表面活性劑協(xié)同超聲提取香菇多糖

張琴，康明麗*，趙茹，張揚，朱志強, ，周永斌, *

1. 河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院（石家莊 050000）；2. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室（天津 300384）；3. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所（天津 300384）

我國食用菌產(chǎn)量位居世界第一，其中香菇產(chǎn)量2020年達1 188萬 t，占食用菌總產(chǎn)量29.3%[1]。香菇（Lentinus edodes）是藥食兩用真菌[2]，屬擔子菌綱、口蘑科、傘菌目的香菇屬，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，被視為“菇中之王”[3]。香菇多糖（Lentinan，LNT）是從香菇中提取的天然活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等活性，在藥物研發(fā)行業(yè)有著較大的發(fā)展?jié)摿?，是目前的研究熱點[4-6]。

香菇多糖的提取工藝主要有熱水浸提法、酸浸提法、低溫氣流破壁法、微生物發(fā)酵提取法和酶提取法[7-10]，這些方法存在耗時長、提取效率不高或能耗較高等不足。超聲波輔助提取法相對于傳統(tǒng)的方法，操作更加簡單快捷，提高了提取效率，節(jié)約了大量的時間，其工藝成本也相對較低[11-13]。表面活性劑是近年來發(fā)展起來的一種提取方法，可以降低溶劑與物料之間的界面張力，使得物料更易浸潤，溶劑也易于滲透植物細胞中，增強物質(zhì)的溶解性[14-15]。利用表面活性劑協(xié)同超聲提取香菇多糖的研究較少，表面活性劑協(xié)同超聲提取香菇多糖，能更大程度上使多糖析出，提高提取效率。試驗以香菇為原材料，進行了表面活性劑的篩選，并采用表面活性劑協(xié)同超聲輔助提取技術(shù)對多糖進行提取，為香菇多糖提取提供實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇：河北省淶水縣香菇基地，挑選形狀大小基本一致、無病蟲害的香菇子實體，使用恒溫鼓風干燥箱將樣品烘干至質(zhì)量差低于0.01 g，經(jīng)FW100型高速萬能粉碎機粉碎得粉末，過0.250 mm篩，備用。

吐溫-80（分析純，天津市光復(fù)精細化工廠）；十二烷基硫酸鈉（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；聚乙二醇-400、酒石酸鉀鈉（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖酯（分析純，北京迪朗生化科技有限公司）；3, 5-二硝基水楊酸（分析純，津東天正精細化學(xué)試劑廠）；鹽酸（分析純，煙臺市雙雙化工有限公司）；無水亞硫酸鈉（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠）；亞鐵氰化鉀（分析純，天津歐博凱化工有限公司）；乙酸鋅（分析純，天津博迪化工股份有限公司）。

UV-5100B紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥機（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；SB-5200DT超聲清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；TGL-16C離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FA1204B型分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 香菇多糖提取工藝

參考王莉麗等[16]的方法稍作修改。準確稱取2.0 g香菇粉末樣品置于250 mL錐形瓶中，按照一定的料液比加入含有表面活性劑的去離子水，在室溫下超聲處理提取一段時間后，離心10 min，吸取15 mL上清液，加入3 mL乙酸鋅溶液和3 mL亞鐵氰化鉀溶液，在容量瓶中定容至50 mL，離心取上清液，得多糖提取液。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

1.2.2.1 不同表面活性劑種類對多糖含量的影響

以多糖含量為指標，固定超聲處理時間40 min、料液比1∶30（g/mL）、表面活性劑添加量2%，考察不同類型表面活性劑（聚乙二醇-400、十二烷基硫酸鈉、吐溫-80、蔗糖酯）對多糖含量的影響。

1.2.2.2 不同表面活性劑用量對多糖含量的影響

以多糖含量為指標，按1.3.2.1小節(jié)選擇表面活性劑種類聚乙二醇-400，固定超聲處理時間40 min和料液比1∶20（g/mL），考察不同表面活性劑用量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%）對多糖含量的影響。

1.2.2.3 不同料液比對多糖含量的影響

以多糖含量為指標，按以上小節(jié)確定表面活性劑種類聚乙二醇-400，聚乙二醇-400添加量為2%，固定超聲處理時間40 min，考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對多糖含量的影響。

1.2.2.4 不同超聲處理時間對多糖含量的影響

以多糖含量為指標，按以上小節(jié)確定的最佳條件聚乙二醇-400、料液比1∶20（g/mL）、聚乙二醇-400添加量2.0%，考察不同超聲處理時間（20，30，40，50和60 min）對多糖含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面分析因素與水平見表1，并進行方程擬合最適條件的驗證。

表1 響應(yīng)面分析因素水平

1.2.4 多糖含量的計算

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的制作

按照葡萄糖標準曲線的制作方法[17]，用移液槍精精移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL 1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液，各自置于10 mL比色皿中，分別補水至2.0 mL，以純水為對照，依次加入2.0 mL的DNS，沸水浴5 min，冷卻，搖勻，設(shè)置波長540 nm，測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標，相對應(yīng)的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程y=1.437 6x-0.065 2（R2=0.997 1）。

1.2.4.2 多糖含量的測定及含量的計算

采用3, 5-二硝基水楊酸法測定多糖含量[18-19]，按式（1）計算香菇多糖的含量。

式中：X為多糖含量，%；M為香菇稱樣量，g；m2為樣品溶液的吸光度對應(yīng)標準曲線，查得的多糖質(zhì)量，mg；v1為提取體積，mL；v2為分取體積，mL；v3為最后定容體積，mL；v4為用于比色的樣液體積，mL；100為換算為百分含量的系數(shù)；1 000為將g換算成mg的系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0、Origin 8.0和Design Expert 11處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同表面活性劑種類對香菇多糖含量的影響

如圖1所示，在其他條件相同的情況下，處理組比空白組的多糖含量高，說明表面活性劑協(xié)同超聲提取香菇多糖的效果明顯，多糖含量由大到小排列：聚乙二醇-400＞十二烷基硫酸鈉＞蔗糖酯＞吐溫-80＞空白。其中聚乙二醇-400的提取效果最好，多糖含量為6.42%。因此，在后續(xù)采用聚乙二醇-400協(xié)同超聲提取香菇多糖。

圖1 表面活性劑種類對多糖含量的影響

2.1.2 不同表面活性劑添加量對香菇多糖含量的影響

如圖2所示，表面活性劑添加量在1%～2%時香菇多糖含量表現(xiàn)出上升趨勢，當添加量為2.0%時，多糖含量達到最大值5.58%，當添加量超過2.0%后，多糖含量降低，因此，聚乙二醇-400提取香菇多糖的最佳添加量為2.0%。

圖2 表面活性劑添加量對多糖含量的影響

2.1.3 不同料液比對香菇多糖含量的影響

由圖3可知，多糖含量隨著料液比中液體占比的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，當料液比為1∶20（g/mL）時，香菇多糖含量達到了最大值5.51%，當繼續(xù)增加料液比中液體占比時，多糖含量降低。綜合考慮，料液比選擇1∶20（g/mL）合適。

圖3 料液比對多糖含量的影響

2.1.4 不同超聲處理時間對香菇多糖含量的影響

由圖4可知，隨著超聲處理時間的延長，香菇多糖含量增加，在超聲處理時間為40 min時，多糖含量為5.57%，高于其他超聲處理時間，隨著超聲處理時間延長，多糖含量降低。因此，超聲處理時間選擇40 min最為合適。

圖4 超聲處理時間對多糖含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果

響應(yīng)面試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以香菇多糖含量為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken法進行試驗方案設(shè)計，并對結(jié)果進行響應(yīng)面分析，方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗方案與試驗結(jié)果

2.2.2 模型建立與方差分析結(jié)果

采用Design Expert 11軟件對表2中的試驗結(jié)果進行多項擬合回歸，得到多糖含量Y對A、B、C的二次多項回歸模型方程：Y=7.01+0.64A+0.35B+0.19C-0.06AB+0.055AC+0.31BC-0.4A2-1.19B2-1.27C2。

為了檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?，區(qū)分各因素對香菇粗多糖含量影響的差異，對回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表3所示。其中，F(xiàn)值可以用來檢驗各變量對香菇多糖含量影響的顯著性的高低。F值越高，相應(yīng)變量的顯著程度就越高。從表3可知，A、B、C三個工藝條件對香菇多糖含量影響的順序從大到小為A＞B＞C，即表面活性劑＞料液比＞超聲處理時間。模型的F值69.09，P＜0.000 1，差異極顯著；失擬項P=0.211 7，差異不顯著，這說明試驗誤差較?。幌嚓P(guān)系數(shù)R2=0.989 5，校正系數(shù)Radj2=0.976 0，說明響應(yīng)值的變化98.95%源于所選因素，模型擬合度良好；變異系數(shù)（C.V.）=3.01，說明模型重現(xiàn)性好。一次項A、B的P值小于0.01，達到了極顯著水平，C的P值小于0.05，達到了顯著水平。根據(jù)圖5～圖7結(jié)合回歸模型分析可知，BC交互作用相對明顯。

表3 回歸模擬各項方差分析

圖5 表面活性劑添加量與超聲處理時間的相互影響及等高線圖

圖6 表面活性劑添加量與料液比的相互影響及等高線圖

圖7 料液比與超聲處理時間的相互影響及等高線圖

2.3 驗證試驗

用Design-Expert 11軟件對二次項回歸模型進行預(yù)測得到最優(yōu)提取條件：表面活性劑用量2.333%、料液比1∶20.475（g/mL）、超聲處理時間44.158 min，預(yù)測多糖含量7.247%。為了實際操作時的可行性，修整提取工藝為超聲處理時間40 min、表面活性劑用量2%、料液比1∶20（g/mL），在此條件下進行試驗，3次重復(fù)，取平均值，測得香菇多糖含量為7.26%。該值與預(yù)測值接近，表明此工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

香菇多糖是香菇中的有效活性成分，將香菇多糖開發(fā)成藥物或保健產(chǎn)品逐漸成為一種研究趨勢。通過表面活性劑協(xié)同超聲提取香菇多糖，可以有效提高香菇多糖含量。在前人的試驗基礎(chǔ)上，通過單因素試驗，研究表面活性劑添加量、料液比和超聲處理時間三個因素對香菇中多糖含量的影響。在此基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析方法對表面活性劑協(xié)同超聲法提取香菇多糖的工藝進行優(yōu)化，以期探索更高效的提取香菇多糖的制備工藝。

單因素結(jié)果表明，表面活性劑添加量、料液比、超聲處理時間均不宜過高，超過一定閾值后可能會破壞香菇多糖結(jié)構(gòu)而使得多糖含量降低[20]。不同表面活性劑提取香菇多糖時，聚乙二醇-400提取的香菇多糖含量高于其他表面活性劑，其原因可能是聚乙二醇-400與蛋白分子形成次級鍵，降低蛋白質(zhì)分子間的作用力[21-22]。這與韓偉等[23]研究表面活性劑協(xié)同微波提取白及多糖的工藝中表面活性劑的篩選結(jié)果類似。不同表面活性劑添加量提取多糖時，當添加2%聚乙二醇-400時，其多糖含量值高于其他添加量，其原因可能是當濃度小于2%時，隨著表面活性劑添加量的增大，提取多糖效果增強，從而使細胞組織中多糖的溶出率增加，當濃度大于2%時，黏度過高，多糖得率下降[24-26]。不同料液比提取香菇多糖時，料液比為1∶20（g/mL）時，多糖含量高于其他料液比，其原因可能是料液比中液體占比的增大，加快了目標物質(zhì)的溶出和擴散，料液比中液體占比繼續(xù)增大會使其他成分溶出，抑制多糖溶出[27]。不同超聲處理時間提取香菇多糖時，隨著超聲處理時間的延長，多糖的含量增加，在超聲處理時間為40 min時，多糖含量達到最大，其原因可能是超聲初期，超聲波的“空化效應(yīng)”促進多糖擴散至溶劑中，使得多糖在溶劑中充分溶解，然而隨著超聲處理時間的進一步延長，超聲波的機械振動可能會使提取液中多糖分解，多糖分解成小分子糖，從而使多糖得率降低[28]。

應(yīng)用Design-Expert軟件探究表面活性劑添加量、料液比、超聲處理時間三因素的交互作用，結(jié)果表明，超聲處理時間和料液比交互作用顯著，因此，表面活性協(xié)同超聲提取香菇多糖工藝的最佳提取條件為超聲處理時間40 min、表面活性劑用量2%、料液比1∶20（g/mL），此工藝條件下，多糖含量為7.05%。謝鵬等[29]研究表面活性劑協(xié)同雙頻超聲波輔助提取香菇多糖工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在表面活性劑用量2.5%、超聲頻率（25+40）kHz、超聲處理時間25 min時香菇多糖提取率為14.26%；錢春強等[30]研究了堿提法提取大球蓋菇多糖，最佳工藝條件為提取溫度85 ℃、堿液濃度0.03 mol/L、時間2 h，其多糖得率達到6.98%；馬淑鳳等[31]探求復(fù)合酶法提取白靈菇菌絲體多糖的最佳工藝，復(fù)合酶系組成為纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶、中性蛋白酶，質(zhì)量比為3.0∶2.0∶0.5∶0.5。結(jié)果表明，酶用量2.53%、酶解溫度39.6 ℃、酶解時間3.2 h、pH 7.2時，多糖最高得率可達8.23%。與其相比，研究進行了表面活性劑的篩選，多糖含量的測定方法為3, 5-二硝基水楊酸法，其多糖含量結(jié)果更為準確。相比于堿提取法和復(fù)合酶法，試驗顯著縮短了處理時間，操作簡單易控，不用控制pH，節(jié)能環(huán)保。

4 結(jié)論

最優(yōu)綜合工藝為表面活性劑添加量2%、料液比1∶20（g/mL）、超聲處理時間40 min。各因素的顯著水平為表面活性劑用量＞料液比＞超聲處理時間。在此條件下多糖含量理論值為7.247%，實際值為7.05%。因此采用響應(yīng)面分析法建立模型優(yōu)化得到的制備工藝參數(shù)準確可靠，可用于香菇多糖提取。通過此工藝研究，為香菇多糖的高效提取提供數(shù)據(jù)參考，也為其精深加工提供理論依據(jù)，促進香菇資源得到更多利用。