番石榴葉揮發(fā)油的抗菌性及優(yōu)化提取研究

張曉南，王建豪，王佳麗，朱鴻維，牛亞倩，熊婷婷，張英迪，徐 福

1.嘉應(yīng)學(xué)院，廣東梅州 541000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030

番石榴（Psidium guajavaLinn.）是桃金娘科（Myrtaceae）喬木，原產(chǎn)于北美洲墨西哥，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。其對(duì)氣候條件適應(yīng)能力強(qiáng)，尤喜愛干燥條件下生長，漿果呈球形、卵圓形或梨形，種子密集分布于果肉中[2-3]，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)水果，在我國南部地區(qū)有廣泛栽培。研究證實(shí)番石榴葉中富含揮發(fā)油、黃酮類和多糖類等多種代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有很高的藥用價(jià)值和多種生理功能[4-5]，包括治療皮膚病、抗腫瘤[6]、抗糖尿病[7]、抗氧化以及抗菌活性[8]等。其中具有較大研究意義的是番石榴葉揮發(fā)油，其主要成分為檸檬烯、異二氯苯酚、反式石竹烯和氧化倍半萜等物質(zhì)[9]，可有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌，對(duì)革蘭氏陽性菌和真菌也顯示出較強(qiáng)的抗菌活性[10-11]；此外，其中的反式石竹烯在殺蟲方面有很高的活性，還具有局部麻醉、抗炎等功能[12]。

經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)過程中易受病原菌的侵害，其中酸瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies, SA）、茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum,RS）和胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovorasubsp.carotovoraBorgey, ECCB）是3種危害性較大的農(nóng)作物病原菌，它們的寄主廣泛（甚至在土壤中也能存活），主要寄居在馬鈴薯、番茄、辣椒等農(nóng)作物的根莖或果實(shí)上，誘發(fā)植物瘡痂病、青枯病和軟腐病等，抑制果實(shí)生長，降低產(chǎn)品的市場價(jià)值[13]。此外，病害具有一定的傳染性，因此對(duì)其預(yù)防和滅殺十分必要。目前主要的防治手段是化學(xué)合成殺菌劑，但農(nóng)藥和抗生素等作用標(biāo)靶單一，使病原菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，防治效果不理想，并且對(duì)環(huán)境不友好。因此，防治重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向生物防治，據(jù)報(bào)道，采用噬菌體或噬菌體組合、無致病菌株等方法可防治青枯病菌，但在多種多樣的土壤環(huán)境下，易受寄主范圍的限制，因此防治效果并不穩(wěn)定[14-15]。揮發(fā)油是一種植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，具備多種生物活性，還具有天然無毒、易降解的特點(diǎn)，可作為防治農(nóng)作物病害的物質(zhì)來源。本研究通過添加鋰鹽結(jié)合微波輔助加熱提取番石榴葉揮發(fā)油，研究番石榴揮發(fā)油對(duì)3種重要農(nóng)作物病原菌的抗性；嘗試單因素設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)探究各因素之間的二次多項(xiàng)式模型，獲得最佳提取條件；確定揮發(fā)油的組成成分，初步探究其抑菌成分，為番石榴葉揮發(fā)油植物源抗菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 番石榴葉：采購于廣東梅州，保存在干燥、涼爽、避光的環(huán)境中。

1.1.2 主要試劑 無水氯化鋰、氫氧化鋰、醋酸鋰、硝酸鋰、硫酸鋰（純度≥99%）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；正己烷（色譜純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水硫酸鈉（純度≥99%）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；利福平（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酸瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies, SA）、茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum, RS）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovorasubsp.carotovoraBorgey,ECCB）：購自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.1.3 儀器與設(shè)備 M1-L213B微波爐：廣東美的廚房電器有限公司；JA2003電子天平：上海浦春計(jì)量儀器有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國安捷倫公司；B-220恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)：北京聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抑菌研究 （1）培養(yǎng)基的制備及菌株的活化。稱取LB營養(yǎng)瓊脂32 g，加入1000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15 min，備用。在無菌操作臺(tái)中，取 10 μL保存于甘油中的菌液，接種到 LB肉湯培養(yǎng)基中，于37℃搖床上培養(yǎng)12 h，用培養(yǎng)基將菌液濃度稀釋至107~108CFU/mL，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）濾紙片擴(kuò)散法測定抗菌活性。用打孔器將干凈濾紙制成直徑為 8 mm的圓形紙片，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，放入揮發(fā)油原液中浸漬4 h，晾干備用。在無菌操作臺(tái)中，用移液槍吸取 10 μL活化后的菌液，均勻涂布到培養(yǎng)皿中。再用無菌鑷子將濾紙片貼在培養(yǎng)皿中心，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 24 h，生理鹽水為空白對(duì)照，抗生素利福平為陽性對(duì)照，平行試驗(yàn)3次。觀察抑菌圈的大小，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。抑菌率按以下公式計(jì)算：

（3）最小抑菌濃度（MIC）的測定。番石榴葉揮發(fā)油用 0.1%吐溫-80溶液稀釋濃度為 0.71~50 μg/mL。分別吸取5 μL不同濃度的揮發(fā)油溶液滴加在 8 mm的濾紙片上，將濾紙片置于培養(yǎng)皿中心，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，0.1%吐溫-80為空白對(duì)照，觀察細(xì)菌生長情況。最小抑菌濃度（MIC）為具有抑菌作用時(shí)的最低濃度。

1.2.2 揮發(fā)油的提取及優(yōu)化 番石榴葉經(jīng)粉碎機(jī)制成直徑約為8~10 mm的塊狀碎片，置于陰涼通風(fēng)處，干燥后冷藏備用。稱取番石榴葉 30 g（去除含水率70%后的質(zhì)量）置于1000 mL蒸餾燒瓶中，將鋰鹽溶液和適量溶劑加入到燒瓶中并在室溫下放置 1 h使料液充分混勻，一定功率和時(shí)間條件下，置于微波提取裝置中進(jìn)行加熱，溶劑沸騰后產(chǎn)生的水蒸氣攜帶揮發(fā)油經(jīng)冷凝回流裝置冷凝并收集，加無水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理，記錄揮發(fā)油提取量。揮發(fā)油得率按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

揮發(fā)油得率（mL/kg）=（揮發(fā)油提取量/番石榴葉質(zhì)量）×1000

選取液料比、微波功率和微波時(shí)間為自變量，試驗(yàn)范圍為：液料比4、6、8、10、12 mL/g（干重），微波功率120、230、385、540、700 W，微波時(shí)間20、30、40、50、60 min，揮發(fā)油得率為響應(yīng)值，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以1、0、-1分別代表各因素的高中低水平，使用Design-Expert 10.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因子編碼及水平見表1。取優(yōu)化工藝后收集的揮發(fā)油0.5 mL，溶解在500倍體積的正己烷中，0.22 μm濾膜過濾后用于GC-MS分析。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Tab.1 Factor and levels in response surface analysis

1.2.3 GC-MS檢測條件 氣相色譜條件：色譜柱為 HP-5MS（25 m×0.2 mm, 0.25 μm）石英毛細(xì)管柱OV-101；柱溫40~200℃；柱前壓0.8 kg/cm2；程序升溫：初始溫度 50℃，以3℃/min升溫至180℃，保持 10 min，再以5℃/min升溫至 280℃。氣化溫度250℃；載氣為氦氣；分流比為50∶1；進(jìn)樣量為1 μL。質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV；離子源溫度 250℃，分析采用掃描方式，質(zhì)量掃描范圍40~400m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Excel 2010軟件繪圖，采用 Design Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油的抑菌研究

2.1.1 番石榴葉揮發(fā)油的抗菌活性分析 番石榴葉揮發(fā)油原液和對(duì)照樣品對(duì)供試菌株的抑菌圈直徑、菌落形態(tài)及揮發(fā)油抑菌率見表2。在培養(yǎng)皿內(nèi)揮發(fā)油直接同菌株接觸，具有抗菌活性的物質(zhì)能夠抑制細(xì)菌的生長，并在濾紙片周圍形成抑菌圈，抑菌圈直徑越大，說明抗菌活性越好。從表2可以看出，雖然番石榴葉揮發(fā)油的抑菌效果低于抗生素，但對(duì)3種細(xì)菌菌株均有一定的抑菌效果。對(duì)茄科雷爾氏菌（RS）的抑菌圈直徑為(23.24±0.27)mm，屬于高度敏感[16]，抑菌率達(dá)65.58%±0.22%；對(duì)酸瘡痂鏈霉菌（SA）和胡蘿卜軟腐歐文氏菌（ECCB）的抑菌圈直徑分別為(21.87±0.53)、(20.57±0.19)mm，屬于中度敏感[16]，抑菌率均在60%以上。抑菌圈活性測試結(jié)果表明，番石榴葉揮發(fā)油對(duì)茄科雷爾氏菌抑制作用最強(qiáng)，對(duì)酸瘡痂鏈霉菌的抑制作用次之，對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制作用最弱，而且顯著弱于茄科雷爾氏菌（P＜0.05）。

表2 番石榴葉揮發(fā)油的抗菌活性Tab.2 Antibacterial activity of guava leaf volatile oil

2.1.2 番石榴葉揮發(fā)油對(duì)供試菌株的最小抑菌濃度分析 番石榴葉揮發(fā)油對(duì)供試菌株的最小抑菌濃度（MIC）如表3所示?？梢钥闯?，揮發(fā)油濃度越大，對(duì)菌株的抑制效果越好。當(dāng)番石榴葉揮發(fā)油濃度為1.56 μg/mL時(shí)，番石榴葉揮發(fā)油對(duì)酸瘡痂鏈霉菌（SA）和胡蘿卜軟腐歐文氏菌（ECCB）未顯示出抑制作用，但對(duì)茄科雷爾氏菌（RS）產(chǎn)生了抑制作用，抑菌率為12.57%±0.49%；番石榴葉揮發(fā)油濃度增大至3.13 μg/mL時(shí)，對(duì)酸瘡痂鏈霉菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌均產(chǎn)生抑制作用；隨著揮發(fā)油濃度的增大，抑菌作用也逐漸增大，揮發(fā)油濃度為 50 μg/mL時(shí)，抑菌率在 46.52%~55.36%之間，其中對(duì)茄科雷爾氏菌的抑菌效果最好，抑菌率為55.36%±0.13%；對(duì)酸瘡痂鏈霉菌的抑菌率為47.92%±0.37%；對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌率為46.56%±0.15%。以上結(jié)果表明，番石榴葉揮發(fā)油在一定濃度下對(duì)供試菌株才有抑制作用，呈劑量依賴型抑制關(guān)系。通過倍數(shù)稀釋法測定番石榴葉揮發(fā)油對(duì)茄科雷爾氏菌的MIC值為1.56 μg/mL，而對(duì)酸瘡痂鏈霉菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌的MIC值為3.13 μg/mL，表明3種供試菌株中茄科雷爾氏菌對(duì)番石榴葉揮發(fā)油最敏感，在濃度僅1.56 μg/mL時(shí)即產(chǎn)生抑制作用；對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制效果最弱，濃度達(dá)到3.13 μg/mL才能起到抑菌效果，抑菌率為11.89%±0.37%。

表3 番石榴葉揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）Tab.3 Minimum inhibitory concentration of guava leaf volatile oil (MIC)

2.2 金屬鋰鹽篩選

2.2.1 鋰鹽類型的篩選 鋰離子（Li+）分別與氯離子（Cl-）、氫氧根（OH-）、醋酸根（CH3COO-）、硝酸根（NO3-）和硫酸根（SO42-）結(jié)合成鋰鹽，鋰鹽對(duì)揮發(fā)油得率的影響如圖1A所示。添加氯化鋰時(shí)番石榴葉揮發(fā)油得率最高（5.02 mL/kg），使用其他鋰鹽時(shí)揮發(fā)油得率則呈逐漸下降趨勢。鹽析作用是促進(jìn)揮發(fā)油分離的最有效的一種手段，通過改變各相在體系中的溶解度來達(dá)到分離的目的。陳迅等[17]在考察6種鹽對(duì)羅漢松揮發(fā)油提取率的影響中發(fā)現(xiàn)，陰離子鹽析效應(yīng)強(qiáng)弱依次是氯離子＞硝酸根離子＞硫酸根離子，這與本研究結(jié)果一致。因此后續(xù)試驗(yàn)中所添加的鋰鹽確定為氯化鋰。

2.2.2 鋰鹽用量的篩選 如圖1B所示，與未添加鋰鹽時(shí)相比，隨著鋰鹽（氯化鋰）用量增加，揮發(fā)油得率顯著升高。鋰鹽用量為45 μmol時(shí)，揮發(fā)油得率達(dá)到5.08 mL/kg；繼續(xù)增大鋰鹽用量至60 μmol，揮發(fā)油得率為5.14 mL/kg，與鋰鹽用量45 μmol時(shí)的揮發(fā)油得率差異不顯著。為減少成本，確定鋰鹽用量為45 μmol。

圖1 鋰鹽種類（A）和用量（B）對(duì)精油得率的影響Fig.1 Effect of the type (A) and dosage (B) of lithium salt on the yield of essential oil

2.3 單因素提取條件的優(yōu)化

2.3.1 液料比的影響 液料比在揮發(fā)油提取過程中具有重要的影響，溶劑過多或過少都會(huì)影響揮發(fā)油得率[18]。由圖2A可知，隨著液料比的增加，番石榴葉揮發(fā)油得率先升高后降低，在液料比達(dá)到8 mL/g時(shí)揮發(fā)油得率最高（7.31 mL/kg）。其原因可能是當(dāng)水分過多時(shí)，混合物沸騰所需時(shí)間延長，得率降低，同時(shí)液料比增大也會(huì)導(dǎo)致一部分揮發(fā)油成分溶解到水中而無法提出，這與李麟洲等[19]提取胡椒梗揮發(fā)油的研究結(jié)果相似。結(jié)合原料成本選擇液料比為8 mL/g。

2.3.2 微波功率的影響 如圖2B所示，番石榴葉揮發(fā)油得率與微波功率呈正相關(guān)，微波功率的增大顯著提高了揮發(fā)油得率。隨著微波功率的增大，揮發(fā)油得率呈階梯式升高，微波功率在700 W時(shí)得率最高，為7.85 mL/kg。其原因可能是在微波提取過程中，液料需要一定的溫度達(dá)到沸騰狀態(tài)，通過調(diào)整不同檔位的微波功率來達(dá)到控制溫度的目的；當(dāng)某一檔位的功率持續(xù)工作時(shí)，第一滴揮發(fā)油被餾出前2 min內(nèi)體系會(huì)逐漸趨于穩(wěn)定，溫度在恒定范圍內(nèi)保持不變，因而達(dá)到恒溫提取揮發(fā)油的目的[20-21]。盡管提取過程中溫度不再變化，但較大的微波功率下使液料沸騰進(jìn)程加快，并且產(chǎn)生更大的微波能量加速植物細(xì)胞的破裂，使得率升高?？紤]到過高功率可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)油中生物活性成分的降解[22]，同時(shí)結(jié)合設(shè)備實(shí)際情況以功率540 W為中心優(yōu)化水平。

2.3.3 微波時(shí)間的影響 由圖2C可觀察到，隨著微波時(shí)間的延長，番石榴葉揮發(fā)油得率呈先升高后穩(wěn)定的趨勢。微波時(shí)間從 20 min增加到40 min的過程中，揮發(fā)油得率呈階梯型增長；繼續(xù)增加微波時(shí)間，揮發(fā)油得率升高不顯著。在這期間，揮發(fā)油得率的增長速率從 20~40 min內(nèi)的71.91%下降到40~60 min內(nèi)的7.18%。PENG等[23]進(jìn)行了類似的研究，在提取初始階段，白松樹皮揮發(fā)油的產(chǎn)量增加很快，于30 min后產(chǎn)量變?yōu)楹愣?。因此選取最佳提取時(shí)間為40 min。

圖2 不同因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effects of different factors on extraction rate of volatile oil

2.3.4 揮發(fā)油提取過程動(dòng)力學(xué)分析 固定液料比為8 mL/g，每間隔5 min記錄不同微波功率下番石榴葉揮發(fā)油得率，對(duì)提取過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，結(jié)果見圖3。不同微波功率條件下，番石榴葉揮發(fā)油得率隨微波時(shí)間的增加而升高。在120 W和230 W功率時(shí)，揮發(fā)油得率增長緩慢，提取不充分；在385、540、700 W功率時(shí)揮發(fā)油得率升高較快，提取 20 min時(shí)揮發(fā)油得率分別為 3.81、5.12、5.92 mL/kg；提取40 min時(shí)揮發(fā)油得率可以達(dá)到6.35、7.74、8.46 mL/kg，此時(shí)揮發(fā)油得率顯著升高；繼續(xù)增加提取時(shí)間至60 min，揮發(fā)油得率分別為7.22、8.27、8.95 mL/kg，這一過程揮發(fā)油得率增加不顯著。整個(gè)提取過程說明微波時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率產(chǎn)生了顯著影響。與MEGAWATI等[24]提取肉豆蔻揮發(fā)油的規(guī)律相似：提取初始階段揮發(fā)油產(chǎn)量增加較快，一定時(shí)間后增加量逐漸變緩直到恒定。且微波功率越大，揮發(fā)油得率越快趨于穩(wěn)定，即系統(tǒng)更快達(dá)到平衡，說明微波功率也對(duì)提取過程產(chǎn)生了較大影響[25]。綜合以上因素確定以液料比、微波功率和微波時(shí)間為優(yōu)化因素，中心優(yōu)化水平分別為8 mL/g、540 W和40 min。

圖3 提取動(dòng)力學(xué)研究Fig.3 Extraction kinetics study

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用 Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析數(shù)據(jù)并建立數(shù)學(xué)模型，以液料比（A）、微波功率（B）和微波時(shí)間（C）為自變量，以番石榴葉揮發(fā)油得率（Y）為響應(yīng)值，共設(shè)計(jì)17個(gè)處理組，結(jié)果見表4。

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型的建立和分析利用Design-Expert 10.0軟件對(duì)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到各因子對(duì)響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型：

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和響應(yīng)值Tab.4 Experiment design scheme and response values of response surface

Y=8.09+1.32A+0.79B+0.39C+0.48AB+0.69AC+0.17BC-0.36A2-0.29B2+0.26C2

揮發(fā)油得率（Y）的回歸方程方差分析結(jié)果如表5所示，模型P＜0.0001，差異極顯著（P＜0.01），說明回歸模型顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1193＞0.05），說明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小，試驗(yàn)誤差可以忽略；模型的R2=0.99，R2adj=0.98，CV=2.21%＜3%，說明模型擬合度高。以上結(jié)果表明，模型能夠很好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確地反應(yīng)各個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油得率的影響。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的AB和AC對(duì)揮發(fā)油得率的影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)揮發(fā)油得率的影響不顯著。按照F值大小對(duì)影響揮發(fā)油得率的各個(gè)因素進(jìn)行排序?yàn)椋篈（液料比）＞B（微波功率）＞C（微波時(shí)間）。

表5 揮發(fā)油得率的回歸方程方差及顯著性分析Tab.5 Regression equation variance and significance analysis of volatile oil yield

2.4.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)各因素交互作用分析 對(duì)上述模型進(jìn)行分析，得到各因素之間交互作用對(duì)揮發(fā)油得率（Y）影響的響應(yīng)曲面圖（圖4）。響應(yīng)曲面的陡峭和平緩程度與各因素交互作用的強(qiáng)弱呈正相關(guān)[26]。由圖4A和圖4B可以看出，液料比對(duì)揮發(fā)油得率的影響最大，表現(xiàn)為固定微波功率或微波時(shí)間時(shí)，液料比的方向的曲線變化較陡；同時(shí)也顯示出液料比與微波功率、液料比與微波時(shí)間的交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響是顯著的。而圖4C的響應(yīng)曲面變化平緩，說明微波功率和微波時(shí)間之間的交互作用對(duì)揮發(fā)油得率的影響較弱，相對(duì)于液料比，微波功率和微波時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響較小。結(jié)合各交互項(xiàng)的F值大小可知，影響揮發(fā)油得率的各交互作用因素順序?yàn)锳C＞AB＞BC。

圖4 各因素對(duì)揮發(fā)油得率的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface diagram of each factor on yield of volatile oil

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件與驗(yàn)證試驗(yàn) 在各因素試驗(yàn)范圍內(nèi)，以最高揮發(fā)油得率為優(yōu)化目標(biāo)，響應(yīng)面軟件分析獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)為：液料比9.73 mL/g、微波功率658 W和微波時(shí)間43 min，預(yù)測模型的揮發(fā)油得率為10.45 mL/kg。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件和儀器參數(shù)調(diào)整提取工藝條件為：液料比10 mL/g，微波功率660 W，微波時(shí)間43 min，最終得到番石榴葉揮發(fā)油得率為(10.23±0.17)mL/kg，與理論預(yù)測值（10.45 mL/kg）無顯著性差異，表明該模型可用于優(yōu)化番石榴葉揮發(fā)油的提取工藝。

2.5 番石榴葉揮發(fā)油成分分析

運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)番石榴葉揮發(fā)油成分進(jìn)行檢測，并結(jié)合NIST11.L質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索和分析，保留其中與NIST11.L譜庫匹配度≥80%的成分（表6）。樣品中共檢測出33種成分，占總成分的98.51%，檢出最多的物質(zhì)是萜烯類，有16種，其次為醇類和其他類，分別有7種和6種，醛類、烷烴類、酚類、酯類均只檢測出1種。含量較高的成分有β-石竹烯（28.36%）、去氫白菖烯（11.47%）、藍(lán)桉醇（11.31%）、α-蒎烯（10.01%），其次是香橙烯（5.18%）、1,2,3,4,4a,7-六氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘（5.14%）、α-石竹烯（3.91%）、反式-杜松醇（2.59%）、1,2,3,3a,4,5,6,7-八氫-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-甘菊烯（2.11%）。檢出成分中β-石竹烯、α-蒎烯、α-石竹烯、大根香葉烯 D、α-蓽澄茄油烯等具有呈香效果，它們是揮發(fā)油香味的主要來源物質(zhì)；而 β-石竹烯、α-蒎烯、D-檸檬烯、大根香葉烯 D、香橙烯、丁香酚、α-松油醇等成分具有抑菌效果[27-28]。其中 β-石竹烯、α-蒎烯、D-檸檬烯、丁香酚、α-松油醇具有廣譜抗微生物活性，除了能夠抑制細(xì)菌的生長外，還具有抗真菌、抗病毒等活性[29]，因此推測它們在抗菌試驗(yàn)中發(fā)揮的作用較大。

表6 番石榴葉揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.6 Gas chromatography-mass spectrometry results for chemical compositions of guava leaf volatile oil

3 討論

目前，有關(guān)番石榴葉揮發(fā)油抗菌活性的研究較多，將其用于防治由細(xì)菌引起的農(nóng)作物病害甚至動(dòng)物病害逐漸成為研究熱點(diǎn)。CHATURVEDI等[30]驗(yàn)證了番石榴葉揮發(fā)油對(duì)新月彎孢菌和厚垣鐮孢菌有明顯的抑制作用，抑菌率分別可以達(dá)到86.02%和 82.80%。ZHANG等[31]將番石榴葉揮發(fā)油負(fù)載殼聚糖中，發(fā)現(xiàn)在最低濃度（100 mg/mL）時(shí)對(duì)肺炎克雷伯菌有抑制作用。這些研究說明番石榴葉揮發(fā)油具有代替合成殺菌劑的潛力。本研究中，番石榴葉揮發(fā)油對(duì)酸瘡痂鏈霉菌、茄科雷爾氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌均有良好的抗菌活性，MIC 值分別為 3.13、1.56、3.13 μg/mL。其中，番石榴葉揮發(fā)油對(duì)茄科爾氏菌的抑制效果最好，在最低濃度 1.56 μg/mL的條件下，抑菌率為12.57%，最高濃度 50 μg/mL時(shí)的抑菌率為55.36%。這與先前對(duì)香茅精油抗菌性的研究結(jié)果相似，茄科雷爾氏菌也是供試菌株中最敏感的細(xì)菌，在精油濃度為 40 μg/mL時(shí)的抑制率達(dá)到66.43%[32]。2種揮發(fā)油的抑菌率存在差別可能是化學(xué)成分的差異導(dǎo)致的。本研究結(jié)果表明番石榴葉揮發(fā)油是酸瘡痂鏈霉菌、茄科雷爾氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌的有效抗菌劑，為農(nóng)作物病害的防治提供了新選擇，具有重要意義。

在番石榴葉揮發(fā)油的提取過程中，考慮了一種通過自主改造微波設(shè)備的新思路，并添加適量的金屬鋰鹽提取番石榴葉揮發(fā)油，顯著提高了揮發(fā)油產(chǎn)量。通過單因素篩選結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝條件為：液料比 10 mL/g、微波功率660 W和微波時(shí)間43 min，此工藝提取的番石榴葉揮發(fā)油得率為(10.23±0.17)mL/kg，模型擬合度良好。郭瑩等[33]使用常規(guī)加熱套加熱結(jié)合水蒸氣蒸餾法提取番石榴葉揮發(fā)油，經(jīng)正交優(yōu)化后的工藝為粉碎程度為粉末（20目），料液比為1∶12，提取時(shí)間為 5 h，揮發(fā)油得率最高達(dá)到0.85 mL/100g。與傳統(tǒng)加熱套法相比，微波具有液料受熱均勻、提取效率高、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。本研究中使用微波輔助水蒸餾法收集的番石榴葉揮發(fā)油得率可觀，優(yōu)化后的提取工藝具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)促進(jìn)番石榴葉的開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。

先前的研究表明，番石榴葉揮發(fā)油的主要成分為 α-蒎烯、檸檬烯、薄荷醇、異丙醇、β-石竹烯等，多為萜類化合物及其衍生物，其純物質(zhì)廣泛應(yīng)用于治療各種疾病[34]。不同種植地點(diǎn)、提取方式等會(huì)造成揮發(fā)油成分含量的差異。例如，SILVA等[35]發(fā)現(xiàn)番石榴葉揮發(fā)油以倍半萜類為主，反式石竹烯、α-石竹烯、α-selinene 和 selin-11-en-4α-ol為主要化合物。而郭瑩等[33]報(bào)道番石榴葉揮發(fā)油以烯、醇類物質(zhì)為主，其中廣藿香烯含量占54.97%。揮發(fā)油成分含量存在明顯差異。值得注意的是，還提出 β-石竹烯、α-蒎烯具有較強(qiáng)的抗菌活性。本研究中，優(yōu)化后獲得的番石榴葉揮發(fā)油共檢測出33種化合物，包括醛類、萜烯類、烷烴類、酚類、醇類、酯類和其他類成分。檢出成分中已報(bào)道具有抗菌活性的物質(zhì)包括 β-石竹烯、α-蒎烯、D-檸檬烯、大根香葉烯D、香橙烯、丁香酚、α-松油醇等，主要為萜烯類、酚類和醇類物質(zhì)，這些成分約占揮發(fā)油總成分的一半，可能在抗菌試驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。

目前植物源化合物對(duì)青枯病的防治機(jī)理大多為對(duì)病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[36]。由于番石榴葉揮發(fā)油中含有豐富的小分子化合物，這些化合物可以使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物外流，細(xì)菌失活。PARET等[37]研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰草和檸檬草揮發(fā)油處理茄科雷爾氏菌后細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞碎片破裂，氨基酸、堿基、碳水化合物等水平顯著降低。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番石榴葉揮發(fā)油與以上揮發(fā)油共有成分中包括β-石竹烯、丁香酚、α-蒎烯等物質(zhì)[38-39]。而丁香酚不僅可以通過分解細(xì)胞壁，改變菌體形態(tài)來抑制細(xì)菌生長，還可以使細(xì)胞膜的通透性變大，大分子物質(zhì)流出，導(dǎo)致菌體內(nèi)功能分子如ATP、蛋白質(zhì)等含量減少，達(dá)到抑制或殺滅細(xì)菌的目的[40]。這也進(jìn)一步表明番石榴葉揮發(fā)油抗菌機(jī)制的多樣性。

綜合以上分析，番石榴葉揮發(fā)油的主要成分β-石竹烯和 α-蒎烯對(duì)供試菌株具有較強(qiáng)的抑制作用，在抗菌試驗(yàn)中發(fā)揮重要的作用。另外，揮發(fā)油對(duì)3種供試菌株發(fā)揮作用的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者可能是丁香酚。盡管該物質(zhì)的含量較?。?.19%），但仍可能是番石榴葉揮發(fā)油對(duì)茄科雷爾氏菌具有較高抑制率的原因之一。此外，不排除揮發(fā)油中其他萜類化合物如D-檸檬烯的協(xié)同抑制作用。番石榴葉揮發(fā)油在對(duì)抗酸瘡痂鏈霉菌、茄科雷爾氏菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抑制效果，表明其在農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域有一定的應(yīng)用潛力，為減少化學(xué)殺菌劑使用的負(fù)面影響，作為植物源抗菌劑進(jìn)行深度開發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景。