2種廣葉繡球菌多糖分子量分布及抗炎活性比較

王宏雨，張迪，羅貝貝，翁夢婷，曾輝，林衍銓

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所（福州 350014）；2. 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心（福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia），子實體潔白細嫩，口感脆嫩爽滑，具有很高的營養(yǎng)保健價值。研究結(jié)果表明，繡球菌中β-葡聚糖含量豐富，具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、提高機體造血功能等多種生物活性[1-5]。其中，抗炎活性是廣葉繡球菌重要的生物學活性，Kim等[6]研究表明繡球菌水提物能夠抑制40/80化合物誘導的小鼠全身過敏反應和血清組胺的釋放，并降低PMA和A23187刺激的促炎性細胞因子的表達，在抗炎和抗過敏治療方面具有潛在的應用價值；Choi等[7]對繡球菌80%甲醇提取物的研究表明該成分能夠通過抑制IκBα的磷酸化從而降低LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的NO的釋放水平；Han等[8]對繡球菌甲醇提取的氯仿萃取部分進行高效制備液相分離，獲得一個高抗炎活性的成分SCF4，其能顯著抑制LPS誘導的促炎介質(zhì)NO、前列腺素E2及相關炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生，且不表現(xiàn)出細胞毒性。

課題組已有的研究表明，不同干燥方法得到的繡球菌子實體干制品的水溶性多糖分子量分布差異顯著，烘干品水溶性多糖成分分子量分布于10～30 kDa區(qū)域，而凍干品水溶性多糖成分則分布于200～400 kDa區(qū)域[9]。試驗進一步對2種不同干制方法獲得的繡球菌干品的水溶性多糖的主要成分進行分離純化，以初步純化后的廣葉繡球菌子實體烘干品可溶性多糖成分SCG-G和凍干品可溶性多糖成分SCG-D為研究對象，對其具體的HPSEC分子量分布特性進行比較，并通過檢測，分析其對RAW264.7巨噬細胞增殖影響，以及對RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中NO釋放量及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放量等指標的影響，比較2種繡球菌可溶性多糖成分的體外抗炎活性，為繡球菌可溶性多糖抗炎生物活性的應用提供理論依據(jù)，并為相關功能成分的食品與保健品生產(chǎn)過程中原料干燥方式和提取方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

繡球菌子實體鮮品（福建天益菌業(yè)有限公司）。右旋糖酐分子量標準10種（中國食品藥品檢定研究院）；Dextran、DXT1090K、DXT2370K右旋糖酐分子量標準（美國APSC）；CellCounting Kit-8（日本DOJINDO Laborataries）；DMSO D2650（美國SIGMA）；RPMI-1640（美國GIBCO）；FBS（美國ExCell Biology）；RAW264.7細胞、0.25% Trypsin-EDTA、小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒（中國江蘇凱基生物技術股份有限公司）；NO含量測定試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純、色譜純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（中國蘇州凈化）；IX51生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；多功能酶標儀（美國BioTek）；xd-101 CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO）；U1900紫外掃描分光光度計（日本Hitachi公司）；Waters 2695液相色譜儀（美國WATERS公司）；UM 5000蒸發(fā)光檢測儀（北京通微分析儀器有限公司）；TSKgel GMPWxl色譜柱（日本東曹株式會社）；Centrifuge 5804 R離心機（德國艾本德公司）；Pilot3-6L真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康有限公司）；Milli-Q plus超純水器（Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 繡球菌水溶性多糖成分的制備與純化

廣葉繡球菌熱風干燥品多糖和真空冷凍干燥品多糖的制備方法參照文獻[8]，采用熱水提取，三氯乙酸脫蛋白的方法進行。

烘干品水溶性多糖組分SCG-G的純化：將烘干品多糖用蒸餾水溶解，離心取上清定容為100 mg/mL的溶液，加入等體積的無水乙醇，混勻后靜置過夜，以8 000 r/min離心10 min取上清，收集上清液減壓濃縮至原體積的1/3，用截留分子量1 000的透析袋，對蒸餾水透析48 h，透析后冷凍干燥即為烘干品水溶性多糖SCG-G。

凍干品水溶性多糖組分SCG-D的純化：凍干品多糖用蒸餾水溶解后離心取上清定容為100 mg/mL的溶液，加入等體積的無水乙醇，混勻后靜置過夜，以8 000 r/min離心10 min取沉淀部分，沉淀部分用蒸餾水溶解后以8 000 r/min離心10 min取上清，用截留分子量14 000的透析袋，對蒸餾水透析48 h，透析后冷

凍干燥即為凍干品水溶性多糖SCG-D。

1.3.2 繡球菌多糖成分SCG-D、SCG-G分子量測定與多糖含量測定

多糖分子量分布測定采用高效凝膠滲透色譜法，參考張迪等[10]試驗方法并稍作調(diào)整。

色譜條件：流動相采用0.05 mol/L乙酸銨，流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量20 μL；色譜柱TSKgel GMPWxL（7.5 mm×300 mm）。ELSD檢測器：載氣為空氣；載氣壓力4.5 bar；流量2 L/min；漂移管溫度60 ℃；數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)Empower GPC。

以重均分子量2 700，5 250，13 050，64 650，135 350，300 600，922 000和1 719 000 Da的右旋糖酐為標準品，以保留時間對分子量的對數(shù)作線性回歸。多糖樣品和標準品用0.05 mol/L乙酸銨溶液溶解為約2 mg/mL的濃度，用于HPSEC分析。

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法，多糖樣品用蒸餾水配制成1 mg/mL濃度，取樣100 μL蒸餾水補足至1 mL后參照NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》[11]中的檢測方法進行測定。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力

采用CCK-8法檢測2種繡球菌多糖對RAW264.7細胞增殖活力的影響。試驗方法參照文獻[12]。將RAW264.7細胞消化、計數(shù)、配制成濃度5×104個/mL的細胞懸液，于96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細胞懸液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設立陰性對照組，不同質(zhì)量濃度繡球菌多糖試驗組，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL相應的含藥培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h，搖床10 min輕輕混勻后，450 nm處檢測吸光度（A）。

1.3.4 細胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6濃度的檢測

ELISA檢測方法根據(jù)試劑盒說明書和參考文獻[13]中所述方法略作修改，將RAW264.7細胞消化、計數(shù)、配制成濃度5×105CFU/mL的細胞懸液接種到培養(yǎng)板中，設置空白組，LPS模型組（1 μg/mL），繡球菌多糖組（多糖10 μg/mL+LPS 1 μg/mL，多糖50 μg/mL+LPS 1 μg/mL，多糖100 μg/mL+LPS 1 μg/mL，多糖150 μg/mL+LPS 1 μg/mL），置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，藥物與LPS共同孵育24 h，然后測定細胞上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)應用SPSS 23.0軟件分析處理，采用ANOVA方差分析進行組間差異性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球菌多糖成分SCG-G和SCG-D的高效凝膠滲透色譜分析

由圖1和圖2可知，繡球菌多糖SCG-G和SCG-D在色譜圖上均呈現(xiàn)單一色譜峰。如表1所示，苯酚-硫酸法測得的多糖含量均在95%以上，說明二者均為均一多糖。通過重均分子標準曲線得到其重均分子量分別為1.48×104Da和2.47×105Da，最高峰分子量分別為1.20×104Da和2.14×105Da，多分散性指數(shù)表明2種多糖均具較好的均一性。

圖1 繡球菌子實體烘干品多糖SCG-G成分的凝膠色譜圖

圖2 繡球菌子實體凍干品多糖SCG-D成分的凝膠色譜圖

表1 繡球菌多糖成分SCG-G和SCG-D HPSEC數(shù)據(jù)

2.2 繡球菌多糖成分對RAW264.7細胞增殖的影響

SCG-G和SCG-D這2種多糖對RAW264.7細胞增殖影響如圖3所示。SCG-D在低濃度時對RAW264.7增殖與空白對照組相近；質(zhì)量濃度60 μg/mL以上時RAW264.7細胞增殖活性開始降低；質(zhì)量濃度250 μg/mL時，細胞增殖活力為79.03%，呈劑量效應關系。由圖3可見，SCG-D對RAW264.7細胞增殖活力影響較小，具有低細胞毒性的特點。與對照空白組相比，SCG-G對RAW264.7細胞增殖活力影響較大，呈明顯抑制作用，且同等濃度下，SCG-G對RAW264.7細胞增殖抑制作用明顯強于SCG-D。

圖3 繡球菌多糖對RAW264.7細胞增殖的影響

2.3 繡球菌多糖成分對LPS誘導的RAW264.7細胞NO分泌量的影響

LPS是革蘭陰性菌細胞壁外壁的組成成分，作用機體時激活巨噬細胞產(chǎn)生NO和釋放細胞免疫因子。由圖4可知，LPS干預后的RAW264.7細胞模型組分泌的NO濃度從空白組的4.09 μmol/L升高到20.34 μmol/L，升高約5倍，說明LPS對RAW264.7細胞炎癥性反應建模成功。繡球菌凍干品多糖SCG-D在試驗濃度范圍內(nèi)對LPS誘導的NO分泌具有極顯著抑制作用（P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量效應關系。繡球菌烘干品多糖SCD-G在低濃度（10和50 μg/mL）對LPS誘導NO的分泌與LPS組相比具有顯著抑制作用（P＜0.01），但到高質(zhì)量濃度（150 μg/mL）時對NO的分泌反而表現(xiàn)出一定促進作用。

圖4 繡球菌多糖對RAW264.7巨噬細胞分泌NO的影響

2.4 繡球菌多糖成分對LPS誘導巨噬細胞RAW264.7分泌炎癥因子水平的影響

2.4.1 繡球菌多糖成分對LPS誘導巨噬細胞RAW264.7分泌TNF-α的影響

TNF-α是炎癥初期最早出現(xiàn)的炎癥因子，主要由巨噬細胞分泌，能促進炎癥的發(fā)生與發(fā)展。由圖5可見，空白組分泌TNF-α濃度23.20 pg/mL，LPS誘導組分泌TNF-α濃度為60.45 pg/mL，LPS誘導下TNF-α的分泌水平增加近3倍。與LPS誘導組相比，SCG-D在低濃度（10 μg/mL）下即可顯著抑制LPS誘導的TNF-α分泌（P＜0.05），且隨著濃度增加呈現(xiàn)劑量效應關系。SCG-G對LPS誘導的TNF-α分泌無顯著抑制作用，且高濃度（100和150 μg/mL）時，反而表現(xiàn)出極顯著促進作用（P＜0.01）。

圖5 繡球菌多糖對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α的影響

2.4.2 繡球菌多糖成分對LPS誘導巨噬細胞RAW264.7分泌IL-6的影響

由圖6所示，空白組IL-6濃度21.07 pg/mL，LPS誘導組IL-6濃度43.14 pg/mL。與LPS組相比，SCG-D在質(zhì)量濃度50 μg/mL時即呈現(xiàn)對LPS誘導的IL-6分泌的顯著抑制作用（P＜0.01）；隨著SCG-D濃度上升，抑制作用逐漸增強，呈劑量效應關系，SCG-D濃度150 pg/mL時，IL-6濃度為27.63 pg/mL，抑制率達到70.29%。SCG-G對LPS誘導巨噬細胞RAW264.7分泌IL-6無顯著抑制作用，高質(zhì)量濃度（150 μg/mL）時則表現(xiàn)出顯著促進作用（P＜0.05）。

圖6 繡球菌多糖對LPS誘RAW264.7導巨噬細胞分泌IL-6的影響

2.4.3 繡球菌多糖成分對LPS誘導巨噬細胞RAW264.7分泌IL-1β的影響

由圖7所示，空白組IL-1β濃度15.33 pg/mL，LPS誘導組IL-1β濃度35.17 pg/mL。與LPS組相比，SCG-D對LPS誘導的IL-1β分泌的抑制作用在50 μg/mL濃度時候即達極顯著水平（P＜0.01），并隨著濃度升高呈現(xiàn)劑量效應關系；質(zhì)量濃度150 μg/mL時，IL-1β濃度為20.67 pg/mL，抑制率達到73.09%。而烘干品多糖SCG-G在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)則表現(xiàn)出促進LPS誘導的IL-1β分泌的作用。

圖7 繡球菌多糖對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞分泌IL-1β的影響

3 討論與結(jié)論

相關研究結(jié)果表明，繡球菌中的可溶性多糖具有很好的免疫調(diào)節(jié)和體外抗腫瘤、抗炎的活性[16-18]，因此繡球菌水提物作為功能食品原料具有很好的應用價值。

在繡球菌水溶性多糖的結(jié)構(gòu)和活性研究方面，有研究表明不同材料和提取方法獲得的水溶性多糖的分子量分布和構(gòu)成都有較大差異，同時，提取材料和提取方法對其活性成分的活性也有較大影響。Ohno等[14]對繡球菌干品水提多糖的分析表明，其水溶多糖中也存在β-葡聚糖，主要存在于1倍乙醇沉淀級份中，其分子量也較大，但含量較低；Yamamoto等[19]發(fā)現(xiàn)繡球菌的熱水提取的分子量8 000以下的小分子成分能夠顯著抑制S180荷瘤小鼠的生長，增加其脾淋巴細胞INF-g的釋放，并抑制腫瘤血管的生成，而該成分在傳統(tǒng)的水提醇沉的多糖提取工藝中往往無法回收。張曉菲[20]采用超聲波提取的繡球菌菌絲水溶性多糖的分子量主要分布在70～8 000 kDa區(qū)域，其中8×107Da的均一多糖能顯著提高人單核白血病THP-1細胞株IFN-α釋放水平，表現(xiàn)出增強免疫的活性。張雪夢等[21]通過水提分級醇沉獲得8個水溶性多糖成分，其中激活Dectin-1受體活性最強的20E成分的重均分子量約500 kDa。郝正祺等[22]分離得到分子量1.04×104Da的繡球菌可溶性多糖成分SIP，其能顯著提高巨噬細胞的吞噬能力、NO分泌量，增加細胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10、IFN-β免疫因子mRNA的表達量。試驗通過熱水提取法從繡球菌真空冷凍干燥品原料和熱風干燥品原料中獲得不同分子量分布構(gòu)成的繡球菌水溶性多糖，并對它們的主要成分分別進行分離純化，得到2個均一多糖，重均分子量分別為2.47×105Da和1.48×104Da，其中分子量較小的烘干品多糖SCG-G，其最高峰分子量為1.2×104Da，與郝正祺等[22]從烘干品中分離得到的繡球菌多糖SIP的分子量相似。

通過CCK-8法檢測繡球菌多糖成分對巨噬細胞RAW264.7增殖活力的影響，結(jié)果表明SCG-D具有較低的細胞毒性，對RAW264.7增殖影響較小，而烘干品多糖成分SCG-G在高試驗濃度（50～150 μg/mL）下能顯著抑制RAW264.7細胞的增殖，250 μg/mL濃度時抑制率接近50%，表現(xiàn)出顯著的細胞毒性。郝正祺等[22]分離獲得的SIP與試驗獲得的SCG-G的分子量基本一致，但SIP對RAW264.7細胞未發(fā)現(xiàn)顯著的細胞毒性，但亦無突出的促進增殖活性，考慮其試驗處理濃度在1.95～31.25 μg/mL的低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，推測降低SCG-G處理濃度，控制在10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有可能消除其對細胞增殖的抑制，但有待進一步驗證。

炎癥是在致炎因素的作用下，由炎癥細胞及其釋放的炎癥介質(zhì)參與引起的一系列病理生理過程，過度的炎癥反應產(chǎn)生的損傷因子會直接或間接造成組織和細胞的破壞[23]。以LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型對2種可溶性繡球菌多糖的抗炎活性進行檢測和比較，結(jié)果表明SCG-D對LPS誘導的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌具有顯著的抑制作用，這與Choi等[7]前期對繡球菌水提物抗炎活性的研究結(jié)果相符。而SCG-G對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子的分泌基本無明顯的抑制效果，反而在較高濃度時還表現(xiàn)出顯著的刺激作用，這與郝正祺等[22]對繡球菌SIP多糖對RAW264.7細胞免疫因子mRNA表達量影響的趨勢一致，同時也與王萌皓等[24]對繡球烘干品中可溶性β-D-葡聚糖成分促進RAW264.7巨噬細胞NO釋放，以及IL-6、TNF-α因子轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的變化趨勢相符。NF-κB通路是研究較為廣泛的促炎細胞因子調(diào)節(jié)通路，也是LPS細菌脂多糖的主要作用通路，同時其與細胞凋亡也有密切關系[25]，試驗中SCG-G多糖高濃度處理組表現(xiàn)出顯著的促炎作用，同時高濃度處理組72 h細胞增殖率亦表現(xiàn)出較高的細胞毒性，推測可能與其通過促炎細胞因子調(diào)節(jié)通路誘導的后期細胞凋亡作用有關。

綜上所述，在繡球菌活性多糖提取及相關繡球菌水提物功能產(chǎn)品研發(fā)中，應當根據(jù)具體的目標功能成分的需求，慎重選擇提取原料和提取工藝，無差別的傳統(tǒng)水提醇沉工藝可能會造成目標功能成分的丟失或起不到功能成分富集增效的目的。試驗中繡球菌凍干品原料和烘干品原料的活性差異顯著，繡球菌凍干品可溶性多糖SCG-D具有較好的體外抗炎作用，可見在抗炎活性多糖成分提取中，宜以繡球菌凍干品為原料，采用熱水提取工藝，以100 kDa以上中高分子量部分為目的成分進行提取制備，而有關SCG-D的具體構(gòu)效關系和抗炎作用機理也有待進一步深入研究。