%；以空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量（即基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量）的回收率為67%；表明存在較強的基質(zhì)抑制作用。在食品檢測中消除或減少液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法基質(zhì)抑制的常用的方法有基質(zhì)匹配法[27-28]、同位素內(nèi)標(biāo)法[29-30]等，試驗采用空白基質(zhì)提取液與同位素內(nèi)標(biāo)相結(jié)合（即基質(zhì)匹配-同位素內(nèi)標(biāo)法）配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量，平均回收率為90%，有效降低基質(zhì)抑制作用，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化條件下，對基質(zhì)匹配-同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行測定，結(jié)果表明，四溴雙酚A在0.2～150 μg/L范圍內(nèi)，線性方程為y=0.172 92x-0.029 62，相關(guān)系數(shù)為r≥0.995，呈良好線性關(guān)系。采用空白奶粉樣品添加四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品的方式考察方法檢出限和定量限，以定量離子信噪比（signal-to-noise ratio，rSN）不低于3時，作為方法檢出限（SLOD），方法檢出限為0.5 μg/kg；以定量離子信噪比（Signal-to-noise ratio，rSN）不低于10時，作為方法定量限（SLOQ），定量限為1.5 μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收率及精密度

向空白奶粉樣品中添加3個水平濃度標(biāo)準(zhǔn)品，每個水平平行測定6次。四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品的添加水平為1.5，3.0和15.0 μg/kg，每個濃度水平平行測定6次，平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）見表2。結(jié)果顯示，平均加標(biāo)回收率為92.3%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為6.8%～8.3%，具有較好的回收率和精密度，滿足奶粉中四溴雙酚A的分析要求。圖1為基質(zhì)匹配-同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液中四溴雙酚A及四溴雙酚A-D4的提取離子色譜圖，圖2為空白奶粉樣品添加四溴雙酚A（5 μg/kg）的提取離子色譜圖。

表2 加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

圖1 基質(zhì)匹配-同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液中四溴雙酚A及四溴雙酚A-D4的提取離子色譜圖

圖2 空白奶粉樣品添加四溴雙酚A（5 μg/kg）的提取離子色譜圖

2.6 實際樣品檢測

應(yīng)用試驗方法對45批奶粉樣品（嬰幼兒配方奶粉1段15批次，2段10批次，3段10批次，中老年奶粉10批次）進(jìn)行檢測，均未檢出四溴雙酚A。

3 結(jié)論

建立固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）測定奶粉中四溴雙酚A的分析方法。方法前處理操作簡單，經(jīng)方法學(xué)驗證和實際樣品應(yīng)用結(jié)果表明，試驗方法準(zhǔn)確度高，精密度好，基質(zhì)效應(yīng)低，適用于奶粉中四溴雙酚A的定性定量檢測，彌補奶粉中四溴雙酚A檢測方法缺失，為開展相關(guān)風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持。