HPLC-MS/MS測(cè)定油菜花蜂蜜中20種磺酰脲類除草劑

田亞，張淑霞，孫轉(zhuǎn)蓮，王向軍

鄭州海關(guān)技術(shù)中心（鄭州 450016）

油菜是我國(guó)優(yōu)質(zhì)的蜜源植物，油菜田間的雜草以化學(xué)防除為主[1-2]?；酋ｋ孱惓輨┍荒壳案鲊?guó)廣泛應(yīng)用，且使用量較高，對(duì)于油菜田中的闊葉及禾本科雜草具有較好的防治效果[3]。大多數(shù)磺酰脲類除草劑屬于長(zhǎng)殘效除草劑，其在農(nóng)作物中的殘留會(huì)對(duì)農(nóng)作物造成多種危害，且殘留物通過環(huán)境進(jìn)入食物鏈，對(duì)人類具有潛在風(fēng)險(xiǎn)和毒性[4-5]。油菜花蜂蜜除含有豐富的維生素、果糖以外，還有大量黃酮，長(zhǎng)期食用能夠促進(jìn)胃腸道消化、排毒養(yǎng)顏、提高免疫力、保護(hù)心血管、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，是日常普遍食用和保健的天然產(chǎn)品。蜜蜂在油菜花田采蜜，會(huì)將大量除草劑殘留物傳遞到油菜花蜂蜜中，對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅。因此，建立一種檢測(cè)油菜花蜂蜜中磺酰脲類除草劑殘留方法對(duì)于食品安全問題具有重要價(jià)值及影響意義。

近年來，對(duì)于磺酰脲類除草劑殘留量的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7-9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-14]。采用氣相色譜法分析時(shí)，由于磺酰脲類除草劑具有強(qiáng)極性、高沸點(diǎn)的特性，需要進(jìn)行衍生化處理，其操作繁雜，不適合日常多殘留的快速檢測(cè)。采用高效液相色譜法分析時(shí)，由于液相色譜的選擇性差，蜂蜜除了主要成分果糖、葡萄糖和水分外，還含有一些蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、多酚類物質(zhì)和維生素等，基質(zhì)較為復(fù)雜，當(dāng)目標(biāo)物檢測(cè)數(shù)量多時(shí)，分離難度大，容易導(dǎo)致干擾物與目標(biāo)待測(cè)物同時(shí)出峰，造成干擾，且許多國(guó)家對(duì)磺酰脲類除草劑的最大殘留限量規(guī)定較低，高效液相色譜法靈敏度達(dá)不到限量要求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性高、靈敏度強(qiáng)、穩(wěn)定性好、抗干擾能力突出，因此可作為分析磺酰脲類除草劑殘留量的優(yōu)選方法[15]。關(guān)于同時(shí)測(cè)定油菜花蜂蜜中多種磺酰脲類除草劑的方法尚未有報(bào)道。試驗(yàn)采用QuEChERS方法進(jìn)行凈化處理，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定油菜花蜂蜜中20種磺酰脲類除草劑的殘留量，該方法操作簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可為蜂蜜中農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酰嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯磺隆、醚磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、乙氧磺隆、氟吡磺隆、氯吡嘧磺隆、甲基碘磺隆、甲基二磺隆、嗪吡嘧磺隆、甲磺隆、嘧苯胺磺隆、丙嗪嘧磺隆、吡嘧磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞97%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）：美國(guó)Agilent公司。

乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)默克）；甲酸（色譜純，美國(guó)ACS）；無水MgSO4、氯化鈉（分析純，天津科密歐）；甲酸銨（色譜純，天津科密歐）；有機(jī)濾膜（0.22 μm，美國(guó)PALL）；水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；油菜花蜂蜜（購于鄭州市各大超市，于20 ℃保存）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀[LC-MS/MS，安捷倫6470（配Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜），美國(guó)Agilent公司]；電子天平（感量0.01 mg，MettLer ToLedo，XPE105-S/FACT）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5427 R，德國(guó)Eppendorf公司）；氮吹儀（N-EVAP 112，美國(guó)Organomation公司）；Heidolph multi reax多功能振蕩器（德國(guó)heidolph公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）

分別準(zhǔn)確稱取適量的20種磺酰脲類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，分別得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（折算每種標(biāo)準(zhǔn)品的純度），在-18 ℃條件下儲(chǔ)存。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）

分別準(zhǔn)確移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，得到10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，在-18 ℃條件下儲(chǔ)存。

1.2.1.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線

將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）根據(jù)需求稀釋，得到1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以陰性蜂蜜樣品提取液配制質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品前處理

對(duì)于未結(jié)晶的油菜花蜂蜜樣品，將其混勻。對(duì)于有結(jié)晶的油菜花蜂蜜樣品，在密閉條件下低于50 ℃水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后混勻，放置室溫冷卻。

精密稱取2.00 g混勻后的蜂蜜于50 mL離心管中，加入5 mL水稀釋，渦旋混勻2 min，加入10 mL 1%甲酸乙腈和5.0 g氯化鈉，旋渦混勻2 min，以4 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確量取5.0 mL上層提取液至含有50 mg PSA和25 mg C18吸附劑的50 mL離心管中，旋渦混勻2 min，以4 000 r/min離心5 min，過有機(jī)濾膜后供LCMS/MS測(cè)定。

1.2.3 LC-MS/MS分析

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相B相0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；A相0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液；流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧ESI；正離子；掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；干燥氣流速350 ℃；干燥氣溫度10 L/min；霧化氣壓力276 kPa；鞘氣流速11 L/min；鞘氣溫度375 ℃；毛細(xì)管電壓3 500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別進(jìn)行電噴霧ESI+、ESI-模式掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)[M+H]+的加合離子信號(hào)高且穩(wěn)定，故20種磺酰脲除草劑均為ESI+模式掃描。優(yōu)化每個(gè)母離子對(duì)應(yīng)的最優(yōu)裂解電壓，進(jìn)而得到強(qiáng)弱不同的子離子碎片，施加不同的碰撞能量以得到最佳豐度的離子，豐度值最高的離子對(duì)為定量離子，次級(jí)豐度值的離子對(duì)為定性離子。同時(shí)在MRM模式下對(duì)鞘氣溫度及流速、干燥器溫度及流速、毛細(xì)管電壓等參數(shù)做進(jìn)一步優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)質(zhì)譜條件。20種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 20種目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)及色譜保留時(shí)間

接表1

2.2 色譜條件優(yōu)化

由圖1和圖2可知，方法中20種磺酰脲類除草劑的峰形及分離效果較好，通過對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇液相色譜常用的甲醇和乙腈兩種有機(jī)溶劑，由于磺酰脲類除草劑為弱酸性化合物，在甲醇、乙腈中分別加入0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨，可明顯提高電噴霧離子化效率，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液比0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨乙腈溶液對(duì)20種磺酰脲類除草劑分離效果更充分，響應(yīng)值更高。同時(shí)考察0.01%甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液、0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液及0.01%氨水作為流動(dòng)相的分離情況，通過對(duì)比0.01%氨水分離效果較差，0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液質(zhì)譜響應(yīng)值最高，且目標(biāo)物峰形及保留時(shí)間重現(xiàn)性均較好。故試驗(yàn)選用0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液與0.01%甲酸-2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液作為流動(dòng)相。另外，為使20種磺酰脲類除草劑的分離效果達(dá)到最佳，進(jìn)而優(yōu)化流動(dòng)相洗脫條件，結(jié)果見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

圖1 20種目標(biāo)物總離子流色譜圖

圖2 20種目標(biāo)物定量離子色譜圖（10 μg/L）

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

在油菜花蜂蜜樣品中加入水溶解稀釋，通過有機(jī)試劑進(jìn)行提取，可起到去除一定糖分的作用?；酋ｋ孱惓輨┚哂腥跛嵝裕谒嵝詶l件下從水相中提取到有機(jī)相較為容易，故通過加標(biāo)回收對(duì)比甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈對(duì)目標(biāo)待測(cè)物的提取效果。由圖3可知，以甲醇、1%甲酸甲醇為提取液時(shí)，由于甲醇不能與水分層，20種目標(biāo)待測(cè)物除醚磺隆外，其余化合物的回收率均低于60%，提取效果較差，其中甲磺隆、苯磺隆、氯磺隆回收率分別為11.3%，12.48%和17.48%，提取效果最差。以乙腈為提取液時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率為52.77%～91.94%，提取效果顯著提高。以1%甲酸乙腈為提取液時(shí)，回收率為64.91%～101.81%，由于磺酰脲類除草劑在結(jié)構(gòu)和體系的pH影響下容易水解，乙腈中加入1%甲酸能夠有效提高易水解目標(biāo)物的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高待測(cè)目標(biāo)物的提取效果。

圖3 20種磺酰脲類除草劑在4種溶劑提取下的回收率（加標(biāo)10 μg/kg）

2.3.2 凈化方法的選擇

QuEChERS凈化方法是運(yùn)用不同的吸附劑與樣品中雜質(zhì)相互作用，從而實(shí)現(xiàn)凈化目標(biāo)化合物的效果，具有快速、簡(jiǎn)便、高效、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，適用于極性、非極性、高酸堿性等化合物，常用的吸附凈化劑有乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB）和無水硫酸鎂[16]。由圖4可知，分別采用PSA（50 mg）、C18（50 mg）、GCB（50 mg）和無水硫酸鎂（50 mg）對(duì)5 mL提取液進(jìn)行凈化時(shí)，GCB和無水硫酸鎂凈化效果較差，部分目標(biāo)化合物回收率低于60%，凈化效果差異較大，且GCB對(duì)乙氧磺隆和芐嘧磺隆有明顯吸附效應(yīng)。PSA和C18對(duì)目標(biāo)待測(cè)物的凈化效果顯著，PSA可以去除蜂蜜樣品中的葡萄糖、果糖、有機(jī)酸、多酚類等極性物質(zhì)，C18可以吸附蜂蜜樣品中的蛋白質(zhì)、芳香物質(zhì)中的酯類等非極性物質(zhì)。為進(jìn)一步優(yōu)化凈化劑使用量，進(jìn)而采用PSA和C18不同的配比組合進(jìn)行試驗(yàn)，由圖5結(jié)果可知，并不是PSA和C18添加量越多越好，隨著PSA和C18添加量增加，目標(biāo)待測(cè)物的回收率普遍呈下降趨勢(shì)，PSA添加量50 mg，C18添加量25 mg時(shí)目標(biāo)待測(cè)物回收率為77.5%～104.18%，其凈化效果最好。

圖4 20種磺酰脲類除草劑在4種凈化劑下的回收率（加標(biāo)10 μg/kg）

圖5 20種磺酰脲類除草劑在PSA和C18不同使用量下的回收率（加標(biāo)10 μg/kg）

2.4 工作曲線、檢出限和定量限

以陰性樣品的提取液配制目標(biāo)待測(cè)物質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。由表3可知，20種目標(biāo)化合物分別在各自的線性范圍內(nèi)呈良好關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均＞0.999 1。方法靈敏度采用低水平陰性樣品加標(biāo)來測(cè)試，檢出限以信噪比（rSN＞3）所對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度計(jì)，為0.5～1.0 μg/kg；定量限以信噪比（rSN＞10）所對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度計(jì)，為1.0～2.5 μg/kg。

表3 線性方程、檢出限和定量限

2.5 方法回收率與精密度

準(zhǔn)確稱取陰性油菜花蜂蜜樣品，分別添加10，50和100 μg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的20種磺酰脲類除草劑的標(biāo)準(zhǔn)混合液，采用上述方法進(jìn)行樣品加標(biāo)回收處理，每個(gè)濃度水平分別進(jìn)行6個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率及測(cè)定值的SRSD，結(jié)果見表4。計(jì)算所得加標(biāo)平均回收率為77.9%～104.1%，SRSD均小于10%，該方法的回收率與精密度較好。

表4 20種磺酰脲類除草劑的加標(biāo)平均回收率及SRSD（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

從超市選購6個(gè)油菜花蜂蜜，采用試驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，20種磺酰脲類除草劑均未檢出，且樣品譜圖無干擾峰，表明油菜花蜂蜜中檢出磺酰脲除草劑的風(fēng)險(xiǎn)較低，具有較高的安全性。

3 結(jié)論

通過對(duì)質(zhì)譜條件、液相色譜條件及前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，建立一種QuEChERS-LC-MS/MS測(cè)定油菜花蜂蜜中20種磺酰脲類除草劑殘留量的分析方法，并驗(yàn)證線性范圍、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率、精密度等方法學(xué)指標(biāo)。方法操作簡(jiǎn)單快捷，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，且尚未有對(duì)蜂蜜中磺酰脲類除草劑殘留量的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)道，為建立蜂蜜中磺酰脲類除草劑殘留量的檢測(cè)方法提供數(shù)據(jù)支撐，并為其批量篩查和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供參考。