StEFR1正調(diào)控馬鈴薯對晚疫病的抗性

張衛(wèi)娜 余慧芳 安 珍 柳文凱 康益晨 石銘福 楊昕宇 張茹艷 王 勇 秦舒浩

正調(diào)控馬鈴薯對晚疫病的抗性

張衛(wèi)娜 余慧芳 安 珍 柳文凱 康益晨 石銘福 楊昕宇 張茹艷 王 勇 秦舒浩*

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 甘肅蘭州 730070

馬鈴薯晚疫病是毀滅性卵菌病害, 對我國乃至全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。本試驗結(jié)合生物信息學(xué)分析、表達模式和功能驗證, 分析了LRR-RLK家族成員調(diào)控晚疫病抗性的作用和潛在的調(diào)控機制。進化分析表明, StEFR1與擬南芥中功能已知的AtEFR序列相似度為53.9%。接種晚疫病菌3 d和elf18處理3 h, ‘大西洋’離體葉片中的表達分別上調(diào)至對照的1.87倍和2.31倍。瞬時過表達的葉片受到晚疫病菌侵染時抗性增強, 表現(xiàn)在葉片病斑面積較對照減小, 而葉片細胞活性較對照增強。此外, 與野生型相比, 過表達的葉片中3個PTI標記基因、SA和JA信號通路相關(guān)基因差異表達, 且呈不同程度的顯著上調(diào), 而ET信號通路相關(guān)基因的表達量無明顯變化。綜上所述,參與晚疫病菌誘導(dǎo)的PTI抗性, 且調(diào)控SA和JA激素信號相關(guān)基因的表達, 對晚疫病起正調(diào)控作用。本文為深入研究調(diào)控晚疫病免疫反應(yīng)的分子機制奠定了基礎(chǔ), 并為晚疫病分子育種研究提供重要參考。

馬鈴薯晚疫病; LRR-RLK家族; 激素信號; 標記基因; 差異表達

由致病疫霉((Mont.) de Bary)引起的晚疫病是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的重大卵菌病害, 可致莖、葉、塊莖等多個器官發(fā)病[1]。晚疫病被稱作“植物殺手”, 在短短幾周之內(nèi)可使植株大范圍感病, 造成嚴重減產(chǎn)甚至絕收。1847年的“愛爾蘭大饑荒”致100多萬人死亡, 200多萬人逃亡海外[2]。我國馬鈴薯種植面積廣, 產(chǎn)量需求高, 而晚疫病發(fā)病迅速, 危害嚴重。據(jù)統(tǒng)計, 全球每年因晚疫病造成的經(jīng)濟損失為60多億美元, 在我國高達140多億元[3]。生產(chǎn)中將品種選擇、塊莖消毒、合理密植等農(nóng)業(yè)措施和生物菌劑及化學(xué)藥劑的應(yīng)用等防控途徑相結(jié)合,已逐步形成了較為成熟的綜合防控技術(shù)體系[4]。然而, 抗性育種仍是實現(xiàn)該病害綠色防控的根本途徑, 而抗病機理的解析和主效抗病基因的鑒定是加快抗病育種進程的重要保障。

在長期進化過程中, 植物形成了復(fù)雜有序的免疫反應(yīng), 主要包括水平抗性和垂直抗性[5]?；蚪閷?dǎo)的抗性已被廣泛應(yīng)用于小麥和其他作物的育種中。同樣, 研究者從馬鈴薯野生種中也鑒定出大量抗晚疫病的基因(～), 其中, 來源于的、、及均被導(dǎo)入到栽培品種中, 但其產(chǎn)生的抗性很容易被快速進化的生理小種克服, 從而使馬鈴薯晚疫病垂直抗性的利用愈加困難[6-8]。水平抗性無寄主特異性, 主要由位于細胞表面的模式識別受體(pattern recognization receptor, PRR)激發(fā)[9], 類受體激酶(receptor like kinase, RLK)和類受體蛋白(receptor like protein, RLP)是迄今發(fā)現(xiàn)最重要的2類PRRs[10]。PRRs識別的病原菌相關(guān)分子模式(Pathogen/microbe-associated molecular patterns, PAMP/MAMP)是病原菌結(jié)構(gòu)組成相對保守的部分, 其介導(dǎo)的水平抗性被認為更加持久且具廣譜性[11]。

RLKs被稱為植物生命活動的“中央處理器”, 參與調(diào)控細胞幾乎所有的生命活動, 在植物基因組中存在多達500至1000個家族成員, 可分為至少60個亞家族[12]。部分RLKs在植物調(diào)控免疫反應(yīng)過程中的重要作用也被陸續(xù)證實[13-15], 如LysM亞家族成員CERK1和WAK亞家族成員WAK1分別識別幾丁質(zhì)和寡聚半乳糖醛酸信號[16-17], LRR-RLK亞家族成員FLS2、EFR、PEPR能夠分別識別病原細菌鞭毛蛋白(flg22)、細菌PAMP延伸因子(EF-Tu)和擬南芥小分子肽(AtPeps)[18]。其中, 擬南芥編碼的蛋白是富含亮氨酸重復(fù)的受體樣激酶, 分子量約為113 kD[19], 轉(zhuǎn)基因的煙草和番茄通過識別EF-Tu N端高度保守的18個氨基酸多肽elf18, 引起植株中強烈的氧爆發(fā)并誘導(dǎo)病程相關(guān)基因上調(diào)表達,從而提高植物的抗病性[20-21]。

前期工作中, 作者在馬鈴薯全基因組范圍鑒定了RLKs, 發(fā)現(xiàn)LRR-RLK-XII亞家族成員(PGSC0003DMP400001888)在晚疫病侵染前后差異表達較為明顯, 且與擬南芥親緣關(guān)系較近。因此, 本研究擬結(jié)合表達分析、生物信息學(xué)分析和瞬時表達, 對該基因在晚疫病抗性中的作用和調(diào)控機制進行了初步研究, 為晚疫病抗病基因的挖掘和抗性機理的解析提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用植物材料‘大西洋’馬鈴薯由本實驗室種植, 具體條件為溫度22℃, 光照條件為16 h光照和8 h黑暗, 濕度70%。待幼苗長到5～6周時用于瞬時轉(zhuǎn)化和接種。本試驗所用的晚疫病病原菌生理小種HB 09-16-2 (1.2.3.4.5.6.7.9.10.11)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)田振東教授饋贈。

1.2 試驗處理

將晚疫病病原菌(HB 09-16-2)接種于10 cm×10 cm的燕麥固體培養(yǎng)基上, 置于19℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～14 d。接種前用滅菌的ddH2O將孢子洗脫并置于4℃冰箱約2～3 h, 使游動孢子充分釋放, 將孢子濃度調(diào)整為7×104mL–1用于接種試驗。選取長勢良好、大小一致的5～6周的‘大西洋’第2到3片復(fù)葉, 葉片背面主脈左右兩側(cè)分別接種10 μL孢子懸浮液和10 μL ddH2O, 不同時間點采樣用于測定的表達量。此外, 用100 nmol L–1elf18處理葉片, 不同時間點采樣, 用液氮速凍后置于–80℃冰箱, 用于檢測的表達量。

1.3 序列分析

根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(PGSC v4.03, http:// solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)下載StEFR1的蛋白序列并在植物基因組在線網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)進行BLAST, 獲得擬南芥和番茄中與該氨基酸序列同源性相近的蛋白序列。利用ClustalX1.83軟件進行多序列比對, 并用進化分析軟件MEGA5.0 (http://www.megasoftware. net/), 以鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建進化樹, 執(zhí)行參數(shù)為Poission模式(Poission Model)、部分刪除(Partial deletion)和1000次重復(fù)有根樹(Bootstrap replicated 1000)。

根據(jù)StEFR1的蛋白序列利用在線網(wǎng)站SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)分析其結(jié)構(gòu)域。此外, 從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫提取起始密碼子上游2000 bp序列, 利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析啟動子區(qū)域順式作用元件(-element)并進行統(tǒng)計。

1.4 StEFR1-pEGC5941過表達載體構(gòu)建和葉片瞬時表達

根據(jù)的CDS序列, 分別設(shè)計上游(5￠-CTATGAAGTCTTTTAATGTTTTCCTTTGTG-3￠)和下游(5￠-TCTTAAGATAAAGTTT CTTTGACTAATTG-3￠)引物序列并加入酶切位點進行擴增。將擴增獲得的基因片段整合至過表達載體pFGC5941, 經(jīng)雙酶切(I和II)和連接獲得重組質(zhì)粒pFGC5941-, 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101備用。將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株活化后, 利用農(nóng)桿菌滲入法在‘大西洋’葉片右側(cè)瞬時表達, 葉片左側(cè)注射含有空載體pFGC5941的農(nóng)桿菌作為對照。2 d后在葉背主葉脈對應(yīng)的注射部位各接種10 μL洗脫并調(diào)整好孢子濃度(7×104mL–1)的晚疫病菌孢子懸浮液, 于接種第3、4和5天后照相并統(tǒng)計病斑大小。同時, 取注射和接種后不同時間點的葉片, 用于細胞活性檢測和基因表達分析。

1.5 細胞活性檢測

取上述瞬時表達并接種病原菌的葉片, 用臺盼藍染色法測定細胞活性。臺盼藍染液配法如下: 將10 mL甘油、10 mL乳酸與10 mL無菌水混勻, 并加入10 mg臺盼藍粉末和10 g苯酚配置染液。將葉片在煮沸的臺盼藍溶液中煮1 min, 取出用無菌水沖洗放在2.5 g mL–1水合氯醛中脫色并照相。

1.6 基因表達分析

利用RNAout試劑盒(160906-50, Tiandz, 北京)提取馬鈴薯葉片的總RNA, 經(jīng)凝膠電泳和超微量分光光度計質(zhì)量檢測合格后分別采用試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047,TaKaRa, 大連)和SYBR Green ProHS預(yù)混型qPCR試劑盒(AG11718, TaKaRa, 大連)進行cDNA合成和qRT-PCR擴增。采用在線軟件Primer 3.0 (http://primer3.ut.ee/)設(shè)計引物, 以elongation factor 1-α() (GenBank登錄號為AB061263)作為內(nèi)參基因, PTI標記基因(、和)[22-23]、SA信號通路標記基因(、和)、JA信號通路標記基因(和)和ET信號通路標記基因()[24]引物序列如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線, 并采用2–ΔΔCT計算基因的相對表達量[25], 試驗設(shè)置3次獨立重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2010軟件處理原始數(shù)據(jù), 利用-test (< 0.05)分析差異顯著性, 采用軟件OriginPro 8.0進行圖形可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 StEFR1序列特征及進化分析

對PGSC0003DMP400001888進行結(jié)構(gòu)域鑒定發(fā)現(xiàn), 其具有胞外LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和激酶結(jié)構(gòu)域, 具備典型的LRR-RLK結(jié)構(gòu), 為LRR-RLK家族成員(圖1-A)。經(jīng)氨基酸序列檢索及進化分析表明, 該基因?qū)?yīng)蛋白與番茄的7個蛋白(Solyc03g 096190、Solyc04g009040、Solyc07g018190、Solyc10g 085110、Solyc10g085120、Solyc07g018180和Solyc06 g076910)和擬南芥的6個蛋白(AT3G47110、AT5G39390、AT5G20480、AT3G47570、AT3G47580和AT3G47090)聚為同一個進化分支。其中, AT5G20480 (AtEFR)的功能已有相關(guān)研究, 因此把PGSC0003DMP400001888對應(yīng)基因命名為(圖1-B)。將StEFR1與AtEFR進行序列比對發(fā)現(xiàn), 兩者序列相似度為53.9% (圖1-C), 說明StEFR1可能存在其特有的功能。

表1 實時熒光定量PCR引物

2.2 StEFR1響應(yīng)病原菌信號

進一步分析了響應(yīng)晚疫病菌和病原相關(guān)分子模體elf18的表達模式。與對照組相比, 接種晚疫病菌后該基因在‘大西洋’葉片中的表達量顯著上調(diào), 接種后第1、2、3和4天分別上調(diào)至對照的1.92、2.07、1.87和1.50倍, 且第3天時的相對表達量達最大值(圖2-A)。elf18處理也可顯著誘導(dǎo)該基因的表達, 處理1、3和6 h分別上調(diào)至ddH2O對照組的2.40、2.31和1.57倍, 而ddH2O對照組中的相對表達量變化不明顯(圖2-B)。表明該基因響應(yīng)晚疫病菌侵染及elf18信號, 可能在調(diào)控馬鈴薯晚疫病抗性方面存在潛在功能。

2.3 StEFR1上游啟動子區(qū)域存在響應(yīng)逆境信號的順式作用元件(cis-element)

為進一步分析的功能, 預(yù)測了啟動子區(qū)域上游2000 bp的順式調(diào)控元件, 發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域存在參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的-element有2個, 參與脫落酸、干旱脅迫和玉米醇溶蛋白代謝響應(yīng)的-element分別有2個、5個和1個, 暗示在馬鈴薯響應(yīng)防御、激素和脅迫應(yīng)答中存在潛在功能(表2)。

2.4 StEFR1正調(diào)控晚疫病抗性

通過農(nóng)桿菌滲入法在‘大西洋’葉片中瞬時超表達(用OE表示), 于注射后1、2、2.5和3 d檢測的表達情況。通過試驗發(fā)現(xiàn), 瞬時表達2 d時檢測到的相對表達量達到最大, 是注射pFGC5941空載體對照組(用WT表示)的2.93倍(圖3-A), 而注射2.5 d和3 d時目標基因的表達量有所下降。因此, 本試驗在農(nóng)桿菌滲入葉片2 d時, 在注射部位接種洗脫并調(diào)整好濃度的晚疫病菌, 發(fā)現(xiàn)第4天時WT組葉片接種部位發(fā)病癥狀嚴重, 而OE組葉片病變面積明顯較小(圖3-B)。對WT組和OE組葉片的病變面積進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn), 接種晚疫病菌3、4和5 d時, WT病變面積分別為OE組的13.79、9.71和5.17倍(圖3-C)。此外, 臺盼藍染色結(jié)果表明, WT組葉片的注射部位大量細胞被染成藍色,而OE組葉片染成藍色的細胞較少, 說明WT組中大量細胞呈死亡狀態(tài)(圖3-D)。表明, 瞬時超表達可顯著減輕葉片的發(fā)病癥狀并減少死亡細胞的數(shù)量, 增強葉片對晚疫病菌侵染的抵抗性, 即正調(diào)控晚疫病抗性。

圖1 StEFR1結(jié)構(gòu)域鑒定、進化分析和序列比對

A: 對StEFR1進行結(jié)構(gòu)域鑒定發(fā)現(xiàn), 此基因為典型的LRR-RLK家族成員; B: StEFR1與擬南芥中功能已知的AT5G20480(AtEFR)親緣關(guān)系相對較近; C: StEFR1與AtEFR序列相似性為53.9%。

A:is identified as a typical member of LRR-RLK family; B: StEFR1is closely related to AT5G20480 (AtEFR) in, which had known functions; C: the similarity between StEFR1 and AtEFR is 53.9%.

圖2 StEFR1響應(yīng)病原菌信號的表達模式

*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

* and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

表2 StEFR1啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件

(圖3)

A: 第2天時的相對表達量最高; B: 第4天時WT葉片發(fā)病癥狀嚴重; C: WT和OE組葉片的病斑面積; D: WT組大量細胞呈死亡狀態(tài)。WT: 接種空載體pFGC5941對照組; OE: 接種-PFGC5941的處理組。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

A: the relative expression level ofreached the maximum when injected for 2 days; B: the symptoms of WT leaves were more serious on the 4th day; C: the disease spot area in WT and OE; D: a large number of cells in WT group died. WT: the group injected with empty vector pFGC5941; OE: the group injected with-PFGC5941. * and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2.5 StEFR1參與晚疫病菌誘導(dǎo)的PTI抗性反應(yīng)

為進一步分析是否參與PTI抗性反應(yīng), 本試驗對晚疫病菌侵染后WT和OE葉片PTI標記基因的表達模式進行檢測發(fā)現(xiàn), 3個標記基因、和均呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢(圖4)。接種第2天時, OE中和表達水平顯著上調(diào), 分別為WT的1.82倍和1.61倍; 而的表達水平在接種第2天時達到最高, 為WT的3.03倍, 第3天和第4天時,的相對表達量分別為WT的1.81倍和1.75倍。表明參與了晚疫病菌誘導(dǎo)的PTI抗性反應(yīng)。

2.6 StEFR1調(diào)控SA和JA信號通路相關(guān)基因的表達

水楊酸(salicylic acid, SA)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑在活體寄生菌感染后被激活, 而茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯(ethylene, ET)信號通路是植物被死體營養(yǎng)型病原體攻擊后誘導(dǎo)的另一種獨特的防御途徑[26]。那么半活體寄生卵菌晚疫病菌侵染馬鈴薯后會激活哪條信號通路？本試驗檢測了WT和OE組葉片接種晚疫病菌后SA、JA和ET激素相關(guān)基因的表達模式。由圖5可知, 接種1～2 d時, OE組中SA(、和)信號通路相關(guān)基因的表達顯著增強。特別地, 接種第2天時, 上述3個基因在OE組中的相對表達量分別為WT組的4.06、12.42和2.45倍, 且呈顯著水平; 而在第3至第4天時, 上述3個基因的相對表達量有所下降, 但均高于WT組。JA信號通路的相關(guān)基因在接種晚疫病菌第2天時顯著上調(diào)(<0.01), 而和在接種第3天時達到最高水平, 分別為WT組的1.74倍和1.93倍。在整個接種過程中, WT和OE組中ET信號通路相關(guān)基因無明顯差異。綜上,可能通過調(diào)控SA和JA信號通路相關(guān)基因的表達, 影響馬鈴薯對晚疫病的抗性調(diào)控過程。

圖4 接種晚疫病菌后WT和OE葉片中PTI 標記基因(WRKY7、WRKY8和ACRE31)的表達模式

WT: 接種空載體pFGC5941對照組; OE: 接種-PFGC5941的處理組。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

WT: the group injected with empty vector pFGC5941; OE: the group injected with-PFGC5941. * and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

圖5 接種晚疫病菌后WT和OE葉片中SA (ChtA、PR-1B和PR-2)、JA (LOX和PAL-2)和ET (ERF3)信號通路相關(guān)基因的表達模式

WT代表接種空載體pFGC5941對照組; OE代表接種-PFGC5941的處理組。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

WT: the group injected with empty vector pFGC5941; OE: the group injected with-PFGC5941. * and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

3 討論

結(jié)合生物信息學(xué)和進化分析, PGSC0003DMP 400001888被鑒定為典型的LRR-RLK亞家族成員, 且與擬南芥中功能已知的親緣關(guān)系較近, 因此, 命名為。本試驗分析了調(diào)控晚疫病抗性中的作用和潛在的調(diào)控機制。

EFR是擬南芥中可以識別細菌PAMP延伸因子(EF-TU)的模式識別受體[27],對elf18的響應(yīng)在多種植物中已有報道, 如煙草、水稻、番茄、小麥等[19-21,28]。擬南芥中, elf18預(yù)處理能夠引起強烈的氧爆發(fā)和乙烯的生成, 從而增強擬南芥對丁香假單胞菌(pv.DC 3000)的抗性[27]。水稻病原細菌的elf18可以被轉(zhuǎn)基因水稻懸浮細胞識別并引起氧爆發(fā)、激活絲裂原活化蛋白激酶活性和病程相關(guān)基因的表達, 從而增強水稻對病原細菌的抗性, 而野生型水稻不能識別病原細菌的elf18[29]。而本試驗對離體葉片分別接種晚疫病菌和注射elf18發(fā)現(xiàn), 隨著時間延長, 葉片中的表達顯著上調(diào), 說明該基因能夠響應(yīng)病原菌信號, 可能參與調(diào)控馬鈴薯晚疫病的抗性。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達是一種快速分析基因功能的方法, 本試驗借助此方法使在‘大西洋’離體葉片超量表達。當基因表達量達最高水平時接種晚疫病菌, 發(fā)現(xiàn)在WT組葉片背面出現(xiàn)霉層并有白色霉狀物出現(xiàn), 為晚疫病的典型癥狀, 但OE超表達葉片發(fā)病癥狀明顯減輕并且病變面積顯著減小。此外, 臺盼藍染色后WT組葉片上死亡細胞數(shù)量顯著較OE組葉片多。以上結(jié)果表明,在馬鈴薯葉片中的超量表達, 可以增強葉片對晚疫病菌的抵抗性, 即正調(diào)控晚疫病抗性。類似的結(jié)果在小麥中已被報道, 當轉(zhuǎn)入小麥后, 葉片的病變直徑和病原細菌在葉片中的增殖數(shù)量減小[30]。

植物在與病原微生物長期的對抗過程中, 自身形成了復(fù)雜的免疫反應(yīng)機制。在侵染初期, 植物通過模式識別受體PRRs識別病原菌相關(guān)分子模式, 激發(fā)PTI免疫反應(yīng), 其典型反應(yīng)之一是引起病程相關(guān)基因表達上調(diào), 從而抑制侵入植物的病原菌的生長、繁殖和擴散[10,31]。PRRs多分布于細胞膜, 主要由類受體激酶(receptor like kinase, RLK)或類受體蛋白(receptor like protein, RLP)組成, 其激發(fā)的PTI為基礎(chǔ)免疫反應(yīng), 能提供廣譜、持久抗性[9]。在RLK中, LRR-RLK家族成員數(shù)量龐大, 已有大量成員被確定為PRRs, 且參與植物和病原菌的互作方面的重要作用已被證實[31-33]。為典型的LRR-RLK, 當葉片接種晚疫病菌1～3 d時,的表達量顯著上調(diào), 說明此基因參與植物和病原菌的互作。超表達的馬鈴薯葉片(OE)受到晚疫病菌侵染時, PTI標記基因、和相對表達量顯著上調(diào), 特別是OE中和的表達水平在接種晚疫病菌第3天時達最高值, 而ACRE31的表達水平在接種第2天時達到最高, 為WT的3.03倍。PTI標記基因在不同物種和不同誘導(dǎo)物處理時, 響應(yīng)時間各不相同。如馬鈴薯和本氏煙受細菌PAMP flg22誘導(dǎo)后,、和分別在1 h和3 h達最高表達, 而受幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后, 3個PTI標記基因的表達在3 h達到最高值[22-23,34], 但馬鈴薯用Pep-13處理后, 3個PTI標記基因的表達1 h最大, 而本氏煙中則在0.5 h最高[35]。

啟動子要正確調(diào)控基因的表達水平和表達模式, 需要核心啟動子以及上下游的順式作用元件協(xié)同作用。預(yù)測目的基因啟動子區(qū)域上游順式作用元件對了解目的基因在植物發(fā)育和抗逆的作用具有重要的指導(dǎo)意義。啟動子區(qū)域存在響應(yīng)激素、干旱、防御與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)等多個-elements, 推測可能通過響應(yīng)不同的激素信號參與對晚疫病菌抗性的調(diào)控。馬鈴薯感染瘡痂病鏈霉菌時, SA相關(guān)的基因(、和)和JA相關(guān)的基因()顯著上調(diào), 而ET相關(guān)基因()則下調(diào)[24]。本試驗中, 當葉片受到晚疫病菌侵染時, OE組SA途徑相關(guān)基因(、和)和JA途徑相關(guān)的基因(和)表達水平均顯著上調(diào), 而ET途徑相關(guān)基因的表達變化不顯著, 推斷OE葉片增強對晚疫病菌的抗性, 主要是通過激活SA和JA途徑相關(guān)的抗病代謝過程而實現(xiàn)的, 此過程與ET途徑相關(guān)性不大。而高抗晚疫病基因型JAM1-4 ()對致病疫霉超級毒力小種2013-18-306的免疫應(yīng)答中發(fā)現(xiàn), SA-JA-ET組成的多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑協(xié)調(diào)調(diào)控植物的免疫抗性[36], 這與我們的試驗結(jié)果略有不同。

通過以上試驗初步斷定, 當晚疫病菌侵染馬鈴薯葉片時, 產(chǎn)生的分泌蛋白被位于細胞膜上的PRR-識別, 隨后激活下游的SA和JA激素信號通路來調(diào)控馬鈴薯對晚疫病菌的PTI抗性, 但具體分子機制還有待后續(xù)深入。

4 結(jié)論

本研究基于前期工作, 篩選并鑒定獲得一個PRR-, 通過試驗證明響應(yīng)病原菌信號; 當受到晚疫病菌侵染時,過表達葉片中PTI marker基因、SA和JA途徑相關(guān)基因的表達增強, 且病斑面積減小而細胞活性增加, 表明參與晚疫病菌誘導(dǎo)的PTI抗性, 且調(diào)控SA和JA激素信號相關(guān)基因的表達, 對晚疫病起正調(diào)控作用。

[1] Lal M, Arora R K, Maheshwari U, Rawal S, Yadav S. Impact of late blight occurrence on potato productivity during 2013–14., 2016, 12: 187–192.

[2] Lindqvist-Kreuze H, Gastelo M, Perez W, Forbes G A, Koeyer D, Bonierbale M. Phenotypic stability and genome-wide association study of late blight resistance in potato genotypes adapted to the tropical highlands., 2014, 104: 624–633.

[3] Haverkort A J, Boonekamp P M, Hutten R, Jacobsen E, Lotz L A P, Kessel G J T, Visser R G F, Vossen E A G. Societal costs of late blight in potato and prospects of durable resistance through cisgenic modification., 2008, 51: 47–57.

[4] 徐進, 朱杰華, 楊艷麗, 湯浩, 呂和平, 樊明壽, 石瑛, 董道峰,王貴江, 王萬興, 熊興耀, 高玉林. 中國馬鈴薯病蟲害發(fā)生情況與農(nóng)藥使用現(xiàn)狀. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52: 2800–2808.

Xu J, Zhu J H, Yang Y L, Tang H, Lyu H P, Fan M S, Shi Y, Dong D F, Wang G J, Wang W X, Xiong X Y, Gao Y L. Status of major diseases and insect pests of potato and pesticide usage in China., 2019, 52: 2800–2808 (in Chinese with English abstract).

[5] Jones J D G, Dangl J L. The plant immune system., 2006, 444: 323–329.

[6] Park T H, Vleeshouwers V G A A, Jacobsen E, Van Der Vossen E, Visser R G F. Molecular breeding for resistance to(Mont.) de Bary in potato (L.): a perspective of cisgenesis., 2009, 128: 109–117.

[7] Bradshaw J E, Bryan G J, Lees A K, McLean K, Solomon- Blackburn R M. Mapping the R10 and R11 genes for resistance to late blight () present in the potato ()-gene differentials of black., 2006, 112: 744–751.

[8] Rodewald J, Trognitz B. Solanum resistance genes againstand their corresponding avirulence genes., 2013, 14: 740–757.

[9] Bigeard J, Colcombet J, Hirt H. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI)., 2015, 8: 521–539.

[10] Couto D, Zipfel C. Regulation of pattern recognition receptor signaling in plants., 2016, 16: 537–552.

[11] Zipfel C, Robatzek S. Pathogen-associated molecular pattern- triggered immunity: veni, vidi...?, 2010, 154: 551–554.

[12] Dievart A, Gottin C, Périn C, Ranwez V, Chantret N. Origin and diversity of plant receptor-like kinases., 2020, 71: 131–156.

[13] Angela C G, Wilkinson R C, Selena G I, Kim F, Coffey M D, Cyril Z, Rathjen J P, Sophien K, Sebastian S, Yang C H. The receptor-like kinase SERK3/BAK1 is required for basal resistance against the late blight pathogenin., 2011, 6: e16608.

[14] Montesano M, K?iv V, M?e A, Palva E T. Novel receptor-like protein kinases induced byand short oligogalacturonides in potato., 2010, 2: 339–346.

[15] Wu T, Tian Z D, Liu J, Xie C H. A novel leucine-rich repeat receptor-like kinase gene in potato, StLRPK1, is involved in response to diverse stresses., 2009, 36: 2365–2374.

[16] Erwig J, Ghareeb H, Kopischke M, Hacke R, Matei A, Petutschnig E, Lipka V. Chitin-induced and CHITIN ELICITOR RECEPTOR KINASE1 (CERK1) phosphorylation-dependent endocytosis ofLYSIN MOTIF-CONTAINING RECEPTOR- LIKE KINASE5 (LYK5)., 2017, 215: 382–396.

[17] Lee W S, Rudd J J, Hammond-Kosack K E, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola LysM effector-mediated stealth pathogenesis subverts recognition through both CERK1 and CEBiP homologues in wheat., 2014, 27: 236–243.

[18] Chinchilla D, Zipfel C, Robatzek S, Kemmerling B, Nuernberger T, Jones J D G, Felix G, Boller T. A flagellin-induced complex of the receptor FLS2 and BAK1 initiates plant defence., 2007, 448: 497–500.

[19] Boller T, Felix G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors., 2009, 60: 379–406.

[20] Lacombe S, Rougon-Cardoso A, Sherwood E, Peeters N, Dahlbeck D, van Esse H P, Smoker M, Rallapalli G, Thomma B P H J, Staskawicz B. Interfamily transfer of a plant pattern-recognition receptor confers broad spectrum bacterial resistance., 2010, 28: 365–369.

[21] Schwessinger B, Bahar O, Thomas N, Holton N, Nekrasov V, Ruan D, Canlas P E, Daudi A, Petzold C J, Singan V R, Kuo R. Transgenic expression of the dicotyledonous pattern recognition receptor EFR in rice leads to ligand-dependent activation of defense responses., 2015, 11: e1004809.

[22] Turnbull D, Yang L, Naqvi S, Breen S, Welsh L, Stephens J, Morris J, Boevink P C, Hedley P E, Zhan J l, Birch Paul R J, Gilroy E. RXLR effector AVR2 up-regulates a brassinosteroid responsive bHLH transcription factor to suppress immunity., 2017, 174: 356–369.

[23] He Q, McLellan H, Boevink P C, Sadanandom A, Xie C, Birch P R J, Tian Z. U-box E3 ubiquitin ligase PUB17 acts in the nucleus to promote specific immune pathways triggered by., 2015, 66: 3189–3199.

[24] Arseneault T, Pieterse C, Gérin-Ouellet M, Goyer C, Filion M. Long-term induction of defense gene expression in potato bysp. LBUM223 and., 2014, 104: 926–932.

[25] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(?Delta Delta C(T)) method., 2001, 25: 402–408.

[26] Zhang L, Zhang F, Melotto M, Yao J, He S Y. Jasmonate signaling and manipulation by pathogens and insects., 2017, 68: 1371–1385.

[27] Zipfel C, Kunze G, Chinchilla D, Caniard A, Jones J D, Boller T, Felix G. Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts Agrobacterium-mediated transformation., 2006, 125: 749–760.

[28] Lloyd S R, Schoonbeek H-J, Trick M, Zipfel C, Ridout C J. Methods to study PAMP-triggered immunity inspecies., 2014, 27: 286–295.

[29] 路粉. 水稻中表達擬南芥及水稻內(nèi)源受體對細菌延伸因子EF-Tu識別的研究. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 北京, 2015.

Lu F. Studies on Recognition of Bacterial Elongation Factor EF-Tu byand Endogenous Receptor in. PhD Dissertation of China Agricultural University, Beijing, China, 2015 (in Chinese with English abstract).

[30] Schoonbeek H, Wang H H, Stefanato F L, Craze M, Bowden S, Wallington E, Zipfel C, Ridout C J.EF-Tu receptor enhances bacterial disease resistance in transgenic wheat., 2015, 206: 606–613.

[31] Macho A P, Zipfel C. Plant PRRs and the activation of innate immune signaling., 2014, 54: 263–372.

[32] Greeff C, Roux M, Mundy J, Petersen M. Receptor-like kinase complexes in plant innate immunity., 2012, 3: 209.

[33] Liu P L, Du L, Huang Y, Gao S M, Yu M. Origin and diversification of leucine-rich repeat receptor-like protein kinase (LRR-RLK) genes in plants., 2017, 17: 47.

[34] McLellan H, Boevink P C, Armstrong M R, Pritchard L, Gomez S, Morales J, Whisson S C, Beynon J L, Birch P R J. An RxLR effector fromprevents relocalisation of two plant NAC transcription factors from the endoplasmic reticulum to the nucleus., 2013, 9: e1003670.

[35] 王海霞. 類受體激酶StLRPK1、StSERK3A/BAK和磷酸酶StBSLs在馬鈴薯晚疫病抗性免疫應(yīng)答中的作用. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 湖北武漢, 2018.

Wang H X. Investigation of Receptor Kinase StLRPK1, StSERK3A/BAK1 and Phosphotase StBSLs Functions in Potato Immunity Against Late Blight. PhD Dissertation of Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China, 2018 (in Chinese with English abstract).

[36] 鄭佳儀. 馬鈴薯高抗晚疫病資源篩選與抗病相關(guān)基因挖掘. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文, 北京, 2020.

Zheng J Y. Identification of High Resistance Potato Resource to Late Blight and Mining of Resistance Related Genes. MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2020 (in Chinese with English abstract).

regulates late blight resistance positively in potato ()

ZHANG Wei-Na, YU Hui-Fang, AN Zhen, LIU Wen-Kai, KANG Yi-Chen, SHI Ming-Fu, YANG Xin-Yu, ZHANG Ru-Yang, WANG Yong, and QIN Shu-Hao*

College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

Potato late blight is a devastating oomycete disease, which causes great economic losses to agricultural production. In this study, we analyzed the role and potential regulatory mechanism ofin regulating late blight resistance by the relative expression pattern and functional verification combined with the bioinformatics methods. Evolutionary analysis showed that the sequence similarity between StEFR1 and AtEFR was 53.9%. After inoculated withfor 3 days and treatment with elf18 for 3 hours, the relative expression level ofin isolated leaves ofwas upregulated to 1.87 times and 2.31 times compared with the control, respectively. The late blight resistance significantly increased after the overexpression ofin the isolated leaves ofbyinfiltration method.Compared with the control, the area of leaf lesion size decreased and the activity of leaf cells increased. And the marker genes of PTI, SA, and JA signaling pathways in overexpressed leaves were significantly up-regulated to varied degrees, while the relative expression levels of ET related-genes did not change significantly. In conclusion,was involved in the PTI resistance and regulated the relative expression levels of SA and JA hormone signaling related genes, suggesting thatpositively regulated the potato late blight. This study lays a foundation for further revealing the molecular mechanism ofin regulating the immune response and provides important reference for the molecular breeding of late blight.

potato late blight; LRR-RLKs; hormonal signal; marker gene; differential expression

10.3724/SP.J.1006.2023.24062

本研究由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(公招博士科研啟動基金項目) (GAU-KYQD-2020-10), 甘肅省自然科學(xué)基金項目(21JR7RA827)和國家自然科學(xué)基金項目(32060441)資助。

This study was supported by the Science and Technology Innovation Fund of Gansu Agricultural University (Doctoral Research Start-up Fund Project for Public Recruitment) (GAU-KYQD-2020-10), the Natural Science Foundation of Gansu Province (21JR7RA827), and the National Natural Science Foundation of China (32060441).

秦舒浩, E-mail: qinsh@gsau.edu.cn

E-mail: zhangwn@gsau.edu.cn

2022-03-21;

2022-07-21;

2022-08-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220822.1504.002.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).