厭氧氨氧化工藝處理不同抗生素廢水的性能比較

趙培植 ZHAO Pei-zhi；馮丹 FENG Dan；萬家秀 WAN Jia-xiu

（蘭州資源環(huán)境職業(yè)技術(shù)大學(xué)，蘭州 730021）

0 引言

現(xiàn)階段，雖然我國已經(jīng)有效遏制了有機(jī)污染物，但是在部分水體中仍然有水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象存在。導(dǎo)致這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因主要是因?yàn)槲鬯幚韽S處理后的污水沒有滿足相關(guān)的總氮和氨氮標(biāo)準(zhǔn)。我國在處理污水方面，隨著國家不斷提升對(duì)于出水水質(zhì)的要求，傳統(tǒng)污水處理技術(shù)存在的也越來越突出。在這種情況下，厭氧氨氧化工藝應(yīng)運(yùn)而生，得到了廣泛的應(yīng)用。厭氧氨氧化工藝具有低成本、高脫氮效率、少污泥產(chǎn)量、無須曝氣等優(yōu)勢(shì)[1]。在本文中，將以污水中存在較為廣泛的OTC和SMX為研究對(duì)象，分別考察其在各種暴露時(shí)間和濃度下影響厭氧氨氧化胞外聚合物分泌、生物膜活性以及各種微生物生長(zhǎng)情況，與在各種環(huán)境中OTC和SMX所擁有的濃度相結(jié)合，在本次研究中將使用1-1000μg/L的濃度，并且明確這兩種抗生素能夠發(fā)揮的作用，希望能夠?yàn)橄嚓P(guān)人員開展工作提供一定支持。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 實(shí)驗(yàn)方法 選擇兩個(gè)一致的厭氧氨氧化濾柱，隨機(jī)完成1#和2#的標(biāo)注。本次研究使用的是2L體積的濾柱，水是沿著從下向上的方向穿過濾柱，持續(xù)運(yùn)行。在濾柱內(nèi)部只有火山巖填料，填料為7mm左右粒徑，研究中所用的水為人工配置，需要在其中加入堿度、亞氮以及氨氮，加入劑量為前者1000mg/L，后兩者50mg/L，在配制時(shí)分別使用NaHCO3、NaNO2、（NH4）SO4，并且添加MgSO4、KH2PO4、CaCl2，以及微量元素1ml/L，進(jìn)水后約擁有7.8的pH，4h的HRT。在1、10、100、1000μg/L實(shí)驗(yàn)濃度的抗生素中放入兩個(gè)厭氧氨氧化濾柱生物膜分別完成短期（6h）和長(zhǎng)期（22d）暴露，完成對(duì)其EPS、微生物活性的測(cè)量。

1.2 測(cè)量活性 在開展研究時(shí)需要先明確兩個(gè)生物濾柱原有的生物膜活性，從而在后續(xù)研究中將其作為對(duì)比對(duì)象。然后兩個(gè)生物濾柱需要分別長(zhǎng)期和短期暴露于各種濃度的抗生素中，在每次完成暴露后都需要準(zhǔn)確測(cè)量其活性。在本次研究中的流程為：在火山巖填料中取下生物膜10mg左右，將其放在10ml的離心管中，使用人工配水連續(xù)清洗三次，然后再添入適當(dāng)?shù)娜斯づ渌?，保證水位位于10mL處，在恒溫震蕩床上完成離心管放置[2]。設(shè)置25℃的反應(yīng)溫度，6h的反應(yīng)時(shí)間，擁有8.0的pH，取出反應(yīng)始末的水樣分別完成硝氮、亞氮、氨氮的測(cè)定，完成厭氧氨氧化活性計(jì)算。同時(shí)測(cè)定三個(gè)離心管，以平均值為最終結(jié)果。

1.3 測(cè)定溶解性微生物產(chǎn)物和EPS在這個(gè)環(huán)節(jié)中較為重要的內(nèi)容就是EPS提?。菏紫葘?duì)生物膜樣品5ml開展離心處理，處理規(guī)范為時(shí)間15min，每分鐘8000r，進(jìn)行上清液提取，并完成溶解性微生物產(chǎn)物（SMP）保存；在磷酸緩沖溶液中離心沉淀和懸浮，持續(xù)進(jìn)行3min的40kHz超聲處理；準(zhǔn)備80℃的水將混合物放入其中，并連續(xù)完成30min加熱，每加熱10min需要搖勻；對(duì)懸浮液進(jìn)行離心處理，處理規(guī)范同生物膜樣品離心處理，通過上清液完成EPS測(cè)定，剩余物質(zhì)完成污泥質(zhì)量測(cè)定。在500nm波長(zhǎng)處使用Folin-phenol法完成提取液中蛋白質(zhì)（PRO）的測(cè)定，在525nm波長(zhǎng)處使用蒽酮法完成提取液中多糖（PS）的測(cè)定[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 短期和長(zhǎng)期暴露中抗生素影響厭氧氨氧化活性的情況 在不同濃度的兩種抗生素中暴露6h和22d厭氧氨氧化生物膜后得出了如表1所示的結(jié)果。當(dāng)OTC抗生素并未與1#生物膜接觸時(shí)，其擁有14.6mg/（h·g SS）的SAA，而在1μg/L的OTC中完成短期暴露后，測(cè)定其擁有14.5mg/（h·g SS）的SAA，與未暴露的SAA之間只存在較小的差異，證明厭氧氨氧化生物膜在1μg/L的OTC中短期內(nèi)不會(huì)受到較大影響。當(dāng)1#生物膜短期暴露于10、100、1000μg/L的OTC中后，在不斷增加OTC濃度的過程中SAA分別為12.2.12.0和11.6mg/（h·g SS），SAA呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。整個(gè)結(jié)果證明，當(dāng)OTC濃度在10μg/L時(shí)會(huì)在短期內(nèi)嚴(yán)重抑制厭氧氨氧化生物膜（p<0.05），以此為前提在抗生素?fù)碛性絹碓礁邼舛鹊倪^程中，雖然一直都發(fā)揮著抑制作用，但是抑制作用的強(qiáng)度卻使用保持在相同的范圍。由此可知，10μg/L是OTC短期抑制厭氧氨氧化的閾值。1#厭氧氨氧化濾柱在1μg/L的OTC中進(jìn)行22d的長(zhǎng)期暴露后，測(cè)定其擁有14.5mg/（h·g SS）的SAA，與短期暴露相比擁有相同的SAA值，證明在OTC濃度為1μg/L時(shí)，其對(duì)厭氧氨氧化生物膜擁有相同的長(zhǎng)期作用和短期作用，都只會(huì)在較小程度上影響微生物活性。而在長(zhǎng)期暴露于10μg/L的OTC中后，也能夠?qū)捬醢毖趸锬て鸬揭种菩Ч?，測(cè)定其擁有13.3mg/（h·g SS）的SAA。需要注意的是，與短期作用相比，該SAA值更高，可以確定在暴露時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，厭氧氨氧化生物膜適應(yīng)OTC的能力也在不斷提升，導(dǎo)致OTC在生物活性方面所發(fā)揮的作用變得越來越不明顯。而在100μg/L的OTC長(zhǎng)期暴露后中，不僅對(duì)SAA沒有起到抑制效果，而且起到了相反效果使其達(dá)到15.1mg/（h·g SS）[4]。與短期暴露相比存在完全相反的結(jié)果，說明隨著厭氧氨氧化生物膜在OTC中暴露的時(shí)間越來越長(zhǎng)會(huì)不斷增強(qiáng)其適應(yīng)性。然后在1000μg/L的OTC中，長(zhǎng)期暴露后會(huì)在很大程度上降低SAA，最終得到了11.1mg/（h·g SS）的測(cè)定值，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明OTC此時(shí)已經(jīng)發(fā)揮了最大的抑制作用，明確了其長(zhǎng)期抑制閾值為1000μg/L。2#厭氧氨氧化濾柱生物膜在SMX中短期暴露前，擁有14.5mg/（h·g SS）的SAA，而在短期暴露于1μg/L的SMX中后，會(huì)在較小程度上降低SAA，測(cè)定值為14.3mg/（h·g SS），之后在短期暴露于10、100、1000μg/L的SMX中后，將分別降低SAA至13.8、13.7.13.1mg/（h·g SS），在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，雖然在不斷增加SMX濃度時(shí)會(huì)逐漸降低SAA，但是存在不夠顯著的整體降低情況，這證明厭氧氨氧化生物膜對(duì)SMX擁有較強(qiáng)的抵抗性。在長(zhǎng)期暴露于SMX中后，所得的SAA值分別為1μg/L時(shí)為14.8、10μg/L時(shí)為14.3、100μg/L時(shí)為14.1、1000μg/L時(shí)為13.6，單位為mg/（h·g SS）。當(dāng)SMX濃度為1μg/L時(shí)會(huì)輕微增加SAA，因?yàn)槎唐谝种谱饔貌⒉幻黠@，所以沒有從抑制轉(zhuǎn)變?yōu)檫m應(yīng)的過程。相關(guān)的研究結(jié)果證明，當(dāng)有機(jī)物的濃度較低時(shí)對(duì)高效穩(wěn)定地運(yùn)行厭氧氨氧化有利。所以，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是厭氧氨氧化生物膜擁有較高的SMX抗性，另一方面由于SMX對(duì)反硝化起到了誘導(dǎo)作用使脫氮性能得到了提升。在SMX濃度不斷提升的過程中，在長(zhǎng)期暴露后厭氧氨氧化生物膜均存在輕微降低的表現(xiàn)，在不同濃度下與短期暴露相比擁有相近的SAA降低程度。這個(gè)結(jié)果證明在長(zhǎng)期作用和短期作用下，在SMX的實(shí)驗(yàn)濃度中只會(huì)在較小程度上影響厭氧氨氧化，其抑制作用并不明顯[5]。

表1 短期和長(zhǎng)期暴露中抗生素影響厭氧氨氧化活性的情況 （mg/（h·g SS））

2.2 抗生素影響胞外聚合物的情況EPS與微生物細(xì)胞擁有非常相似的主要成分，其主要分為兩大類，分別為PS和PRO，其能夠在細(xì)胞完成營養(yǎng)吸收的過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)能夠使細(xì)胞在一定程度上免受有毒物質(zhì)和殺菌劑的危害。

如表2所示，在1μg/L的OTC中長(zhǎng)期暴露1#反應(yīng)器的生物膜后，擁有較慢的微生物響應(yīng)速度，只會(huì)有較少的EPS分泌，并且會(huì)顯著降低多糖和蛋白質(zhì)，證明在這種環(huán)境下微生物能夠正常生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)情況較為穩(wěn)定。而在使用10μg/L的OTC時(shí)，會(huì)在很大程度上增加EPS，特別是在蛋白質(zhì)方面，會(huì)完成從32.6至85.49mg/g SS的迅速提升，證明微生物受到了毒性抑制。當(dāng)處于擁有抗生素的環(huán)境中，正常情況下微生物的EPS分泌量會(huì)增大。之后隨著OTC濃度越來越高，將會(huì)再次顯著增加EPS的量，證明借助大量EPS的分泌微生物對(duì)OTC逐漸適應(yīng)，也在漸漸地恢復(fù)活性。當(dāng)使用1000μg/L的OTC時(shí)，將會(huì)嚴(yán)重抑制微生物，導(dǎo)致微生物大量死亡，也會(huì)逐漸降低其分泌的EPS。但是需要注意的是，在不斷增加OTC濃度的過程中，也會(huì)不斷提升SMP的含量，證明生物膜中進(jìn)入了一些死亡微生物的產(chǎn)物，使微生物擁有反硝化的條件，反而能夠使微生物擁有更高的活性。另外，也會(huì)逐漸降低PS/PRO的值，證明隨著分泌越來越多的PS，是微生物針對(duì)毒性的應(yīng)對(duì)措施。

表2 抗生素影響胞外聚合物的情況 （mg/g SS）

微生物在2#反應(yīng)器中快速反應(yīng)，在SMX為1μg/L時(shí)EPS輕微增加，隨著SMX擁有越來越高的濃度能夠非?？焖俚卦黾覧PS，這證明SMX能夠得到厭氧氨氧化生物膜的快速反應(yīng)，即使SMX的濃度較低也能夠?qū)PS產(chǎn)生刺激，使EPS分泌量增加，能夠使有毒物質(zhì)對(duì)微生物的抑制情況得到降低[6]。所以在作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的情況下，SMX對(duì)SAA的影響顯著程度不足。但是需要注意的是，在持續(xù)降低SMP中PRO/PS值的過程中，這可能是厭氧氨氧化均對(duì)于SMX的一種應(yīng)對(duì)措施，通過提升溶解性多糖分泌，來為細(xì)胞提供保護(hù)，與OTC相比擁有相同結(jié)果。相關(guān)學(xué)者在研究過程中將1mg/L濃度的SMX放入兩個(gè)反應(yīng)器中，在存在EPS保護(hù)的基礎(chǔ)上，在145h后微生物的OUR值降到了95mg/（L·H）；而當(dāng)EPS保護(hù)不存在時(shí)，微生物降低到10mg/（L·H）以下的OUR值。這一研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)，當(dāng)微生物與SMX接觸后能夠完成EPS的快速分泌，能夠?qū)Χ拘砸种破鸬降挚棺饔谩?/p>

2.3 脫氮功能微生物的豐度變化 通過有效對(duì)比Silva數(shù)據(jù)庫，得到存在水平差異的微生物分類。在門分類水平方面，在不同階段兩個(gè)濾柱的所有生物膜中Proteobacteria都擁有最大的相對(duì)豐度，1#濾柱和2#濾柱在0μg/L時(shí)分別為57.8%和31.5%，在1μg/L時(shí)分別為28.5%和52.3%，在10μg/L時(shí)分別為41.3%和55.9%，在100μg/L時(shí)分別為31.6%和51.4%，在1000μg/L時(shí)分別為41.1%和51.1%。雖然在剛接觸OTC時(shí)1#生物膜大幅度減少了29.3%的Proteobacteria豐度，但是隨后豐度漸漸提升，并且始終處于較高的水平。而在與SMX接觸后，2#生物膜不但沒有降低Proteobacteria豐度，反而提升情況較為明顯，并且能夠在濃度不同的情況下處于穩(wěn)定狀態(tài)，這種情況證明了在與SMX接觸后2#生物膜的穩(wěn)定性。其次，擁有較高相對(duì)豐度的門為Planctomycetes，1#濾柱和2#濾柱在0μg/L時(shí)分別為19.0%和15.0%，在1μg/L時(shí)分別為25.7%和23.5%，在10μg/L時(shí)分別為12.3%和17.2%，在100μg/L時(shí)分別為41.5%和16.4%，在1000μg/L時(shí)分別為20.7%和12.6%。與相關(guān)的研究相結(jié)合可知，在自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中廣泛存在這兩個(gè)門的微生物。生物膜在與SMX接觸后，在增加Proteobacteria的過程中可能會(huì)使其抗生素耐藥性不斷提升。在抵抗抗生素的機(jī)理方面主要是誘導(dǎo)失活的酶或者可以編碼的抗生素改性以及對(duì)細(xì)菌細(xì)胞中抗生素靶點(diǎn)的突變進(jìn)行誘導(dǎo)等。由于在OTC中厭氧氨氧化能夠?qū)崿F(xiàn)自我適應(yīng)，所以泵出機(jī)制可能是厭氧氨氧化能夠抵抗OTC作用的主要原因，而降解作用是抵抗SMX的主要原因。

通過分析屬水平的微生物分類結(jié)果可知，在種類不同濃度不同的抗生素中長(zhǎng)期暴露后，會(huì)在很大程度上改變厭氧氨氧化微生物生物膜的組成。在厭氧氨氧化中AAOB屬于功能微生物，在1#生物膜中AAOB功能菌中的Candidatus Kuenenia屬于優(yōu)勢(shì)微生物，在OTC濃度不同時(shí)期相對(duì)豐度的變化幅度較大，在與OTC剛接觸時(shí)AAOB擁有刺激強(qiáng)化作用，AAOB相對(duì)豐度實(shí)現(xiàn)了從16.4%到23.4%的提升，當(dāng)OTC到達(dá)10μg/L的濃度時(shí)抑制作用再次出現(xiàn)，當(dāng)OTC到達(dá)100μg/L的濃度時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)，在OTC到達(dá)1000μg/L的濃度抑制作用再次出現(xiàn)。而當(dāng)生物膜暴露在濃度不同的SMX中時(shí)，分別擁有13.85%、20.19%、14.31%、14.15%和9.43%的相對(duì)豐度，出現(xiàn)先提升后降低的情況，這證明在抗生素中AAOB均存在先增強(qiáng)后抑制的情況。在這個(gè)過程中需要注意的是，在與抗生素接觸后，都有反硝化菌Denitritisoma在兩個(gè)反應(yīng)器中被誘導(dǎo)出來，并且在變化趨勢(shì)方面存在差異。1#濾柱中，反硝化菌只受到OTC較慢的誘導(dǎo)，只有在達(dá)到1000μg/L的OTC濃度時(shí)其增殖情況才變得非常明顯，在很大程度上提升了相對(duì)豐度，而在此時(shí)已經(jīng)開始抑制AAOB，之所以會(huì)增加反硝化菌Denitritisoma可能是因?yàn)樵诜纸馕⑸锼劳鰵報(bào)w的過程中有有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生，從而對(duì)發(fā)生硝化反應(yīng)起到了促進(jìn)作用。與之相反，在SMX借助2#生物膜后反硝化菌立刻被誘導(dǎo)出，在不同階段反硝化菌Denitritisoma分別擁有0.01%、3.31%、15.02%、10.52%和14.03的相對(duì)豐度，相對(duì)來說擁有較高的比例。反硝化菌能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)SMX的充分降解并且能夠?qū)λ劳鑫⑸餁報(bào)w進(jìn)行利用，能夠使厭氧氨氧化生物膜在一定程度上免受SMX的毒性，所以2#濾柱始終為較輕的抑制水平。

3 結(jié)論

①在1000μg/L的SMX和OTC中厭氧氨氧化生物膜6h和22d暴露結(jié)果表明，厭氧氨氧化活性會(huì)在較大程度上受到OTC的影響，且對(duì)于100μg/L以下濃度的OTC厭氧氨氧化菌擁有一定的適應(yīng)性，而厭氧氨氧化在SMX的短期和長(zhǎng)期暴露中均不會(huì)受到顯著影響。

②與OTC相比，SMX能夠得到厭氧氨氧化生物膜更快的響應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)EPS分泌量快速增加。在分泌大量的EPS后能夠?yàn)閰捬醢毖趸峁┍Ｗo(hù)，使SMX的毒性抑制得到降低。

③在脫氮功能微生物的豐度變化方面，在加入SMX后會(huì)大量增殖反硝化菌，其與厭氧氨氧化菌的脫氮會(huì)共同完成并使SMX降解，所以SMX只會(huì)在較小程度上影響生物膜脫氮性。另外，在抗生素響應(yīng)方面AAOB相對(duì)豐度會(huì)存在先增強(qiáng)后被抑制的情況。

所以，厭氧氨氧化能夠?qū)碛形⒘縎MX的廢水進(jìn)行有效處理，在開展含OTC廢水的處理工作時(shí)，需要與長(zhǎng)期馴化相配合。