骨痛靈方通過(guò)抑制整合素αvβ3 通路緩解肺癌骨轉(zhuǎn)移癌性疼痛*

孟喚男 郭曉冬△ 周小翠△ 陳 舲 王立玉 呂 英 徐振曄

（1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，上海 200437；2 上海市黃浦區(qū)打浦橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200020；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032）

肺癌是最常見(jiàn)和最致命的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌所占比例近85%，并且經(jīng)常擴(kuò)散到骨骼(30%～40%)，遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移已成為肺癌終末期病人死亡的主要原因[1]。肺癌骨轉(zhuǎn)移病人長(zhǎng)期遭受著骨癌痛折磨，生活質(zhì)量和生存期顯著降低[2]。目前針對(duì)肺癌骨轉(zhuǎn)移治療方案，最新《肺癌骨轉(zhuǎn)移診療專家共識(shí)》推薦[3]首選骨改良藥物第三代雙磷酸藥物唑來(lái)膦酸為基礎(chǔ)用藥，通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)其凋亡，有效抑制破骨細(xì)胞的骨吸收等機(jī)制治療骨轉(zhuǎn)移、控制疼痛[4]。但長(zhǎng)期使用唑來(lái)膦酸易產(chǎn)生發(fā)熱等流感樣癥狀、疲勞、腹瀉、便秘等不良反應(yīng)，使癌痛治療被迫終止，影響鎮(zhèn)痛效果。骨轉(zhuǎn)移癌痛是目前腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)問(wèn)題，因此尋求更加有效的鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。

惡性腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移疼痛主要機(jī)制為“腫瘤細(xì)胞-破骨細(xì)胞-腫瘤微環(huán)境”變化誘發(fā)癌痛：腫瘤細(xì)胞在骨骼著床，引起破骨細(xì)胞大量增殖，骨吸收活性增強(qiáng)，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞，同時(shí)引起骨髓微環(huán)境呈酸性，H+激活初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元上的酸敏感性離子通道，從而引起痛覺(jué)過(guò)敏[5,6]。近年來(lái)的研究顯示，在破骨細(xì)胞表面呈現(xiàn)高表達(dá)αvβ3 整合素，可以介導(dǎo)由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的微絲結(jié)構(gòu)通過(guò)聚合作用形成偽足小體，緊密附著于骨表面，并在附著區(qū)形成封閉腔，破骨細(xì)胞在該腔內(nèi)釋放氫離子和各種酶類進(jìn)行骨質(zhì)溶解[7]。破骨細(xì)胞的黏附和偽足小體形成是破骨細(xì)胞進(jìn)行骨溶解的前提和關(guān)鍵。在此過(guò)程中，αvβ3 整合素的連接和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用以及足突小體的形成起著關(guān)鍵性的作用。而且研究表明，使用αvβ3 整合素抑制劑可以抑制破骨細(xì)胞的活躍[7]。

骨痛靈方以中醫(yī)補(bǔ)腎堅(jiān)骨為理論指導(dǎo)，以補(bǔ)腎養(yǎng)精，破瘀通絡(luò)為治療原則，是我科根據(jù)上海市名中醫(yī)腫瘤專家徐振曄教授治療肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛的經(jīng)驗(yàn)制訂的協(xié)定方。在我們前期的臨床對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，骨痛靈聯(lián)合唑來(lái)膦酸治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移疼痛的療效確切[8,9]。此外，課題組還發(fā)現(xiàn)骨痛靈方可通過(guò)抑制RANKL/RANK/OPG 通路對(duì)破骨細(xì)胞生成的干預(yù)作用，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛療效[10]。破骨細(xì)胞骨吸收直接反映了骨溶解的狀態(tài)，骨溶解所帶來(lái)的炎性反應(yīng)和神經(jīng)損傷，是造成骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)鍵。目前骨痛靈方對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收機(jī)制尚不清楚。本研究為進(jìn)一步分析骨痛靈治療肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛的具體機(jī)制，擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用Lewis 肺癌細(xì)胞建立C57BL/6 小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，用骨痛靈方進(jìn)行治療，以破骨細(xì)胞的骨吸收關(guān)鍵分子αvβ3整合素作為切入點(diǎn)，為其更廣泛的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

方 法

1.動(dòng)物及細(xì)胞株

C57BL/6 雄性小鼠，周齡4～6 周，50 只，重量 (20±2) g，Specific pathogen-free (SPF) 級(jí)，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0003 。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2018-0040。飼養(yǎng)條件：SPF 級(jí)屏障環(huán)境中，每日10 h 人工照明，室內(nèi)溫度為25℃，濕度為70%。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(YYLAC-2019-002)。

熒光素酶標(biāo)記小鼠肺癌Lewis 細(xì)胞系 (2LL-LUC)，批號(hào)為GF401，購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)方法：2LL-LUC 細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

2. 藥物制備

骨痛靈方由淫羊藿(8030721097) 15 g，骨碎補(bǔ)(8010861097) 15 g，煅自然銅(8090321157) 9 g，炙蜈蚣(8080981017) 2 g，制川烏（8010671037）9 g，制草烏(8010681037) 9 g 組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，按照國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3 號(hào)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》要求煎煮中藥，保證中藥煎藥質(zhì)量。稱取3 劑中藥處方量加入10 倍冷水浸泡30 min，武火煮開(kāi)后5 min，改文火煎45 min，冷卻，紗布過(guò)濾；將藥渣再次加入5 倍水量，重復(fù)第1 次煎煮方法；取2 次濾液混勻后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至148 ml，配成含生藥1.2 g/ml 的中藥液，4℃?zhèn)溆?。注射用唑?lái)膦酸鈉（規(guī)格4 mg，H20041953）溶于0.9% NaCl 溶液中，配置濃度為0.01 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 主要試劑及儀器

αvβ3 抗體（MAB1976，1:1000，美國(guó)Sigma-Al drich 公司）；PyK2 抗體（sc-1514，1:600，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司）；Scr 抗體(ab230914，1:100)，Cbl 抗體（ab32446，1:200，美國(guó)Abcam 公司）；TRIzol RNA 分離試劑（批號(hào)T9424，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R232-01，南京諾唯贊生物科技有限公司）；RT-PCR 試劑盒（11203ES03，上海翊圣生物科技有限公司）；Actin-Tracker Green-488 試劑盒(C2201S)，DAPI 染色液(C1006)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型DAB 顯色試劑盒(DA1016)，Harris 蘇木素染色液(G1150)，北京索萊寶科技有限公司；D-熒光素鉀鹽（40902ES03，上海翊圣生物科技有限公司）。

CellXpert C170i 細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國(guó)Eppendorf公司；TCS SP8 共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica 公司；QuantStudio 3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；vonFrey 纖維絲測(cè)痛儀，美國(guó)Stoelting公司；IVISLuminaL T Series III 小動(dòng)物活體成像儀，美國(guó)PerkinElmer 公司；Pannoramic 250 全景切片掃描儀，CaseViewer 2.4 掃描瀏覽軟件，匈牙利3DHIESTECH 公司。

4. 分組及造模

50 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Model組）、骨痛靈組（GTL組）、唑來(lái)膦酸組（ZA 組）、骨痛靈+唑來(lái)膦酸組（GTL +ZA 組），每組10 只。除Sham 組給予接種PBS 溶液外，其余各組均予鼠源肺腺癌細(xì)胞2LL-LUC 懸液造模。參照肺癌骨轉(zhuǎn)移模型建立方法造模[11]：鼠源肺腺癌細(xì)胞2LL-LUC 進(jìn)行大量擴(kuò)增培養(yǎng)，收集細(xì)胞懸液，37℃，1000 rpm 離心5 min（離心半徑為12.8 cm），重懸，PBS 多次清洗，最后稀釋至細(xì)胞密度為2×108個(gè)/ml；小鼠吸入異氟烷麻醉后，用1 ml 注射器針頭經(jīng)小鼠左后肢脛骨平臺(tái)刺入脛骨骨髓腔，然后換用吸有腫瘤細(xì)胞的25 μl 微量進(jìn)樣器（注入前，微量進(jìn)樣器內(nèi)依次吸入1 μl 明膠海綿水溶液，1 μl 空氣和10 μl 腫瘤細(xì)胞懸液），注射完稍留針后緩慢拔出。Sham 組給予等量的PBS 溶液代替造模。1 周后小鼠腹腔注射D 熒光素鉀鹽溶液(150 mg/kg)，15 min 后行小動(dòng)物熒光活體成像，可觀察到肺癌骨轉(zhuǎn)移模型鼠內(nèi)有熒光顯像（見(jiàn)圖1），即可判斷為造模成功。

圖1 小鼠熒光活體成像圖(A) Sham 組；(B) Model 組Fig. 1 Fluorescence in vivo imaging of mice(A) The Sham operation group; (B) The Model group.

5. 給藥方法

造模后第2 日各組開(kāi)始給藥干預(yù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算[12]，小鼠用藥劑量為成人用藥劑量的12.33 倍，即為臨床等效劑量。GTL 組給予骨痛靈12 g/(kg·d)灌胃，每日1 次，共21 天；ZA 組給予唑來(lái)膦酸50 μg/(kg·d) 腹腔注射，每3 日1 次，共7 次；GTL + ZA 組給予骨痛靈灌胃和唑來(lái)膦酸腹腔注射，劑量和次數(shù)同上；Model 組和Sham 組給予同體積的生理鹽水灌胃或腹腔注射。

6. 觀察指標(biāo)與方法

給藥結(jié)束后第2 天，使用頸椎脫臼法將小鼠處死，立即分組迅速取出左后肢脛骨骨組織標(biāo)本，每組隨機(jī)選取6 只骨組織標(biāo)本放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫黄溆? 只骨組織標(biāo)本，清洗后放入4%多聚甲醛溶液固定。

（1）vonFrey 纖維絲測(cè)痛儀評(píng)價(jià)小鼠足底機(jī)械痛閾值

將小鼠置于具有鐵絲網(wǎng)格的特殊架上，取5 cm×8 cm×11 cm 的無(wú)底透明玻璃盒將小鼠罩住，在室溫安靜的環(huán)境下適應(yīng)30 min 后，采用不同規(guī)格的vonFrey 細(xì)絲 (0.16 g, 0.4 g, 0.6 g, 1 g, 1.4 g, 2 g)按照從輕到重的順序用相同力度垂直方向刺激小鼠左后肢腳掌中部皮膚，每根需刺激5 次，刺激停留時(shí)間為1～2 s，同一細(xì)絲2 次不同刺激間隔5 s，不同纖維絲刺激間隔5 min，觀察小鼠縮足反應(yīng)。小鼠機(jī)械痛閾值計(jì)分規(guī)則：若5 次刺激有3 次以上（含3 次）小鼠有縮足動(dòng)作，該規(guī)格的vonFrey 細(xì)絲為疼痛閾值，若刺激至最大規(guī)格2 g 仍無(wú)縮足反應(yīng)，則2 g 記為小鼠機(jī)械痛閾值。分別于造模前1 天，造模后第7 天、14 天、21 天進(jìn)行檢測(cè)。

（2）激光共聚焦觀察破骨細(xì)胞偽足小體F-actin環(huán)形態(tài)

取石蠟固定的各組小鼠左后肢脛骨骨組織連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，微波抗原修復(fù)后用10%山羊血清室溫封閉孵育2 h；棄去血清，PBS 清洗3 次后加入Actin-Tracker Green-488 (5 μg/ml) 染色1 h；洗滌2 次后，加入DAPI (5 mg/ml)進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫避光孵育10 min；洗滌后用50%甘油封片，打開(kāi)共聚焦顯微鏡，設(shè)置波長(zhǎng)參數(shù)，觀察熒光圖像及時(shí)拍照并將圖像存儲(chǔ)后進(jìn)行分析。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用NCBI 網(wǎng)站及在Primer Bank 軟件獲取目的基因引物，由上海生物工程有限公司合成。本研究中用于檢測(cè)目的基因mRNA 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見(jiàn)表1 所示。采用Trizol 法提取各組小鼠左后肢脛骨骨組織總RNA，并及時(shí)反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的cDNA；設(shè)置qPCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性—95℃ 5 min；變性—95℃ 10 s；退火延伸—60℃ 30 s；擴(kuò)增—40個(gè)循環(huán)；將GAPDH 設(shè)置為對(duì)照內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析使用2-ΔΔCt法，統(tǒng)計(jì)分析目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qPCR 引物序列Table 1 qPCR primer sequences

（4）免疫組化法檢測(cè)骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cbl 蛋白表達(dá)

將各組小鼠左后肢脛骨骨組織石蠟切片脫蠟至水后置于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，待切片在室溫下冷卻后，PBS 清洗3 次（每次5 min）后，加入阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶溶液常溫避光孵育25 min，PBS 清洗3 次（每次5 min）；向切片加入3% BSA PBS 溶液，室溫封閉30 min；棄封閉液后，加入適當(dāng)比例的一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。次日，回收一抗后，加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育50 min；棄二抗后加入DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來(lái)水終止顯色；用Harris 蘇木素復(fù)染細(xì)胞核3 min 左右，自來(lái)水洗，氨水返藍(lán)，脫水封片，倒置顯微鏡下觀察，Pannoramic 250 全景切片掃描儀圖像采集，并用V1.8.0.112 版Image J 軟件半定量分析蛋白（棕色點(diǎn)）累計(jì)光密度 (integrated optical density, IOD)。

7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 7 軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 各組小鼠機(jī)械痛閾值比較

四組造模小鼠于第10天左右出現(xiàn)自發(fā)痛行為，表現(xiàn)為左后肢跛行、舔足、自發(fā)抬足時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)輕微觸誘發(fā)痛。各組小鼠左后肢足底的機(jī)械痛閾值比較發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖2），Sham 組小鼠機(jī)械痛閾值走勢(shì)平穩(wěn)，波動(dòng)不明顯；其余4 組從第7 日開(kāi)始均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，Model 組波動(dòng)尤為明顯。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與Sham 組比較，Model 組小鼠造模后機(jī)械痛閾值下降(P< 0.05)。造模后第14、21 天：與Model 組比較，各給藥干預(yù)組機(jī)械痛閾值升高(P< 0.05)；ZA 組與GTL 組機(jī)械痛閾值相當(dāng)(P> 0.05)。造模后第21 天：GTL + ZA 組機(jī)械痛閾值較GTL 組、ZA組明顯升高(P< 0.05)。

圖2 各組小鼠機(jī)械痛閾值變化曲線圖(±SD)*P < 0.05，與Sham 組相比；#P < 0.05，與Model組相比；△P < 0.05，與ZA 組相比Fig. 2 Changes in mechanical pain threshold of mice in each group (±SD)*P < 0.05, compared with group Sham; #P < 0.05,compared with group Model; △P < 0.05, compared with group ZA .

2. 各組小鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞偽足小體F-actin 環(huán)比較

各組小鼠左后脛骨組織經(jīng)羅丹明標(biāo)記的綠色熒光鬼筆環(huán)肽染色F-actin 與藍(lán)色熒光染料DAPI 染色液染細(xì)胞核共同孵育后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖3），胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量綠色熒光肌動(dòng)蛋白F-actin 與細(xì)胞縱軸平行排列，呈細(xì)絲狀或網(wǎng)狀表達(dá)。與Sham 組比較，Model 組中F-actin 環(huán)分布于細(xì)胞周邊，微絲分布較有序，破骨細(xì)胞偽足F-actin 環(huán)完整，周圍有大量應(yīng)力纖維形成；與Model 組比較，各給藥組可見(jiàn)胞內(nèi)F-actin 環(huán)數(shù)量減少，環(huán)形態(tài)不完整，斷裂、周圍伴有少量應(yīng)力纖維形成；與ZA 組比較，GTL 組F-actin 環(huán)破壞程度類似，GTL + ZA組F-actin 環(huán)破壞程度較明顯。與GTL 組比較，GTL + ZA 組F-actin 環(huán)明顯破壞。

圖3 各組小鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞偽足小體F-actin 環(huán)（標(biāo)尺 = 100 μm）Nuclei 為破骨細(xì)胞細(xì)胞核；F-actin 為F-actin 骨架蛋白；Merge 為兩者融合后圖像；紅色箭頭所指為F-actin 環(huán)；黃色虛線為破骨細(xì)胞縱軸Fig. 3 F-actin ring of osteoclast pseudopodosomes in the tibial tissue of mice in each group (Scale bar = 100 μm)Nuclei refer to the nucleus of osteoclast; The F-actin is a F-actin skeletal protein; Merge refers to the merged image of the Nuclei and Factin rings; The red arrows refer to the F-actin ring; The yellow dash lines are the longitudinal axis of the osteoclast.

3.各組小鼠脛骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 mRNA 表達(dá)比較

各組小鼠左后脛骨組織RT-PCR 結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖4），與Sham 組比較，Model 組αvβ3、

表達(dá)比較(±SD)*P<0.05，與Sham組相比；#P<0.05，與Model圖4 各組小鼠脛骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 mRNA組相比；△P <0.05，與ZA組相比；&P<0.05，與GTL 組相比Fig. 4 Comparison of αvβ3, PyK2, Scr, and Cb1 mRNA expressions in the tibial tissue of mice in each group(±SD)*P < 0.05, comparedwithgroup Sham;#P< 0.05,compared withgroup Model;△P< 0.05, comparedwith group ZA;&P< 0.05,comparedwith groupGTL.

討 論

PyK2、Scr、Cbl mRNA 表達(dá)上調(diào)(P< 0.05)；與Model組比較，各給藥組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl mRNA 表達(dá)下調(diào)(P< 0.05)；與ZA 組比較，GTL 組αvβ3、PyK2、 Scr mRNA 表達(dá)升高，GTL + ZA 組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl mRNA 表達(dá)下降(P< 0.05)；與GTL組比較， GTL + ZA 組αvβ3、 PyK2、Scr、Cbl mRNA表達(dá)下降明顯(P< 0.05)。

4. 各組小鼠脛骨組織中αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 蛋白表達(dá)比較

免疫組化分析各組小鼠左后脛骨組織中αvβ3信號(hào)通路相關(guān)蛋白，αvβ3、PyK2、Scr、Cb1 蛋白主要定位在破骨細(xì)胞膜上，胞質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖5A）。進(jìn)一步對(duì)蛋白染色面積進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析（見(jiàn)圖5B），與Sham 組比較，Model 組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl 蛋白染色強(qiáng)度明顯升高(P< 0.05)；與Model 組比較，各給藥組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl蛋白染色強(qiáng)度減弱(P< 0.05)；與ZA 組比較，GTL組αvβ3、 PyK2、 Scr 蛋白染色強(qiáng)度增強(qiáng)，GTL + ZA組αvβ3、PyK2、Scr、Cbl 染色面積降低(P< 0.05)；與GTL 組比較，GTL + ZA 組αvβ3、PyK2、Scr、染色面積明顯降低(P< 0.05)。

中醫(yī)藥在治療骨癌痛方面發(fā)揮著重要作用，具有安全性高、毒副作用小、無(wú)成癮性等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。上海市名中醫(yī)徐振曄教授根據(jù)臨床多年抗腫瘤治療經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛屬于中醫(yī)“骨痹”范疇，該病以腎虛為本，寒凝、瘀血、痰濕為標(biāo)，脈絡(luò)阻滯[13]，則“不通則痛”和“不榮則痛”。以補(bǔ)腎養(yǎng)精，破瘀通絡(luò)為治則，創(chuàng)立經(jīng)驗(yàn)復(fù)方骨痛靈方。本研究結(jié)果顯示，骨痛靈方、唑來(lái)膦酸及聯(lián)合用藥均能提高肺癌骨轉(zhuǎn)移模型小鼠機(jī)械痛閾值，破壞偽足小體結(jié)構(gòu)，且聯(lián)合用藥優(yōu)于單藥干預(yù)效果，骨痛靈方與唑來(lái)膦酸結(jié)果類似，提示各給藥組均能破壞破骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用。與前期的臨床研究結(jié)果一致[14]，骨痛靈聯(lián)合唑來(lái)膦酸治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移疼痛的鎮(zhèn)痛效果顯著。骨痛靈方主要成分有蜈蚣、骨碎補(bǔ)、川草烏、淫羊藿等組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，蜈蚣水提物可增加小鼠微血管的開(kāi)放數(shù)目及增大其口徑，具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用[15]；川烏能抑制巴豆油所致的大鼠炎性肉芽腫增生，明顯提高小鼠熱板痛閾值[16]。因此，骨痛靈方抗骨癌痛作用可能與其方中的蜈蚣及川草烏有關(guān)。

骨吸收直接反映了骨溶解的狀態(tài)，骨溶解所帶來(lái)的炎性反應(yīng)和神經(jīng)損傷，是造成骨轉(zhuǎn)移疼痛的關(guān)鍵。成熟的破骨細(xì)胞行使骨吸收功能時(shí)，必須形成一個(gè)特殊的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)—偽足小體。偽足小體緊密附著于骨表面，并在附著區(qū)形成封閉腔，破骨細(xì)胞在該腔釋放氫離子和各種酶類進(jìn)行骨質(zhì)溶解[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨痛靈組、唑來(lái)膦酸組以及聯(lián)合用藥組可見(jiàn)胞內(nèi)F-actin 環(huán)形態(tài)不完整，斷裂，且聯(lián)合用藥組F-actin 環(huán)破壞程度較明顯；骨痛靈組與唑來(lái)膦酸組F-actin 環(huán)形態(tài)相似。提示骨痛靈、唑來(lái)膦酸及聯(lián)合用藥均能抑制破骨細(xì)胞偽足小體結(jié)構(gòu)形成，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞骨吸收功能，且聯(lián)合用藥效果更好。既往基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞分化和增殖均有促進(jìn)作用，具有抑制破骨母細(xì)胞向多核破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用[18]，本研究結(jié)果推測(cè)骨痛靈方抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能可能與其方中的骨碎補(bǔ)相關(guān)。

破骨細(xì)胞偽足小體形成過(guò)程中αvβ3 整合素尤為重要，它可以介導(dǎo)由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的微絲結(jié)構(gòu)通過(guò)聚合作用形成該結(jié)構(gòu)。αvβ3 整合素在破骨細(xì)胞呈高表達(dá)，被認(rèn)為是破骨細(xì)胞骨吸收過(guò)程中的核心分子，阻斷αvβ3 可影響偽足小體的形成、破骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和骨吸收[19]。研究表明[20,21]，整合素αvβ3的胞內(nèi)信號(hào)可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高，而激活作為鈣調(diào)節(jié)蛋白的Pyk2，Pyk2 的活化可以誘導(dǎo)c-Src 的募集和Cbl 的磷酸化，即在αvβ3 的作用下形成PyK2/Src/Cbl 分子復(fù)合物，啟動(dòng)骨架蛋白的改變，最終形成偽足小體。與上述研究結(jié)果一致，本研究肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠造模成功后，脛骨組織中αvβ3、PyK2、Src 及Cbl mRNA 表達(dá)及蛋白染色強(qiáng)度升高，偽足小體形態(tài)完整且數(shù)量多。各給藥組干預(yù)后，αvβ3、PyK2、Src 及Cbl mRNA 表達(dá)及蛋白染色強(qiáng)度均降低，且聯(lián)合用藥后降低明顯，提示骨痛靈、唑來(lái)膦酸及聯(lián)合用藥均能抑制αvβ3/PyK2/Src/Cb1 通路。

綜上所述，骨痛靈方及其聯(lián)合唑來(lái)膦酸可提高骨轉(zhuǎn)移癌痛機(jī)械痛閾值，破壞骨組織中F-actin 環(huán)結(jié)構(gòu)，且兩藥聯(lián)用具有增效作用，其機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控骨組織中αvβ3/PyK2/Src/Cbl 通路抑制破骨細(xì)胞偽足小體形成起到骨保護(hù)作用，從而治療肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛（見(jiàn)圖6）。

圖6 骨痛靈方通過(guò)抑制αvβ3 通路介導(dǎo)破骨細(xì)胞偽足小體形成治療肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛的示意圖肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛的發(fā)生有3 個(gè)過(guò)程：①肺癌腫瘤細(xì)胞在骨骼肌著床后引起破骨細(xì)胞高表達(dá)整合素αvβ3；②整合素αvβ3 胞內(nèi)信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高，激活鈣調(diào)節(jié)蛋白PyK2，誘導(dǎo)c-Src 的募集和Cb1 的磷酸化，形成αvβ3/PyK2/Src/Cb1 分子復(fù)合物，啟動(dòng)骨架蛋白的改變，最終形成足突小體；③破骨細(xì)胞釋放更多氫離子而產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏。骨痛靈方通過(guò)降低破骨細(xì)胞αvβ3 表達(dá)，抑制αvβ3/PyK2/Src/Cb1 通路，破壞偽足小體形成發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。Fig. 6 Schematic diagram of Gutongling Decoction alleviates pain induced by bone metastasis of lung cancer through inhibiting αvβ3 signaling pathway-mediated formation of osteoclast pseudopodosomes There are three processes for the occurrence of pain in bone metastasis of lung cancer:①Lung cancer tumor cells cause osteoclasts to express high integrin αvβ3 after skeletal muscle implantation; ②The intracellular signal of integrin αvβ3 induces the increase of intracellular Ca2+, activates the calcium regulatory protein PyK2, induces the recruitment of c-Src and phosphorylation of Cb1, forms a molecular complex of αvβ3/PyK2/Src/Cb1, and initiates the changes of skeletal proteins, finally forming podocytes;③Osteoclasts release more hydrogen ions to produce hyperalgesia. Gutongling Decoction exerts analgesic effect by reducing the expression of αvβ3 in osteoclasts, inhibiting the αvβ3/PyK2/Src/Cb1 pathway,and destroying the formation of pseudopodosomes.

本研究尚存在一定局限性，未用αvβ3 抑制劑或建立穩(wěn)敲αvβ3 肺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，后續(xù)將進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)：明確骨痛靈方抗肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛的具體機(jī)制，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)手段成功建立αvβ3 靶標(biāo)肺癌細(xì)胞模型，驗(yàn)證骨痛靈方對(duì)αvβ3 分子依賴功能，闡明αvβ3/PyK2/Src/Cbl 這條信號(hào)通路調(diào)控偽足小體形成影響骨吸收癌痛的具體作用機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。