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    豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A與Beclin1相互作用并促進(jìn)病毒增殖

    2023-02-27 14:27:04張成成孫嘉豪王秀玲張小榮吳艷濤
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:復(fù)合物豬瘟載體

    張成成,孫嘉豪,王秀玲,張小榮,吳艷濤

    (揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚(yáng)州 225009)

    豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一種傳染性極強(qiáng)且臨床以高熱、出血和免疫抑制為表征的烈性傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬,其直徑為40~60 nm,基因組大小約為12.5 kb[2]。CSFV編碼產(chǎn)生4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Core、Erns、E1和E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[3]。CSFV NS5A是一種多功能的磷酸化蛋白,包括497個(gè)氨基酸,定位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),具有參與病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號(hào)通路的作用,包括細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)新陳代謝、細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)、血管生成和通透性以及胞內(nèi)蛋白折疊等[4-5]。NS5A與鳥苷酸結(jié)合蛋白1互作抑制GTPase活性,進(jìn)而影響豬瘟病毒的早期復(fù)制[6]。Rab1A作為CSFV組裝所必須的蛋白與NS5A存在協(xié)同作用,促進(jìn)病毒粒子的組裝;缺失則導(dǎo)致CSFV的毒力下降[7]。NS5A在細(xì)胞內(nèi)的分布經(jīng)由Rab18的調(diào)節(jié),其復(fù)合物參與CSFV RNA復(fù)制和病毒粒子組裝[8]。NS5A一方面與熱休克蛋白Hsp27相互作用進(jìn)而負(fù)調(diào)控病毒復(fù)制[9];另一方面與熱休克蛋白HSP70共定位于細(xì)胞質(zhì)中,其N端氨基酸(29~240)與HSP70結(jié)合形成的復(fù)合物促進(jìn)CSFV的復(fù)制[10]。此外,HSP90AB1/HSPCB與NS5A也存在相互作用[11]。GRP78與NS5A相互作用,在激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)中扮演重要角色,促進(jìn)豬瘟病毒的復(fù)制[12]。NS5A能與ARFGAP互作促進(jìn)CSFV復(fù)制,另一方面NS5A誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可經(jīng)由ARFGAP降低[13]。

    研究表明,豬瘟病毒通過激活宿主細(xì)胞自噬促進(jìn)其增殖[14-15]。自噬作為細(xì)胞程序性死亡的一種方式,表現(xiàn)為將宿主細(xì)胞中受損蛋白質(zhì)及損傷、衰老的細(xì)胞器進(jìn)行批量降解,而后循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),參與調(diào)節(jié)代謝平衡、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),促進(jìn)生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育和分化[16-17]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62/SQSTM1及LC3等,在試驗(yàn)中經(jīng)常被用作自噬的標(biāo)記物[18]。這些基因通常介導(dǎo)自噬小體的形成,并與溶酶體結(jié)合[19]。自噬相關(guān)基因按其功能分類可分為誘導(dǎo)自噬,囊泡成核、延伸、形成和再循環(huán)的自噬過程,以及針對(duì)修飾蛋白或受損細(xì)胞器的選擇性自噬降解[20]。Beclin1因其24.4%的氨基酸序列與酵母自噬蛋白Atg6相同,成為第一個(gè)被證實(shí)的正向調(diào)節(jié)自噬的哺乳動(dòng)物基因之一[21]。Beclin1在PI3K激酶ClassⅢ復(fù)合物中扮演核心角色,該復(fù)合物由Vps34、Vps15、Beclin1三個(gè)主要亞基組成,作為自噬起始的復(fù)合物,其在自噬小體的形成中不可或缺[22]。目前已知Beclin1參與調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路,包括PI3K-AKT-mTOR、AMPK、JNK及MAPK等通路[23]。研究表明,Beclin1在宿主感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的慢性肝炎病例中起到抑制病毒增殖作用[24]。在Fu等[25]的研究中,Beclin1等自噬相關(guān)基因表達(dá)增加可通過調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)病毒增殖。經(jīng)研究HCV NS5A通過活化蛋白C激酶1受體受體與III類PI3K復(fù)合物相互作用[26]。

    但Beclin1蛋白在CSFV誘發(fā)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬的過程中是否發(fā)揮作用及其作用機(jī)制,還未見研究報(bào)道。本研究旨在探究宿主蛋白Beclin1在CSFV NS5A激活細(xì)胞自噬反應(yīng)過程中所發(fā)揮的影響。研究結(jié)果表明,Beclin1蛋白促進(jìn)CSFV增殖的機(jī)制是通過與CSFV NS5A的相互作用調(diào)控PI3K/Akt通路來實(shí)現(xiàn),為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 生物材料 豬瘟病毒CSFV Shimen株,豬腎細(xì)胞系(ST)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由本實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)載體pDsRed1-N1購(gòu)自Clontech公司,pcDNATM3.1(+)購(gòu)自Invitrogen公司。

    1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、TMB顯色液、T4 DNA連接酶均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司;HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自LONSERA公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ購(gòu)自NEB公司;超純RNA提取試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒及AxyPrep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒均購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司;Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EasyTaq?DNAPolymerase、瓊脂糖等均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;AceQ qPCR Probe Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DL2000 Marker,DL10000 Marker均購(gòu)自TaKaRa公司;青霉素/鏈霉素/兩性霉素B溶液(無菌)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

    1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,杭州博日科技有限公司;電泳儀、泳凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱,Thermo Fisher Scientific公司;倒置熒光光顯微鏡,Olympus Corporation公司;倒置光學(xué)顯微鏡,Leica儀器有限公司;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌離心管中加入5 mL DMEM培養(yǎng)液備用,從液氮罐中取出凍存的ST細(xì)胞迅速放入37 ℃水浴中溶化至冰水混合狀態(tài),輕輕吹打數(shù)次轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的離心管中,1 000 r·min-1室溫離心2 min,將沉淀轉(zhuǎn)入含有10%FBS的DMEM中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24~48 h,顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,在細(xì)胞呈現(xiàn)單層生長(zhǎng)時(shí)傳代。棄去培養(yǎng)液,PBS緩慢清洗2~3次,加入胰蛋白酶消化2~3 min,當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)大部分脫落后加入血清終止消化,反復(fù)吹打至細(xì)胞成單個(gè),加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的豬源細(xì)胞,在其匯集度在70%左右時(shí)更換DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基;接種1個(gè)moi量的CSFV,吸附1 h后,更換含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基作用6、12、24、36、48 h后收集細(xì)胞。參照江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒的說明書的步驟提取總RNA,提取完成后將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:5×TranScript?RT Buffer 2 μL,TranScript?RT 0.5 μL,RI 0.25 μL,dNTPs 2 μL,6 nt 1 μL,Total mRNA 4.25 μL。反轉(zhuǎn)錄條件:25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的Susscrofa的Beclin1、Vps34、Vps15、ATG14L、UVRAG的基因序列進(jìn)行綜合分析,設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的上、下游引物,送交南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

    表1 PCR引物序列

    將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋為100 ng·μL-1,按照SYBR Green PCR MasterMix操作說明,利用上述合成的熒光定量引物分別對(duì)CSFV感染細(xì)胞中Beclin1、Vps34、Vps15、ATG14L、UVRAGmRNA水平進(jìn)行相對(duì)熒光定量,RT-PCR反應(yīng)體系:2×AceQ?qPCR SYBR GREEN Master Mix 10 μL,cDNA 2 μL,F(xiàn)orward Primer 0.5 μL,Reverse Primer 0.5 μL,dd H2O 補(bǔ)齊至20 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)程序:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min;98 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

    1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 取獲得的ST細(xì)胞的cDNA,使用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增帶有不同酶切位點(diǎn)的Beclin1基因的片段。通過BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ等酶作用進(jìn)行雙酶切后與相應(yīng)載體連接分別克隆至對(duì)應(yīng)載體用于后續(xù)試驗(yàn)。

    1.2.4 Western blot 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白的提取參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書的步驟進(jìn)行:收集CSFV感染6、12、24、36、48 h的ST細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗后,用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,1 000 r·min-1離心2~3 min,棄上清留沉淀備用。將新鮮配制的200 μL RIPA(含2 μL 100×PMSF)裂解液裂解蛋白,冰上裂解10~15 min,將充分裂解的蛋白于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min,讓細(xì)胞碎片沉入EP管底,吸取含有蛋白的上清至新的預(yù)冷的EP管里,抽取適量的上清利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。剩余的上清蛋白液中加入一定量的5×SDS PAGE Loading buffer,金屬浴100 ℃10 min使蛋白質(zhì)變性。依據(jù)所測(cè)目的蛋白大小配制對(duì)應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠,電泳恒壓120 V 90 min,完畢后冰上轉(zhuǎn)印至PVDV膜上,電泳恒流120 mA 90 min,然后采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;TBST緩沖液洗膜2~3次,每次5 min;4 ℃過夜孵育一抗;TBST緩沖液漂洗3次,每次5 min;加入二抗室溫孵育2 h,TBST緩沖液漂洗3次,每次15 min。將清洗干凈的PVDV膜置于ECL發(fā)光成像儀中顯影照相,分析結(jié)果并保存。

    1.2.5 免疫共沉淀 將NS5A-Flag和Beclin1-Myc重組載體共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞,用RIPA(含1% 100×PMSF)裂解液裂解蛋白,冰上裂解10~15 min。根據(jù)Thermo ScientificTMPierceTMc-Myc Tag co-IP說明書,將裂解所獲蛋白液與抗c-Myc或抗Flag瓊脂糖親和凝膠進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。簡(jiǎn)要步驟如下:將200 μL細(xì)胞裂解液與10 μL瓊脂糖漿混合,并使用150 μL TBS(25 mmol·L-1Tris鹽酸,0.15 mol·L-1氯化鈉,pH7.2)稀釋的50 μL陽(yáng)性對(duì)照作為陽(yáng)性對(duì)照,在4 ℃下孵育過夜。免疫沉淀用TBST洗滌3次,并在2×非還原樣品緩沖液中重懸。煮沸5 min后,在樣品中加入2 μL的2-ME,用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

    1.2.6 GST-pulldown 按照GST-Pulldown說明書,IPTG誘導(dǎo)BL21原核表達(dá)pEGX-6p-1-Beclin1和pEGX-6p-1空載體;用預(yù)冷的200 μL TBS重懸菌體,離心后加入200 μL Pulldown裂解液,冰上裂解30 min,離心收集上清;將上清液與GST瓊脂糖珠孵育2 h,離心收集GST-p17-瓊脂糖復(fù)合沉淀物;收集已在真核細(xì)胞中表達(dá)的NS5A-Flag細(xì)胞蛋白,加入適量pulldown裂解液,冰上裂解30 min,離心收集上清(含NS5A-Flag蛋白);將收集的NS5A-Flag上清液和GST-Beclin1瓊脂糖復(fù)合物中孵育過夜;離心棄上清,得到Beclin1-NS5A結(jié)合復(fù)合在此復(fù)合物中加入EB洗液(含谷胱甘肽),離心吸取40 μL上清,加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液,通過Western blot檢測(cè)目的蛋白。

    1.2.7 激光共聚焦顯微鏡方法 將細(xì)胞爬片置于75%乙醇中消毒15 min后放入24孔板中,在24孔板內(nèi)接種ST細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%~90%時(shí),將重組質(zhì)粒Beclin1-Myc和NS5A-Flag共同轉(zhuǎn)染至ST細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,棄去培養(yǎng)基后PBS清洗3次,每次5 min。預(yù)冷的無水甲醛固定15 min,棄掉固定液,PBS清洗3次,每次5 min;5%脫脂奶封閉1 h;吸棄封閉液,孵育一抗(兔抗Myc單抗和鼠抗Flag單抗);孵育二抗(FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG);避光加入DAPI(1∶2 000稀釋)染色15~20 min;利用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果;指甲油封片后滴一滴10%甘油,用激光共聚焦顯微鏡DIPA、FITC、Cy3激發(fā)光激發(fā)熒光,觀察Beclin1與NS5A位置分布。

    2 結(jié) 果

    2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建

    Beclin1基因的PCR擴(kuò)增:收取ST細(xì)胞RNA樣后,加入Trizon后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用EasyTaq?DNAPolymerase酶PCR擴(kuò)增Beclin1全長(zhǎng),取部分產(chǎn)物進(jìn)行電泳;由圖1A所示條帶大小和預(yù)期相符。

    重組質(zhì)粒雙酶切鑒定:將Beclin1全長(zhǎng)產(chǎn)物與pDsRedN1空載體雙酶切后,22 ℃連接1 h并進(jìn)行轉(zhuǎn)化,將菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒后采用對(duì)應(yīng)酶進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行電泳鑒定。結(jié)果見圖1B,條帶大小與預(yù)期一致。

    M1. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Beclin1基因PCR擴(kuò)增;M2.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2.重組載體雙酶切鑒定

    2.2 豬瘟病毒及NS5A蛋白上調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)

    ST細(xì)胞在感染CSFV及轉(zhuǎn)染表達(dá)NS5A蛋白后,于不同時(shí)間點(diǎn)分別收取RNA及蛋白樣品,利用qRT-PCR及Western blot分別檢測(cè)Beclin1轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化,結(jié)果如圖2顯示,CSFV感染及NS5A蛋白均能顯著上調(diào)Beclin1的表達(dá)水平。

    A. qRT-PCR檢測(cè)CSFV增殖量;B. qRT-PCR檢測(cè)CSFV對(duì)Beclin1表達(dá)影響;C. qRT-PCR檢測(cè)NS5A對(duì)Beclin1表達(dá)影響;D. Western blot檢測(cè)CSFV對(duì)Beclin1表達(dá)影響;D. Western blot檢測(cè)NS5A對(duì)Beclin1表達(dá)影響。與對(duì)照組相比,*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

    2.3 Beclin1蛋白對(duì)CSFV增殖影響

    將Beclin1-RedN1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入ST細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)Beclin1蛋白的過表達(dá),同時(shí),設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照;之后感染CSFV,于不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞樣品,結(jié)果如圖3所示,CSFV復(fù)制水平顯著提高。相反,利用si-RNA敲低Beclin1表達(dá)后,CSFV增殖受到顯著抑制。

    A.過表達(dá)Beclin1后qRT-PCR檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平;B.過表達(dá)Beclin1后qRT-PCR檢測(cè)CSFV增殖水平;C.敲低Beclin1后qRT-PCR檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平;D.敲低Beclin1后Western blot檢測(cè)Beclin1表達(dá)水平;E. qRT-PCR檢測(cè)CSFV增殖水平;**.P<0.01;***.P<0.001

    2.4 Beclin1與CSFV NS5A相互作用研究

    進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證Beclin1蛋白是否與NS5A相互作用。將Beclin1-Myc和NS5A-Flag質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞24 h,細(xì)胞裂解液與抗Flag親和凝膠免疫共沉淀。最后,用蛋白印跡法檢測(cè)復(fù)合物中的蛋白。結(jié)果顯示,Beclin1-Myc和NS5A-Flag蛋白相互作用(圖4)。

    用NS5A-Flag和Beclin1-Myc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞48 h后收取蛋白樣。樣品經(jīng)抗Flag的抗體免疫沉淀,然后進(jìn)行免疫印跡分析

    采用GST-pulldown試驗(yàn),進(jìn)一步證實(shí)Beclin1與NS5A之間的相互作用在體外條件下是否成立。重組全長(zhǎng)Beclin1-GST融合蛋白和GST蛋白分別在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá),并將NS5A-Flag轉(zhuǎn)染到ST細(xì)胞中。采用GST-pulldown法檢測(cè)Beclin1與NS5A之間的關(guān)系。如圖所示,在Beclin1-GST復(fù)合物中檢測(cè)到NS5A-Flag(圖5)。該結(jié)果說明Beclin1在體外可以與NS5A相互作用。

    A. GST空載體及Beclin1-GST重組質(zhì)粒原核誘導(dǎo)表達(dá);B. GST-pulldown試驗(yàn)驗(yàn)證蛋白互作

    利用激光共聚焦顯微鏡觀察Beclin1與NS5A在ST細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,在ST細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Beclin1-RedN1和NS5A-GFPC1真核表達(dá)載體。36 h后制備細(xì)胞爬片,利用多聚甲醛固定后試驗(yàn)DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,最后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。如圖所示,在共轉(zhuǎn)染Beclin1-RedN1和NS5A-GFPC1的細(xì)胞(黃色斑點(diǎn))中,NS5A與細(xì)胞Beclin1有明顯的共定位(圖6)。

    用Beclin1-RedN1和NS5A-GFPC1共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置空白載體RedN1與GFPC1作為對(duì)照

    2.5 CSFV對(duì)PI3K/Akt通路相關(guān)因子表達(dá)影響

    收取感染CSFV不同時(shí)間點(diǎn)ST細(xì)胞樣品,利用qRT-PCR方法檢測(cè)PI3K/Akt通路相關(guān)因子VPS34、VPS15、ATG14L與UVRAG等基因表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示,PI3K/Akt通路相關(guān)因子都呈現(xiàn)出不同程度的升高趨勢(shì),其中VPS34表達(dá)變化水平最高。當(dāng)利用siRNA敲低Beclin1表達(dá)水平后,感染CSFV,收取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品,利用qRT-PCR檢測(cè)PI3K/Akt通路相關(guān)因子VPS34、VPS15、ATG14L與UVRAG等基因表達(dá)情況。結(jié)果如圖8所示,VPS34、VPS15、ATG14L與UVRAG基因上調(diào)表達(dá)受到明顯抑制。

    A. qRT-PCR檢測(cè)VPS34表達(dá);B. qRT-PCR檢測(cè)ATG14L表達(dá);C. qRT-PCR檢測(cè)VPS15表達(dá);D. qRT-PCR檢測(cè)UVRAG表達(dá)。*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

    A. qRT-PCR檢測(cè)VPS34表達(dá);B. qRT-PCR檢測(cè)ATG14L表達(dá);C. qRT-PCR檢測(cè)VPS15表達(dá);D. qRT-PCR檢測(cè)UVRAG表達(dá);**.P<0.01;***.P<0.001

    3 討 論

    CSFV感染可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生完全自噬,自噬體的激活有助于病毒的復(fù)制及其病毒顆粒的成熟[14,27]。CSFV通過調(diào)控多種信號(hào)通路來完成感染與復(fù)制。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的眾多病理生理過程中扮演重要角色[28]。當(dāng)前研究證實(shí),與CSFV同屬于黃病毒科的丙型肝炎病毒(HCV)可通過活化PI3K/Akt通路來影響其自身復(fù)制[29]。研究發(fā)現(xiàn),CSFV感染可通過活化PI3K/Akt通路來促進(jìn)CSFV復(fù)制[30]。CSFV NS5A蛋白定位于宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),對(duì)CSFV的生長(zhǎng)和病毒RNA的合成具有重要意義[4]。LC3作為主要的自噬標(biāo)記物常用于評(píng)估自噬溶酶體的形成,其作為PI3K/Akt通路上的自噬相關(guān)蛋白,與CSFV NS5A蛋白存在相互作用并可誘導(dǎo)完全自噬[15]。本文所研究的Beclin1蛋白,在PI3K激酶ClassⅢ(Class Ⅲ phosphatidylinositol 3-Kinase)復(fù)合物中扮演核心角色,該復(fù)合物由Vps34、Vps15、Beclin1三個(gè)主要亞基組成,作為自噬起始的復(fù)合物,在自噬小體的形成中不可或缺[22]。Twu等[31]研究證實(shí),Beclin1敲低細(xì)胞系中,HCV和SARS-CoV-2的復(fù)制減少。PI3K復(fù)合物中的ATG14L的敲低/敲除可抑制HCV復(fù)制[32]。另一研究表明,Beclin1作為VPS34活性調(diào)控的關(guān)鍵因子,兩者的降低均減少HCV復(fù)制[33]。有研究表明,HCV NS5A通過活化蛋白C激酶1(RACK1)受體與Ⅲ類PI3K復(fù)合物相互作用[26]。

    本研究證實(shí),ST細(xì)胞感染CSFV或轉(zhuǎn)染表達(dá)NS5A蛋白后,Beclin1在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上表達(dá)均顯著上升。通過免疫共沉淀及GST-pulldown等試驗(yàn)證實(shí)Beclin1與NS5A存在相互作用。當(dāng)過表達(dá)Beclin1時(shí),CSFV的復(fù)制水平顯著增強(qiáng);作為另一佐證,ST細(xì)胞干擾Beclin1表達(dá)后CSFV復(fù)制量顯著減少。

    此外,F(xiàn)underburk等[34]研究證實(shí)Beclin1及其相關(guān)蛋白VPS34、VPS15、UVRAG結(jié)合,誘導(dǎo)自噬小體的形成。UVRAG的表達(dá)與VPS34酶活性的增加相關(guān),提示Beclin1-UVRAG-VPS34-VPS15復(fù)合物在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮了作用。與此同時(shí),細(xì)胞內(nèi)Atg14L的存在主要依賴于Beclin1蛋白,Beclin1的缺失會(huì)大大降低Atg14L蛋白水平,這對(duì)自噬小體的形成至關(guān)重要[34]。本研究采用RT-PCR初步證實(shí)Beclin1的過表達(dá)及敲低影響VPS34、VPS15、ATG14L及UVRAG等級(jí)聯(lián)因子的表達(dá),結(jié)果呈正相關(guān)。VPS34基因的mRNA表達(dá)在感染后6 h呈現(xiàn)明顯的持續(xù)上升趨勢(shì),差異極其顯著(P<0.001)(圖7);相反,當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV,VPS34基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖8)。VPS15作為自噬早期復(fù)合體的關(guān)鍵調(diào)控因子的另一基因,當(dāng)ST細(xì)胞過表達(dá)Beclin1后感染CSFV,其mRNA表達(dá)水平相較于轉(zhuǎn)染空載體接毒組上調(diào)較為緩慢;VPS15基因的mRNA表達(dá)在感染后12 h呈現(xiàn)明顯的持續(xù)上升趨勢(shì),差異顯著(P<0.05);相反,當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV,VPS15基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)輕度下降趨勢(shì)。ATG14L作為另一自噬早期復(fù)合體結(jié)合蛋白,當(dāng)ST細(xì)胞過表達(dá)Beclin1后感染CSFV,其mRNA表達(dá)水平相較于轉(zhuǎn)染空載體接毒組上調(diào)顯著;ATG14L基因的mRNA表達(dá)在感染后6 h呈現(xiàn)較明顯的持續(xù)上升趨勢(shì)(圖7)。相反,當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV,ATG14L基因的mRNA表達(dá)水平下降趨勢(shì)較明顯(圖8)。UVRAG與Beclin-1/PI3KC3復(fù)合體相關(guān),其能促進(jìn)PI3KC3酶促活性和自噬。當(dāng)ST細(xì)胞過表達(dá)Beclin1后感染CSFV,其mRNA表達(dá)水平相較于轉(zhuǎn)染空載體接毒組上調(diào)趨勢(shì)并不顯著;UVRAG基因的mRNA表達(dá)在感染后24 h呈現(xiàn)較明顯的持續(xù)上升趨勢(shì),差異顯著(P<0.05)(圖7)。相反,當(dāng)ST細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Beclin1后感染CSFV,UVRAG基因的mRNA表達(dá)水平下降趨勢(shì)顯著(圖8)。上述結(jié)果證實(shí),Beclin1等自噬相關(guān)因子通過形成PI3K自噬復(fù)合體促進(jìn)豬瘟病毒復(fù)制。

    綜上所述,本研究證實(shí)Beclin1蛋白可通過活化PI3K/Akt信號(hào)通路并與CSFV NS5A蛋白互作來促進(jìn)CSFV復(fù)制,為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。

    4 結(jié) 論

    本研究證實(shí)了ST細(xì)胞感染CSFV或轉(zhuǎn)染表達(dá)NS5A蛋白后,均可上調(diào)細(xì)胞Beclin1及PI3K/Akt通路相關(guān)因子表達(dá)水平。此外,作者發(fā)現(xiàn)Beclin1蛋白對(duì)CSFV復(fù)制起到明顯促進(jìn)作用;且Beclin1蛋白能夠與CSFV NS5A發(fā)生相互作用。提示作為自噬體的重要起始蛋白Beclin1蛋白,通過調(diào)控PI3K/Akt通路中的相關(guān)蛋白促進(jìn)病毒的增殖。

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