基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的竹葉花椒果皮中黃酮類成分分析

周孟焦，何鑫柱, ，李朝俊, ，梁曉峰,

1. 四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校川西北中藥材資源研究與開發(fā)利用實(shí)驗(yàn)室（綿陽 621010）；

2. 西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院（綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC.）為蕓香科花椒屬植物，作為藥食同源植物，竹葉花椒以“竹葉椒”之稱在歷代本草中均有記載，具有溫中止痛、祛蛔、祛風(fēng)除濕等作用[1-2]。竹葉花椒果皮中含有黃酮類、揮發(fā)油、酰胺和生物堿等多種活性成分[3]，其中黃酮類物質(zhì)是主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗癌等藥理功效[4-5]。竹葉花椒中的黃酮類物質(zhì)成分復(fù)雜，其具體所含有的黃酮類物質(zhì)尚不明確，因此，闡明其藥效基礎(chǔ)物質(zhì)對進(jìn)一步深入研究藥物作用機(jī)制具有重要作用。

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Ultra-Performance Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-Q-TOFMS）具有快速、高效的特點(diǎn)，是分析中藥復(fù)雜系統(tǒng)中化學(xué)成分的最有力工具之一，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用到藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、化學(xué)成分分析等領(lǐng)域[6-7]。試驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對竹葉花椒含有的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定，為竹葉花椒藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和綜合開發(fā)利用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent Q-TOF 6520質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；Sartorius BSA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；YTLG-12A冷凍干燥機(jī)（上海葉拓科技有限公司）；XH-MC-1實(shí)驗(yàn)室微波合成儀（祥鵠科技）；DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

干燥竹葉花椒果皮產(chǎn)自四川漢源，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校江洪波教授鑒定為蕓香科花椒屬植物竹葉花椒Zanthoxylum armatumDC.的果皮；石油醚、無水乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇和甲酸（色譜純，Merck公司）；聚酰胺和D101大孔吸附樹脂（上海麥克林生化科技）；表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素和山奈酚分析對照品[阿拉丁試劑（上海）有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備

稱取適量竹葉花椒果皮粉末，用微波輔助法進(jìn)行提取，溶劑為60%乙醇水溶液，在80 ℃下反應(yīng)25 min，提取液用石油醚進(jìn)行脫脂處理，再冷凍干燥得到黃酮粗提物，用聚酰胺-大孔吸附樹脂對提取物進(jìn)行純化，得到淡黃色粉末狀黃酮純化物。精密稱取適量純化黃酮固體粉末，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

1.2.2 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測試條件

1.2.2.1 色譜條件

waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇溶液；梯度洗脫（0～1 mim，5% B；1～3 min，5%～10% B；3～16 min，10%～90% B；16～22 min，90% B；22～22.1 min，90%～5% B；22.1～30 min，5% B）；流速為0.3 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式監(jiān)測，離子噴霧電壓為4 000 V；毛細(xì)管溫度為350 ℃；干燥氣流速為12 L/min；質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 500。

1.2.3 高效液相色譜測試條件

色譜柱為反相PA2 C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇溶液；梯度洗脫（0～1 mim，5% B；1～3 min，5%～10% B；3～16 min，10%～90% B；16～22 min，90% B；22～22.1 min，90%～5% B；22.1～30 min，5% B）；檢測波長為300 nm；流速為1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量為30 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮類物質(zhì)的成分

竹葉花椒提取物的正離子基峰色譜圖（Base Peak Chromatogram，BPC）見圖1。利用Qualitative Analysis B.07.00分析軟件，對正離子模式下采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰，確定化合物的相對分子質(zhì)量；通過數(shù)據(jù)庫檢索、查看化合物二級質(zhì)譜碎片、結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律和相關(guān)文獻(xiàn)鑒定樣品中的化學(xué)成分，共分析鑒定出10種黃酮類物質(zhì)，其具體鑒定結(jié)果見表1。

圖1 竹葉花椒提取物正離子模式下的BPC圖

表1 竹葉花椒黃酮類物質(zhì)的鑒定結(jié)果

2.2 典型黃酮類物質(zhì)的鑒定

在黃酮類物質(zhì)中，金絲桃苷、蘆丁、紫云英苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷等具有優(yōu)異的藥理活性，常用于解痙、心腦血管疾病、抗炎和降血脂等。利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可對天然黃酮類物質(zhì)組分進(jìn)行快速測定，分析表明，竹葉花椒提取物中含有這些典型的黃酮成分。

峰3代表的化合物在正離子模式下出現(xiàn)的一級質(zhì)譜碎片信息，有m/z465.104 [M+H]+和m/z487.085[M+Na]+，表明化合物3的相對分子質(zhì)量為464，m/z465.104 [M+H]+失去一分子葡萄糖（m/z162）或半乳糖基（m/z162）得到m/z303.050，該黃酮類物質(zhì)的苷元為槲皮素，初步鑒定該峰代表的物質(zhì)為槲皮素-3-O-葡萄糖苷或槲皮素-3-D-半乳糖苷（金絲桃苷），再根據(jù)文獻(xiàn)[8, 11]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，推測該物質(zhì)為金絲桃苷，其質(zhì)譜圖和裂解途徑如圖2所示。

圖2 金絲桃苷的一級（a）、二級（b）質(zhì)譜圖和裂解途徑（c）

峰4代表的化合物的全掃描一級質(zhì)譜碎片信息中有m/z611.161 [M+H]+和m/z633.143 [M+Na]+，表明化合物4的相對分子質(zhì)量為610，其二級質(zhì)譜碎片離子中m/z465.102為[M+H]+失去一分子鼠李糖基（m/z146）生成的，m/z303.050為[M+H]+失去一分子鼠李糖和葡萄糖基生成的，再根據(jù)文獻(xiàn)[8, 9]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，推測該峰代表的物質(zhì)為蘆丁，其裂解途徑和質(zhì)譜圖如圖3所示。

圖3 蘆丁的一級（a）、二級（b）質(zhì)譜圖和裂解途徑（c）

峰5代表的化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z449.108[M+H]+和m/z471.087 [M+Na]+，表明化合物5的相對分子質(zhì)量為448，其二級質(zhì)譜碎片m/z287.055 [M+H-162]+，由m/z449.108 [M+H]+失去一分子葡萄糖或半乳糖基得到的，m/z287.055 [M+H-162]+代表的苷元是山奈酚，再根據(jù)文獻(xiàn)[10]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，推測該峰代表的物質(zhì)為紫云英苷。

峰7代表的化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z479.119[M+H]+和m/z501.100 [M+Na]+，表明化合物7的相對分子質(zhì)量為478，二級質(zhì)譜碎片中m/z317.066 [M+H-162]+由m/z479.119 [M+H]+和失去一分子萄糖或半乳糖基得到的，m/z303.045 [M+H-162-CH3]+由m/z317.066[M+H-162]+失去一個(gè)中性離子CH3得到的，m/z317.066[M+H-162]+所代表的苷元為異鼠李素，再根據(jù)文獻(xiàn)[11]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，推測該峰代表的物質(zhì)為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

2.3 竹葉花椒黃酮類物質(zhì)的對照品比對分析

竹葉花椒提取物與混合對照品的高效液相色譜如圖4所示。由圖4可知，竹葉花椒提取物中具有表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素和山奈酚這10種黃酮類物質(zhì)，表明了UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)可快速、有效地對竹葉花椒黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分析。

圖4 混合對照品（a）和竹葉花椒提取物（b）的HPLC圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對竹葉花椒提取物中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分析，共分析鑒定出10種黃酮類物質(zhì)，分別是表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、阿福豆苷、紫云英苷、槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素和山奈酚。采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)可快速、有效地對竹葉花椒黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分析。此次研究為竹葉花椒進(jìn)一步開發(fā)研究提供了科學(xué)參考，促進(jìn)了竹葉花椒有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。