紫菜和黑木耳中脂肪提取方法及脂肪酸組成研究

吳麗華，洪霞，王燕姣，馬燕，錢瀅文，何海寧

1. 甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司（蘭州 730010）；2. 甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司（蘭州 730010）

研究表明：紫菜中蛋白質(zhì)含量為34%，鐵、磷等維生素含量為24%，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，被譽(yù)為理想的營養(yǎng)佳品之一[1-3]；紫菜的主要功效有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱化痰、利咽止咳、養(yǎng)心除煩、利水除濕[4-5]，主治癭瘤瘰疬、咳嗽痰稠、咽喉腫痛、煩躁失眠、腳氣水腫、小便淋痛等癥[6-8]。被稱之為“菌中之冠”的木耳，又稱黑木耳，由古書記載，具有“益氣補(bǔ)肌，輕身強(qiáng)志”的功效[9]。黑木耳中碳水化合物含量65%，蛋白質(zhì)含量10.6%，鐵、鈣、磷等微量元素總含量1.86%，還含有豐富的腦磷脂、卵磷脂等營養(yǎng)物質(zhì)，被譽(yù)為“素中之葷”[10-12]，其中蛋白質(zhì)、維生素和鐵的含量均比白木耳高出1倍[13-14]，其蛋白質(zhì)中包括多種氨基酸，尤其以天門冬氨酸、谷氨酸、克氨酸、懶氨酸等含量最為豐富[15]。木耳中含有一種特殊的植物膠質(zhì)，有較強(qiáng)的吸附作用，可將殘留在人體消化系統(tǒng)的灰塵雜質(zhì)集中吸附并排出體外，從而起到排毒作用[16]。

對(duì)紫菜和黑木耳中主要營養(yǎng)成分的提取和測(cè)定方法有很多，如：皮勝濤等[17]采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)，建立一種優(yōu)化的超聲萃取法測(cè)定紫菜中碘含量，該方法簡(jiǎn)單、可靠，線性關(guān)系好，檢出限低；曾臻等[18]建立ICP-MS同時(shí)測(cè)定干紫菜中28種元素的檢測(cè)方法，通過對(duì)干紫菜中元素含量測(cè)定，可為干紫菜質(zhì)量檢測(cè)、質(zhì)量評(píng)價(jià)及其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)；邱偉芬等[19]以條斑紫菜為原料，采用水提醇沉法提取條斑紫菜粗多糖，用過氧化氫和抗壞血酸聯(lián)合的方法對(duì)條斑紫菜粗多糖進(jìn)行降解，對(duì)降解多糖進(jìn)行分離純化后，并對(duì)純化的組分進(jìn)行化學(xué)成分分析、結(jié)構(gòu)分析、體外免疫活性和體外抗氧化活性研究。

由于紫菜和黑木耳基質(zhì)復(fù)雜、脂肪含量低、提取過程耗時(shí)長(zhǎng)等特點(diǎn)，對(duì)紫菜和黑木耳中脂肪的測(cè)定研究很少見諸報(bào)道。試驗(yàn)基于索氏抽提法和酸水解法分別提取紫菜和黑木耳中的脂肪含量，同時(shí)對(duì)其提取過程中的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并通過氣相色譜儀對(duì)其脂肪酸組成成分進(jìn)行定性分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫菜、黑木耳樣品各10種（市售）。

石油醚（沸程30～60 ℃，分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；鹽酸、無水乙醚（均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

JYL-C012粉碎機(jī)（九陽股份有限公司）；XS225A-SCS電子天平（普利賽斯上海天美天平儀器有限公司）；HH-S16S恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；DHG-9073BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療制造有限公司）；Agilent 7890B氣相色譜儀[安捷倫（上海）科技有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 索氏抽提法

樣品處理。將樣品打碎均勻后稱取2～5 g（含油量少的樣品稱樣量相對(duì)較大），全部移入濾紙筒內(nèi)，將包好樣品的濾紙筒放入101～105 ℃干燥箱內(nèi)烘4 h至干燥無水[5]備用。

樣品抽提。將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的平底燒瓶，由冷凝管上端加入石油醚至瓶?jī)?nèi)溶劑的2/3處，于水浴上加熱，使石油醚不斷回流，連續(xù)抽提8 h。取下燒瓶后，回收石油醚，待瓶?jī)?nèi)溶劑剩余1～2 mL時(shí)在水浴上蒸干，于100±5 ℃干燥1 h，放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。

1.2.2 酸水解法

樣品消化。稱取約2～5 g（含油量少的樣品稱樣量相對(duì)較大）試樣置于試管中，加入8 mL水，加入10 mL鹽酸。將試管放入70～80 ℃水浴中，每隔5～10 min攪拌1次，至試樣消化完全。

樣品提取。取出試管，加入10 mL乙醇，冷卻后移入具塞三角瓶中，以25 mL無水乙醚分?jǐn)?shù)次洗試管，一并倒入三角瓶。加塞振搖1 min，放氣后蓋塞靜置12 min，用乙醚-石油醚等比混合液沖洗瓶塞及瓶口附著的脂肪。靜置10～20 min，待分層清晰后，吸出上清液于已恒重的燒杯內(nèi)，加5 mL乙醚-石油醚等比混合液于三角瓶?jī)?nèi)，振搖、靜置后仍將上層液吸出，放入燒杯內(nèi)，蒸干、稱量。

1.2.3 色譜條件

色譜柱HP-88（100 mm×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫150 ℃（2 min）→8 ℃/min→240 ℃（7 min）；汽化溫度250 ℃；檢測(cè)溫度250 ℃；氮?dú)?.0 mL/min；進(jìn)樣方式采用不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)液及樣品凈化液注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖，以保留時(shí)間定性，以樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜脂肪含量提取

試驗(yàn)探索索氏抽提法和酸水解法提取不同種類紫菜樣品中的脂肪含量（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)），每一樣品重復(fù)測(cè)定6次，取其平均值，分別得到標(biāo)準(zhǔn)偏差及實(shí)驗(yàn)室變異系數(shù)（C.V.）。其結(jié)果見表1。

通過2種方法對(duì)不同種類紫菜中的脂肪含量進(jìn)行提取比較研究，每一樣品重復(fù)測(cè)定6次后取其平均值，由表1可知，索氏抽提法的測(cè)定結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中C.V.＜2.7%的要求，酸水解法的結(jié)果同時(shí)滿足C.V.＜2.0%的要求。其中，索氏抽提法對(duì)10種紫菜樣品中的脂肪提取含量在0.11～0.21 g/100 g范圍內(nèi)，而酸水解法測(cè)得的10種紫菜樣品中的脂肪含量在2.63～2.76 g/100 g范圍內(nèi)，這是由于酸水解法能同時(shí)提取游離態(tài)脂肪和飽和態(tài)脂肪，因此，酸水解法更適合于紫菜中脂肪含量的提取。

表1 索氏抽提法和酸水解法提取紫菜中脂肪含量比較

2.2 黑木耳脂肪含量提取

用索氏抽提法和酸水解法提取10種黑木耳樣品中的脂肪含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），每一樣品重復(fù)測(cè)定6次取平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差及CV見表2。

表2 索氏抽提法和酸水解法提取黑木耳中脂肪含量比較

通過2種方法對(duì)不同種類的10種黑木耳中脂肪含量進(jìn)行提取比較研究，由表2可知，索氏抽提法測(cè)得10種黑木耳樣品中的脂肪含量范圍為0.07～0.16 g/100 g，其結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008中C.V.＜2.7%的要求，而酸水解法測(cè)得的結(jié)果也均滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008中C.V.＜2.0%的要求，10種黑木耳樣品中的脂肪含量在2.18～2.37 g/100 g范圍內(nèi)，由于酸水解法能同時(shí)提取游離態(tài)和結(jié)合態(tài)脂肪，使其更適合用于黑木耳中脂肪含量的充分提取。

2.3 提取過程中影響因素的優(yōu)化

2.3.1 索氏抽提法提取過程中影響因素的優(yōu)化

考察水分對(duì)樣品中脂肪含量提取的影響。將裝有樣品的濾紙筒放入103 ℃干燥箱內(nèi)烘4 h，選取脂肪含量相對(duì)較高的7號(hào)紫菜樣品和9號(hào)黑木耳樣品為對(duì)象進(jìn)行分析研究，如圖1所示。結(jié)果表明，水分對(duì)樣品中脂肪含量提取影響很大，這是由于在提取過程中可能出現(xiàn)的水包油情況導(dǎo)致樣品中的脂肪提取不完全。

圖1 水分對(duì)樣品中脂肪含量提取的影響

2.3.2 酸水解法提取過程中影響因素的優(yōu)化

考察不同消化時(shí)間對(duì)樣品中脂肪含量提取的影響。選取1號(hào)紫菜樣品（0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 h）和7號(hào)黑木耳樣品（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h）為研究對(duì)象。如圖2所示，隨著消化時(shí)間的增大，脂肪含量不斷增大，且在3.0 h后黑木耳中脂肪含量最高且不再增加，表明已提取完全，因此，試驗(yàn)選擇3.0 h為最優(yōu)消化時(shí)間；而紫菜的最優(yōu)消化時(shí)間為5.0 h，其脂肪含量不再上升，達(dá)到提取完全的效果。

圖2 不同消化時(shí)間對(duì)樣品中脂肪含量提取的影響

考察不同溶劑在提取脂肪含量過程中的影響。方法1：試樣消化結(jié)束后，加入10 mL乙醇，冷卻后移入具塞三角瓶中，用25 mL無水乙醚分?jǐn)?shù)次洗試管，一并轉(zhuǎn)移至三角瓶，振搖提取后，用乙醚沖洗瓶塞及瓶口附著的脂肪，靜置后將上層液吸出，加5 mL無水乙醚于三角瓶?jī)?nèi)重復(fù)提取。方法2：加10 mL乙醇于消化好的試樣，冷卻后移入具塞三角瓶中，用25 mL無水乙醚分?jǐn)?shù)次洗試管后轉(zhuǎn)移至三角瓶振搖提取，用乙醚-石油醚等比混合液沖洗瓶塞及瓶口附著的脂肪，靜置后將上層液吸出，加5 mL乙醚-石油醚等比混合液于三角瓶?jī)?nèi)重復(fù)提取。以1號(hào)紫菜和7號(hào)黑木耳樣品為例，由圖3可知，2種溶劑對(duì)樣品中脂肪含量的提取效果無明顯差異，含量基本相同。但在振搖提取過程中，采用方法2提取方式可避免發(fā)生乳化現(xiàn)象，沖洗附著在瓶壁上的脂肪效果較好。

圖3 不同提取溶劑對(duì)樣品中脂肪含量提取的影響

2.4 氣相色譜法對(duì)紫菜和黑木耳中脂肪酸成分的測(cè)定

試驗(yàn)將酸水解法提取的紫菜和黑木耳中的脂肪酸根據(jù)GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》中規(guī)定的第三法進(jìn)行樣品前處理后，利用氣相色譜儀對(duì)紫菜和黑木耳中脂肪酸成分進(jìn)行定性分析研究，如圖4所示：紫菜中脂肪酸主要包括葵酸甲酯、十五碳酸甲酯、亞麻酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、花生酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、山崳酸甲酯，其中山崳酸甲酯含量最高。而黑木耳中脂肪酸主要包括硬脂酸甲酯、十六碳酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、花生酸甲酯、亞麻酸甲酯，其中含量最高的是花生酸甲酯。

圖4 紫菜和黑木耳中脂肪酸成分定性研究色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)分別采用索氏抽提法和酸水解法，同時(shí)優(yōu)化提取條件，對(duì)10種紫菜和黑木耳中的脂肪含量進(jìn)行對(duì)比提取，采用氣相色譜法將兩種樣品中的脂肪酸組成成分進(jìn)行定性分析研究。結(jié)果表明，酸水解法更適合于紫菜和黑木耳樣品中脂肪含量的測(cè)定，利用氣相色譜法對(duì)提取的脂肪酸成分進(jìn)行定性分析研究，與34種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)：紫菜中脂肪酸主要包括葵酸甲酯、十五碳酸甲酯、亞麻酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、花生酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、山崳酸甲酯，其中，山崳酸甲酯含量最高。而黑木耳中脂肪酸主要包括硬脂酸甲酯、十六碳酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚一烯酸甲酯、花生酸甲酯、亞麻酸甲酯，其中含量最高的是花生酸甲酯。相比于索氏抽提法，酸水解法除了提取游離態(tài)脂肪外，還能提取樣品中的結(jié)合態(tài)脂肪，耗時(shí)短，靈敏度高，測(cè)得結(jié)果更為準(zhǔn)確，尤其對(duì)脂肪含量較低的樣品酸水解法提取效果更好，有望應(yīng)用于其他樣品中脂肪含量的測(cè)定。