關(guān)嶺牛MEF2A基因干擾載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染對(duì)成肌細(xì)胞的影響

孫金魁，許厚強(qiáng)，石鵬飛，阮 涌

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)550025)

關(guān)嶺牛具有體質(zhì)強(qiáng)壯、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良特性，其自身的獨(dú)特基因是生物多樣性的重要組成部分[1-2]。與其它黃牛品種相比，關(guān)嶺牛產(chǎn)肉率低、生長(zhǎng)遲緩，限制了高原山地畜牧業(yè)的發(fā)展。肌原性細(xì)胞的增殖分化是影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer factor2, MEF2)在肌肉細(xì)胞中廣泛存在，可將該基因視作肌源性基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)物[3-4]。

研究表明，MEF2通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉特異基因的表達(dá)影響骨骼肌發(fā)育分化進(jìn)程，MEF2屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-Box家族，該家族包括微小染色體維持蛋白(MCM1)、AGAMOUS、DEFICIENS和血清反應(yīng)因子(SRF)等成員[5]。MEF2蛋白具備DNA結(jié)合活性，擁有結(jié)合肌肉肌酸激酶(MCK)基因啟動(dòng)子中富含A/T的DNA序列的能力[6]。前期研究中，MEF2基因家族在脊椎動(dòng)物中包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D四個(gè)成員[7]，該家族成員結(jié)構(gòu)相似，皆含有中心MEF2結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)合DNA的MADS區(qū)域和C端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域；C末端區(qū)域主要由選擇性拼接而成，MEF2因子可發(fā)生同源二聚化和多種異源二聚化，以具體的方式參與細(xì)胞生命周期中許多重要的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[8]。MEF2主要通過(guò)MADS-box結(jié)構(gòu)域和MEF2結(jié)構(gòu)域與其他轉(zhuǎn)錄輔因子的互作來(lái)調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，具備調(diào)控細(xì)胞凋亡(包括神經(jīng)元、肌肉、血管、淋巴細(xì)胞)和骨骼在內(nèi)的多種組織的分化、形態(tài)發(fā)生和維持的作用[9-10]。

MEF2A基因是具有bHLH(basic helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，包含MADS-box和HJURP-C兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可識(shí)別肌肉調(diào)控基因啟動(dòng)區(qū)中E-box元件(CANNTG)，進(jìn)而激活下游基因的特異性表達(dá)[11-12]。Edmondson等[13]研究表明，在肌再生過(guò)程中，MEF2A是最早可檢測(cè)到的基因之一，在骨骼肌中高度表達(dá)，對(duì)肌纖維聚合形成、骨骼肌干細(xì)胞和成肌細(xì)胞增殖分化具有不可或缺的作用[14-15]。Wu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2A具備承接結(jié)構(gòu)蛋白與調(diào)控因子的功能，該基因異位表達(dá)可結(jié)合Capn3啟動(dòng)子區(qū)域的預(yù)測(cè)位點(diǎn)，二者互作可影響L6成肌細(xì)胞的分化模型。MEF2A具備獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄活性，能夠維持出生后心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，Clark和Naya[17]研究證實(shí)，MEF2A可通過(guò)調(diào)節(jié)Gtl2/Dio3位點(diǎn)，進(jìn)而刺激轉(zhuǎn)錄輔因子CITED2來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖；此外，MEF2A可通過(guò)激活SIRT1的表達(dá)來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[18]。Blixt等[19]研究報(bào)道，MEF2A基因在小鼠破骨細(xì)胞模型中具有性別特異性調(diào)節(jié)作用。因此，MEF2A對(duì)于肌肉組織生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用因組織類型而異，對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞增殖分裂具有重要作用。

目前，有關(guān)MEF2A基因在關(guān)嶺牛(Bostaurus)成肌細(xì)胞上的研究鮮有報(bào)道，影響成肌細(xì)胞的機(jī)理尚不明確。因此，本試驗(yàn)以關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，構(gòu)建篩選MEF2A基因的最佳干擾載體，轉(zhuǎn)染載體至細(xì)胞后，qRT-PCR法檢測(cè)成肌細(xì)胞中肌生成相關(guān)基因的表達(dá)；檢測(cè)細(xì)胞周期與活力特性。為進(jìn)一步探索MEF2A基因?qū)﹃P(guān)嶺牛肌肉發(fā)育的分子效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Lipofectamine TM3000CD Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific(美國(guó))；DMEM/F12培養(yǎng)基、Gibco澳洲胎牛血清均購(gòu)自重慶奧怡生物技術(shù)有限公司；PBS溶液、青鏈霉素、Opti-MEMTM均購(gòu)自廣西卓一生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自英駿生物技術(shù)有限公司(美國(guó))；SYBR Green qPCR Master Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Genstar公司(北京)。超微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)為CFX96 Touch)、多功能梯度擴(kuò)增PCR儀(型號(hào)為ABIVeriti-TM)、凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)為Uni-versal Hood Ⅱ)均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD有限公司。

1.2 成肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自貴州省安順市西秀區(qū)幺鋪鎮(zhèn)屠宰場(chǎng)，選擇健康的3日齡犢牛，采集犢牛背最長(zhǎng)肌，生理鹽水(0.9% NaCl)沖洗后放入含雙抗的PBS溶液中保存帶回實(shí)驗(yàn)室。成肌細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定參照宋林錦等[20]的操作方法。率先清理筋膜與雜質(zhì)，剪碎肌肉組織后加入Ⅱ型膠原酶，放置37 ℃恒溫?fù)u床消化1 h，加入培養(yǎng)基混勻，依次通過(guò)滅菌紗布、200目和400目細(xì)胞篩，濾液以8 000 r·min-1離心8 min，棄上清液后加入10% DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。利用免疫熒光法鑒定成肌細(xì)胞純度，將細(xì)胞懸液接種在置有玻璃片的24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；細(xì)胞爬片后，加入4%多聚甲醛于4 ℃條件下固定35 min，PBS洗滌3次后置于培養(yǎng)皿支撐物上。吸取60 μL破膜封閉液滴于防水膜上，2 h破膜封閉，取60 μL一抗(α-actin)于防水膜上，蓋上玻片于4 ℃放置；避光孵育二抗(goat anti-rabbit lgG)2 h后，PBS洗滌3次，每次4 min，DAPI染色5 min，PBS洗滌3次，每次4 min。加1滴熒光封片劑于玻片上，將有細(xì)胞的一面蓋上，用于后續(xù)拍照儲(chǔ)存。

1.3 shRNA引物設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的MEF2A基因編碼區(qū)序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001083638.2)與短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)MEF2A基因的shRNA片段引物，共設(shè)置4個(gè)干擾組靶序列和1個(gè)NC組序列，分別命名為shRNA-MEF2A-1、shRNA-MEF2A-2、shRNA-MEF2A-3、shRNA-MEF2A-4與shRNA-NC。于序列兩端添加EcoR Ⅰ與SalⅠ酶切位點(diǎn)，序列中段插入Loop (TCAAGAG)結(jié)構(gòu)，序列最后加上6個(gè)T，可作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成片段引物，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 shRNA信息

1.4 干擾載體構(gòu)建與鑒定

復(fù)蘇空載體質(zhì)粒，利用EcoRⅠ與SalⅠ同時(shí)進(jìn)行酶切，取1.5 μL pGPU6-GFP-Neo、3 μL10×Green Buffer、1.5 μLEcoRⅠ、1.5 μLSalⅠ，加ddH2O補(bǔ)足30 μL，37 ℃條件下酶切2 h，酶切產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收；將shRNA片段連接到pGPU6-GFP-Neo載體，16 ℃金屬浴過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h，將菌液送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 干擾載體轉(zhuǎn)染與檢測(cè)

成肌細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%的融合度時(shí)，利用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將重組載體pGPU6-GFP-Neo-NC、pGPU6-GFP-Neo-MEF2A-1、pGPU6-GFP-Neo-MEF2A-2、pGPU6-GFP-Neo-MEF2A-3、pGPU6-GFP-Neo-MEF2A-4轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞內(nèi)，各孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒2 500 ng，空白組不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，各轉(zhuǎn)染組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。48 h后將細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)狀態(tài)并檢測(cè)MEF2A基因shRNA干擾效率。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板。依據(jù)NCBI中公布的基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)牛肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族基因以及細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因CDK2、BCL2與CCNA2的熒光引物(表2)。qRT-PCR檢測(cè)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子家族基因(MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D)以及BCL2、CDK2與CCNA2基因在最佳干擾組和對(duì)照組中的表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。每個(gè)樣品做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火5 s，95 ℃延伸5 s，共39個(gè)循環(huán)。

表2 引物信息

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將最佳干擾組與對(duì)照組載體分別轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌，加入1 mL 0.25%不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入預(yù)冷的1.5 mL的70%乙醇吹打細(xì)胞，4 ℃儲(chǔ)存過(guò)夜。離心乙醇固定過(guò)的細(xì)胞，棄上清液；PBS洗滌細(xì)胞3次；加入100 μL RNase A重懸細(xì)胞，37 ℃水浴鍋中放置30 min，加入500 μL PI染色液，4 ℃避光反應(yīng)30 min；利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 成肌細(xì)胞活性檢測(cè)

最佳干擾組與對(duì)照組載體分別轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞后，消化計(jì)數(shù)并接種于96孔細(xì)胞板中，各組別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在0、6、12、24、48和72 h時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，各孔添加10 μL的CCK8試劑，放置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，利用酶標(biāo)儀(SynerGyH1, BioTek)檢測(cè)各組別在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.9 關(guān)嶺牛MEF2A基因生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、PSORT II Preadict (https://psort.hgc.jp/form2.html)與STRING(https://string-db.org/)分別對(duì)關(guān)嶺牛MEF2A的蛋白理化特性、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位與蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量，各組別設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(SPSS 25.0)，多重比較采用Duncan’s多重極差檢驗(yàn)法，運(yùn)用Graphpad 6.0作圖。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

如圖1所示，固定細(xì)胞后，α-actin經(jīng)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)為綠色發(fā)光狀態(tài)。細(xì)胞核為橢圓形狀態(tài)，經(jīng)4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后發(fā)藍(lán)色光。細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色重合良好，表明成功培養(yǎng)鑒定關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞，進(jìn)一步鑒定細(xì)胞純度達(dá)到90%左右，可開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 成肌細(xì)胞免疫熒光鑒定(200×)

2.2 干擾載體測(cè)序

將酶切純化回收的pGPU6-GFP-Neo載體與退火后的shRNA置于16 ℃恒溫金屬浴中過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性菌液送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果如圖2所示，插入的重組質(zhì)粒片段與設(shè)計(jì)合成的序列一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果

2.3 干擾載體轉(zhuǎn)染

將成肌細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，將各干擾組與陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察各組別綠色熒光蛋白的發(fā)光情況。結(jié)果如圖3所示，在熒光倒置顯微鏡下的各干擾組、陰性對(duì)照組均有清晰明亮的綠色熒光，其中空白組不發(fā)光，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

A. shRNA-MEF2A-1；B. shRNA-MEF2A-2；C. shRNA-MEF2A-3；D. shRNA-MEF2A-4；E. shRNA-NC；F. 空白對(duì)照

2.4 qRT-PCR檢測(cè)干擾載體效率

將各重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至牛成肌細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測(cè)MEF2A基因在不同組別中的表達(dá)量特性，篩選干擾效果最佳的試驗(yàn)組別。如圖4所示，shRNA-MEF2A-1、shRNA-MEF2A-2與shRNA-MEF2A-3和shRNA-MEF2A-4干擾效率依次為74.45%、58.67%、94.66%與62.98%。結(jié)果表明，4個(gè)干擾載體均能極顯著下調(diào)MEF2A基因表達(dá)量(P<0.01)，選用干擾效率最高的shRNA-MEF2A-3干擾載體開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

*. 表示差異顯著(P<0.05)；**. 表示差異極顯著(P<0.01)，下同

2.5 干擾MEF2A對(duì)成肌細(xì)胞肌生成等相關(guān)基因表達(dá)的影響

分別提取轉(zhuǎn)染shRNA-MEF2A-3最佳干擾組和shRNA-NC對(duì)照組的細(xì)胞總RNA，對(duì)肌生成基因及周期與凋亡相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，干擾MEF2A基因表達(dá)后，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2B、MEF2C與MEF2D基因表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)；細(xì)胞周期因子CDK2表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，CCNA2表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)；抗凋亡因子BCL2表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。推斷MEF2A基因在關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞中作用顯著，與家族其他成員具有相互調(diào)控關(guān)系；干擾MEF2A可延長(zhǎng)關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞周期，對(duì)其增殖具有抑制作用。

圖5 干擾MEF2A對(duì)成肌細(xì)胞基因表達(dá)的影響

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染shRNA-MEF2A-3干擾組和shRNA-NC對(duì)照組的細(xì)胞周期特性。結(jié)果如圖6所示，與shRNA-NC相比，轉(zhuǎn)染shRNA-MEF2A-3的成肌細(xì)胞數(shù)量在G1期顯著增多(P<0.05)，S期與G2/M期細(xì)胞數(shù)量極顯著減少(P<0.01)。研究結(jié)果表明，干擾MEF2A后，細(xì)胞周期G1至S期的進(jìn)程被阻滯，細(xì)胞增殖受到抑制。

A. 干擾組細(xì)胞周期；B. NC組細(xì)胞周期；C. 細(xì)胞周期比例

2.7 關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)

分別在0、6、12、24、48和72 h檢測(cè)shRNA-MEF2A-3干擾組和shRNA-NC對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖特性。CCK8檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，自6 h后，shRNA-MEF2A-3干擾組和shRNA-NC對(duì)照組在5個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。

圖7 干擾MEF2A對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響

2.8 牛MEF2A蛋白理化性質(zhì)分析

在線軟件預(yù)測(cè)MEF2A(No.:NM_001083638.2)基因的mRNA序列為5 568 bp，編碼492個(gè)氨基酸。MEF2A蛋白分子式為C2282H3649N659O737S21，相對(duì)分子質(zhì)量約為52 782.31 u；絲氨酸(13.8%)在氨基酸中組成含量最高，色氨酸(0.4%)組成含量最低；帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)量(精氨酸+賴氨酸)為45個(gè)；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)量(天冬氨酸+谷氨酸)為39個(gè)。亞細(xì)胞定位顯示，MEF2A主要位于細(xì)胞核(60.9%)。STRING預(yù)測(cè)牛MEF2A蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖譜，結(jié)果如圖8所示，包含組蛋白去乙酰化酶(HDAC)家族蛋白成員HDAC4、HDAC5與HDAC7，參與核心組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)N末端部分賴氨酸殘基的去乙酰化[21]；絲裂原蛋白活化激酶(MAPK)家族蛋白成員MAPK11、MAPK14，可通過(guò)激活環(huán)中TGY基序的雙重磷酸化發(fā)揮功效[22]，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與生長(zhǎng)凋亡，在細(xì)胞反應(yīng)級(jí)聯(lián)中起重要作用，以及影響心肌發(fā)育和成肌細(xì)胞分化的MEF2C、EP300、MEF2D、MYOD1、NKX2-5等相關(guān)蛋白。

圖8 牛MEF2A蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析

3 討 論

MEF2本身不具備肌源性活性，當(dāng)與bHLH(basic helix-loop-helix)蛋白家族互作時(shí)，可驅(qū)動(dòng)并放大肌源性分化程序[23]。MEF2蛋白N端具備結(jié)合DNA功能的MADS區(qū)域和中心MEF2結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，該區(qū)域包含大量的核定位序列和磷酸化位點(diǎn)，在MEF2基因家族成員及不同物種間的保守性較低且序列變化多樣，與基因轉(zhuǎn)錄活性關(guān)系密切，可進(jìn)一步調(diào)控MEF2蛋白活性[24-25]。MEF2主要通過(guò)CaMK-HDACs(Ca2+-鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶-組蛋白去乙酰化酶)、Calcineurin(鈣調(diào)磷酸酶)和MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)3種信號(hào)通路發(fā)揮作用[26]。MEF2基因大多通過(guò)MADS-box和MEF2結(jié)構(gòu)域與其他轉(zhuǎn)錄輔因子協(xié)同作用，家族成員與許多參與肌生成的基因相結(jié)合，以啟動(dòng)或加強(qiáng)肌源性基因的表達(dá)[27-28]，通過(guò)控制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞的分裂、分化和凋亡過(guò)程。目前已證實(shí)，牛MEF2A基因被定位于21號(hào)染色體[29]，是一種廣譜表達(dá)基因，在肌肉發(fā)育過(guò)程中，該基因表達(dá)具有發(fā)育時(shí)空性與組織特異性。MEF2A基因的多態(tài)性對(duì)畜禽屠宰性能存在一定的影響，且該基因?yàn)橛绊懶笄萃涝仔誀畹暮蜻x基因之一[30]。Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)敲除MEF2A、MEF2C和MEF2D后，小鼠肌損傷修復(fù)過(guò)程受到顯著抑制，成肌細(xì)胞增殖受到嚴(yán)重阻礙。而本試驗(yàn)在抑制MEF2A基因表達(dá)后，關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞生長(zhǎng)活性下降，細(xì)胞增殖同樣受到嚴(yán)重阻礙。同時(shí)，有研究表明MEF2A、MEF2C表達(dá)水平在蛙類動(dòng)物冬眠期具有重要作用[32]。

MEF2A作為一種較為保守的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于各種組織或器官中，在包括決定細(xì)胞命運(yùn)、遷移和形狀在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。MEF2A是肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和肌再生的重要激活劑，也可參與脂質(zhì)代謝途徑[34]。Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2A下游的MEG3-DIO3 miRNA在牛成肌細(xì)胞可調(diào)節(jié)PP2A信號(hào)；MEF2A-MEG3/DIO3-PP2A軸在肌再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為骨骼肌的發(fā)育機(jī)制研究提供了新的線索。Hennebry等[36]研究報(bào)道，MSTN可通過(guò)調(diào)控MEF2與MyoD基因家族表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼肌纖維類型組成；在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)過(guò)活性形式的MEF2可促進(jìn)慢肌纖維形成，但MEF2的失活會(huì)導(dǎo)致慢肌纖維形成的喪失[37]。Schiaffino與Serrano[38]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較低時(shí)，HDAC、HDAC5、HDAC7與MEF2蛋白N末端的MADS/MEF2結(jié)構(gòu)域相互作用而抑制MEF2的活性；當(dāng)Ca2+濃度升高時(shí)，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合并激活CaMK，其中CaMKIV發(fā)揮磷酸化作用使HDACs失去活性，MEF2從HDACs上脫離，與本研究中預(yù)測(cè)的MEF2A蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜結(jié)果相吻合。此外，有研究表明MEF2A在抗炎癥和治療癲癇等方面有著重要作用[39-41]。

本試驗(yàn)初步分析了關(guān)嶺牛MEF2A基因的蛋白理化性質(zhì)，利用qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑制MEF2A基因表達(dá)后，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2B、MEF2C與MEF2D的表達(dá)量均極顯著高于shRNA-NC對(duì)照組，進(jìn)一步推測(cè)該家族成員具有協(xié)同作用的特性，且MEF2A基因在成肌細(xì)胞中的作用比家族其它成員更加顯著。CDK2作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族中的一員，與細(xì)胞周期蛋白CCNA2相互作用可調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[42]。MEF2A基因被抑制后，相較于shRNA-NC對(duì)照組，成肌細(xì)胞中CDK2與CCNA2基因表達(dá)量皆降低；流式細(xì)胞結(jié)果顯示，G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增多，S期細(xì)胞數(shù)量極顯著減少，表明細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)干擾MEF2A基因可導(dǎo)致細(xì)胞抗凋亡因子BCL2基因表達(dá)量下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染干擾組的成肌細(xì)胞自6 h后的細(xì)胞增殖能力相較于對(duì)照組下降明顯。由此推斷，干擾MEF2A基因?qū)е鲁杉〖?xì)胞周期延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖受到抑制，與Wang等[43]的研究結(jié)果相似。然而，MEF2A影響成肌細(xì)胞的具體分子機(jī)制還需要更進(jìn)一步的探究。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了關(guān)嶺牛MEF2A干擾載體，干擾MEF2A基因明顯抑制關(guān)嶺牛成肌細(xì)胞的增殖。同時(shí)推測(cè)，MEF2A通過(guò)調(diào)控成肌細(xì)胞中肌細(xì)胞增強(qiáng)因子基因和相關(guān)生長(zhǎng)凋亡基因的表達(dá)來(lái)影響肌肉發(fā)育性能，為進(jìn)一步完善MEF2A基因?qū)﹃P(guān)嶺牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響和探究地方優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供了理論參考。