慢性感染階段弓形蟲包囊在小鼠腦組織的動態(tài)病理變化

吳夢云，蔡 茹，李伊凡， 汪學(xué)龍，姚 湧

弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，1909年由法國學(xué)者發(fā)現(xiàn)[1]。弓形蟲全球分布，幾乎可以在所有哺乳動物細(xì)胞中入侵并復(fù)制[2]。據(jù)估計，全球三分之一的人口被弓形蟲感染，且大多數(shù)人都處于慢性感染階段[3]。弓形蟲以“特洛伊木馬”的模式通過血腦屏障定植于大腦[4]，在慢性感染階段，弓形蟲在神經(jīng)元內(nèi)以包囊形式存在，形成免疫豁免[5]。寄生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的弓形蟲通過基因調(diào)控宿主的神經(jīng)免疫[6]，分泌效應(yīng)因子和改變宿主神經(jīng)信號通路[7]的途徑導(dǎo)致宿主腦部神經(jīng)生理變化，影響宿主的精神和行為，但卻可促進(jìn)自身的生命周期[8]。此前的研究[9]表明，弓形蟲對大腦特定區(qū)域具有明顯的趨向性，隨著時間的推移，包囊在宿主腦組織內(nèi)的定位分布影響著宿主的精神和行為。該研究旨在動態(tài)觀察弓形蟲對宿主精神與行為的操縱與腦內(nèi)包囊分布的關(guān)系，以及慢性感染階段宿主精神行為變化的內(nèi)在原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和弓形蟲蟲株50只6～8周齡昆明種雌性小鼠，20～25 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，5只/籠，正常采食飲水。弓形蟲Prugniaud株(PRU株)由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在昆明種鼠體內(nèi)保種，傳代。

1.2 小鼠腦組織包囊的獲取在無菌條件下，頸椎脫臼處死PRU毒株弓形蟲保種小鼠，取腦組織，加生理鹽水充分研磨過濾制成含弓形蟲包囊的組織勻漿，置于5 ml EP管中保存。計數(shù)包囊后保種。

1.3 PRU株慢性感染小鼠模型的建立用含有包囊的組織勻漿制備灌胃液，調(diào)制包囊濃度為175個/ml， 經(jīng)口感染50只實(shí)驗(yàn)小鼠，每只小鼠灌胃35個包囊。

1.4 感染小鼠模型病情程度的動態(tài)記錄分別在小鼠感染的第10、30、40、90、120、160天觀察并記錄感染小鼠的病情變化，出現(xiàn)以下任一項(xiàng)記為1分：豎毛，弓背，活動低下，原地打轉(zhuǎn)，消化系統(tǒng)影響(腹脹和腹瀉)，呼吸系統(tǒng)影響(呼吸淺快)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響(偏癱)。

1.5 心臟灌流取感染小鼠腦組織分別在感染的第10、30、40、90、120、160天各取4只小鼠，用0.25 ml水合氯醛(80 mg/kg)注射麻醉小鼠，將生理鹽水注射器插入左心室，先灌注生理鹽水，右心耳流出的液體澄清時，立即換用4%多聚甲醛灌注20 min。待小鼠身體僵硬，內(nèi)臟變白，將頭蓋骨剝開，將腦下部連接的神經(jīng)剪斷，剝離完整腦組織放入有4%多聚甲醛溶液的EP管，浸沒腦組織，做標(biāo)記，放入4 ℃冰箱過夜固定。取出完整大腦組織，對照小鼠解剖圖譜分離出海馬下丘腦、前額葉、紋狀體和小腦組織各4份，每份約40 mg，2份切片后用于HE染色，2份制備成2 ml組織勻漿，置于5 ml EP管中，用BX3正置顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)計數(shù)包囊數(shù)量，記錄包囊直徑。

1.6 HE染色將小鼠各區(qū)域腦組織脫水后包埋，制片，切片厚度為20～40 μm。 將切片置于二甲苯中脫蠟；放入無水乙醇中；蘇木精染色10 min，用1%的鹽酸乙醇分化，加入弱堿性的促藍(lán)液；伊紅染色3 min，再進(jìn)行梯度脫水；將脫水后的組織樣本切片用二甲苯浸泡2次，每次持續(xù)4 min，然后封片，使用全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲PRU株慢性感染小鼠模型病情程度的動態(tài)變化弓形蟲PRU株感染小鼠從第10天開始出現(xiàn)感染癥狀，以豎毛、弓背和活動低下為主，少數(shù)小鼠無癥狀；在感染的第30～40天，小鼠出現(xiàn)大量死亡，病情評分達(dá)到峰值，存活的感染小鼠幾乎均出現(xiàn)豎毛弓背，活動低下，食欲不振，腹脹腹瀉，呼吸淺快，少數(shù)小鼠出現(xiàn)原地打轉(zhuǎn)和偏癱的癥狀；之后大部分感染小鼠病情逐漸好轉(zhuǎn)，到第90天，小鼠死亡有所減少，遺留癥狀以活力低下，弓背，毛發(fā)缺乏光澤，原地打轉(zhuǎn)和偏癱為主；在感染第120～160天，小鼠毛發(fā)恢復(fù)光澤，部分小鼠恢復(fù)正常生理狀態(tài)，遺留癥狀大部分為偏癱和原地打轉(zhuǎn)，見表1。

表1 感染小鼠病情程度變化

2.2 計數(shù)包囊個數(shù)在大腦各區(qū)域的動態(tài)分布感染鼠腦部的弓形蟲包囊在各時間節(jié)點(diǎn)以海馬下丘腦分布最多，前額葉和紋狀體次之，小腦最少。隨著弓形蟲感染時間遞增，在小鼠腦部各區(qū)域的弓形蟲包囊數(shù)量在30 d達(dá)頂峰，隨后包囊數(shù)量呈下降趨勢，在第90天時，包囊數(shù)量不再下降，重新開始上升，在第120天腦部各個區(qū)域的弓形蟲包囊量達(dá)到次級峰，之后數(shù)量又逐步下降。經(jīng)檢驗(yàn)，在弓形蟲感染的10～160天間，腦部各區(qū)域的包囊數(shù)量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.010，P<0.05)；在弓形蟲感染的各時間節(jié)點(diǎn)感染小鼠腦部各部位的弓形蟲數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.742，P<0.05)，見圖1。

圖1 腦部各區(qū)域弓形蟲包囊數(shù)量變化

2.3 小鼠腦部各區(qū)域弓形蟲包囊直徑的動態(tài)變化弓形蟲慢性感染期間，弓形蟲包囊在小鼠腦部各區(qū)域的直徑均隨著感染時間的增加而呈現(xiàn)增長趨勢，在感染小鼠海馬下丘腦、前額葉、紋狀體、小腦中弓形蟲包囊平均直徑與感染天數(shù)之間均存在相關(guān)性(R2=0.899，P<0.05；R2=0.907，P<0.05；R2=0.895，P<0.05；R2=0.888，P<0.05)；組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.965，P<0.05；t=6.243，P<0.05；t=5.833，P<0.05；t=5.637，P<0.05)，其中小鼠腦部海馬下丘腦、前額葉、紋狀體和小腦的包囊平均直徑與感染天數(shù)的相關(guān)回歸系數(shù)分別為：0.055、0.067、0.064、0.013，見圖2。

2.4 小鼠弓形蟲慢性感染腦部特異性病理動態(tài)表現(xiàn)觀察小鼠腦部各部位的HE染色切片發(fā)現(xiàn)，在感染的第40天，小鼠海馬下丘腦的弓形蟲腦炎的神經(jīng)病理變化最為顯著，腦部炎癥情況也最為嚴(yán)重，可觀察到弓形蟲包囊附近小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬死亡的神經(jīng)元即噬神經(jīng)現(xiàn)象(圖3A)；弓形蟲包囊附近炎癥細(xì)胞浸潤在血管附近形成“血管袖套現(xiàn)象”(圖3B)；弓形蟲包囊激發(fā)的炎癥反應(yīng)致使其周圍的血管發(fā)生擴(kuò)張，血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖3C)；蛛網(wǎng)膜附近弓形蟲包囊導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下隙大范圍出血，蛛網(wǎng)膜周圍浸潤的炎癥細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主(圖3D)；弓形蟲包囊在腦組織中的“衛(wèi)星樣分布”(圖3E)；弓形蟲包囊附近神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的局限性增生(圖3F)。

圖2 腦部各區(qū)域弓形蟲包囊平均直徑變化

圖3 感染小鼠第40天腦部海馬下丘腦弓形蟲感染病理征 HE×200

圖4 慢性感染小鼠腦部特異性炎癥病理動態(tài)變化

在感染小鼠的海馬下丘腦、前額葉、紋狀體和小腦區(qū)域，弓形蟲包囊的衛(wèi)星樣分布、血管袖套現(xiàn)象、弓形蟲包囊噬神經(jīng)現(xiàn)象、弓形蟲包囊附近血管的擴(kuò)張和膠質(zhì)細(xì)胞浸潤現(xiàn)象的動態(tài)變化見圖4。 第10～30天，切片中開始觀察到程度較輕的腦炎癥狀且呈上升趨勢，病理表現(xiàn)以少數(shù)的膠質(zhì)細(xì)胞局限性浸潤形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)為主，蛛網(wǎng)膜下隙出現(xiàn)的出血及炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象由少量上升為中等量。至感染第40天，弓形蟲腦炎病理變化最為顯著，以包囊附近的血管擴(kuò)張和血管袖套現(xiàn)象為主，膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)大面積浸潤及大量膠質(zhì)結(jié)節(jié)的生成；蛛網(wǎng)膜下隙出現(xiàn)連續(xù)大片出血現(xiàn)象，較多量炎癥細(xì)胞浸潤。在感染第40～90天，腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)的數(shù)量大量下降；蛛網(wǎng)膜下隙出血逐步好轉(zhuǎn)為局限連續(xù)小面積出血及少量炎癥細(xì)胞浸潤。在感染第90～120天，以包囊附近的血管擴(kuò)張現(xiàn)象逐漸增加為主，膠質(zhì)細(xì)胞由極少數(shù)局限浸潤到少量浸潤；在第120天，弓形蟲包囊衛(wèi)星樣分布的數(shù)量增加到頂峰；蛛網(wǎng)膜下隙出血由局限連續(xù)的小面積出血及少量炎癥細(xì)胞浸潤，至少量連續(xù)出血及中等量炎癥細(xì)胞浸潤，至感染的第160天，感染小鼠腦部炎癥病理表現(xiàn)逐漸恢復(fù)，僅見少量局限性膠質(zhì)細(xì)胞浸潤；蛛網(wǎng)膜下隙幾乎不見出血，病理切片見包囊附近的蛛網(wǎng)膜下隙少量炎癥細(xì)胞浸潤。

3 討論

弓形蟲速殖子侵入腦組織神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[10]形成包囊。越來越多的證據(jù)表明，弓形蟲病的慢性感染可能會影響宿主行為且具有誘發(fā)宿主神經(jīng)精神疾病的可能[11]。弓形蟲的慢性潛伏的感染可能也與精神疾病的臨床陽性癥狀的加重有關(guān)[12-13]。Hermes et al[14]研究發(fā)現(xiàn)，在嚙齒類動物中，弓形蟲包囊會在大腦中出現(xiàn)選擇性定位，從而對宿主的行為產(chǎn)生影響，但是對于包囊中的緩殖子通過何種機(jī)制影響宿主行為，仍有待探究。以往的研究因?yàn)楣蜗x株、動物宿主的不同以及觀測天數(shù)的局限，少有對宿主腦部包囊定位性分布與癥狀關(guān)聯(lián)性的動態(tài)研究。

本研究動態(tài)觀察弓形蟲慢性感染期間小鼠的病情變化與神經(jīng)病理學(xué)變化，為了更好地監(jiān)測小鼠腦部的包囊變化對于小鼠行為精神學(xué)的影響，選用成囊率較高的弓形蟲PRU株以及對弓形蟲敏感的昆明種鼠，制造弓形蟲慢性感染的動物模型。為了使弓形蟲在小鼠腦部成囊率升高，每只小鼠灌胃35個包囊，高于常規(guī)用量，這與40 d時小鼠大量死亡有關(guān)。本研究顯示，在感染的第120天，弓形蟲包囊在小鼠腦部各個部位均出現(xiàn)了次級峰，這與第87天發(fā)現(xiàn)的小鼠啃食死亡小鼠引發(fā)二次感染有關(guān)。隨著感染天數(shù)的增加，在小鼠小腦部位的包囊生長速度最快，但炎癥程度最低，這一現(xiàn)象提示小鼠小腦部位對弓形蟲的免疫應(yīng)答低于其他部位。本研究揭示了弓形蟲慢性感染期間的病理變化與臨床表現(xiàn)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，為弓形蟲包囊的定位分布對宿主精神疾病和行為影響的研究奠定了基礎(chǔ)。